Calprotectin ILJA TREBICHAVSKÝ 1, ILJA STŘÍŽ 2 1 Sektor imunologie a gnotobiologie, Mikrobiologický ústav AVČR, Nový Hrádek 2 Imunologické pracoviště, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha SOUHRN Kalprotektin je antimikrobiální protein s vysokou afinitou k zinku. Je produkován neutrofilními granulocyty, monocyty/makrofágy a některými epitely. Jako adhezin se účastní přestupu leukocytů z cirkulace do míst zánětu. Po aktivaci neutrofilů a adhezi monocytů k endotelu je uvolňován, působí bakteriostaticky a ovlivňuje lokální cytokinovou odpověď. ELISA kalprotektinu ve stolici byla využita v gastroenterologii pro neinvazivní diagnostiku patologických procesů ve sliznici. Úloha kalprotektinu v alergických onemocněních musí být teprve osvětlena. Klíčová slova: kalprotektin, MRP8/14, zánět SUMMARY Calprotectin is a zinc-binding antimicrobial protein of neutrophils, monocytes/macrophages and some epithelia. It is involved in recruitment of leucocytes to inflammation site by adhesive interactions with endothelium. Upon neutrophil activation or monocyte adhesion to the endothelium, calprotectin is released and may provide not only bacteriostatic but, also, cytokine-like effects in the local environment. The clinical usefulness of calprotectin has been shown especially in gastroenterology, where determination of the protein in feces is a non-invasive parameter reflecting pathological processes going on in the mucosa. The role of calprotectin in allergic diseases has yet to be assessed. Key words: calprotectin, MRP8/14, inflammation Úvod Antimikrobiální peptid kalprotektin (synonyma: L1 antigen, L1L/L1H, calgranulin A/B, S100A8/S100A9, 27E10 antigen, MRP8/14 macrophage inhibitory factor-related protein) byl popsán již před dvaceti lety jako L1 antigen, hlavní antigenní složka cytoplazmy neutrofilních granulocytů (Dale a spol. 1983). Představuje 30 60% cytoplazmatického proteinu (Hessian a spol. 1993). Kalprotektin je 24 kd heterodimer složený z lehkého a těžkého řetězce (Bhardwaj a spol. 1992), členů rodiny S-100 proteinů vázajících vápník (Kligman a Hilt, 1988). V této rodině je kalprotektin významným vazebným proteinem zinku.
V lidském organismu a u dalších savců se kalprotektin nalézá především v cytoplazmě neutrofilů, jimiž je vylučován anebo se z nich uvolňuje po jejich smrti do purulentního exudátu (Voganatsi a spol. 2001). Nalézá se také v epitelech (kůže, sliznice), endotelu mikrovaskulatury a ledvinových kanálcích. V aktivovaných makrofázích je kalprotektin přítomen v cytoplazmě i na buněčné membráně (Brandtzaeg a spol. 1987). Volný kalprotektin se vyskytuje v plazmě (< 2mg/L), moči, potu a dalších exkretech, ve střevní tekutině a ve stolici. Úloha kalprotektinu v organismu Úloha kalprotektinu není ještě zdaleka objasněna, ale již počátkem devadesátých let minulého století popsala laboratoř Pera Brandtzaega antibakteriální a antimykotické vlastnosti tohoto peptidu (Steinbakk a spol. 1990). Je zřejmé, že buňky, které obsahují kalprotektin, jsou daleko rezistentnější proti infekci než buňky, které jej neexprimují, a to včetně nitrobuněčných parazitů jako je Salmonella (Nisapakultorn a spol. 2001). Antimikrobiální aktivita kalprotektinu podobně jako jeho schopnost indukovat apoptózu je dána jeho schopností vychytávat zinek (Clohessy and Golden 1995, Loomans a spol. 1998). Na zinku jsou závislé take mnohé důležité enzymy jako MMP (matrixové metaloproteázy), které mají velký význam v zánětu a při tvorbě dalších antimikrobiálních peptidů defensinů a cathelicidinů (matrilysin, MMP-7). Afinita těchto enzymů k zinku je však vyšší než afinita kalprotektinu (Isaksen a Fagerhol, 2001). Bylo zjištěno, že kalprotektin je spolehlivým znakem zánětu (Sander a spol. 1984) a vykazuje chemotaxi při interakci s endotelem (Srikrishna a spol. 2001). Membránový kalprotektin lze považovat za adhezin, který usnadňuje vazbu monocytů ke kolagenu a fibronektinu. Interakce s aktivovaným endotelem vede k jeho uvolnění, což vysvětluje vysoké koncentrace solubilního kalprotektinu u akutních i chronických zánětových stavů. Tento uvolněný kalprotektin se dále zapojuje do zánětových mechanismů, protože zvyšuje expresi CD11b (alfa řetězce integrinu a receptoru pro komplement na fagocytech) a zapojuje se do migrace leukocytů z krevního řečiště do tkání. Dysregulace kalprotektinu V roce 1997 popsali Sampson a spolupracovníci vrozenou vadu metabolismu zinku a kalprotektinu u dítěte, jehož matka měla podobnou poruchu. Od té doby byly popsány další případy hyperzinkémie (77 200 mmol/l proti normální plazmatické koncentraci zinku 11 18 mmol/l) spojené s hyperkalproteinémií (1,4 6,5 g/l proti normální plazmatické koncentraci kalprotektinu 1mg/L) a s paradoxními symptomy deficience zinku poruchami růstu, vyrážkami, anémií, leukopenií, hepatosplenomegálií a zhoršenými imunitními funkcemi. Zdá se, že se jedná o nový syndrom dysregulace metabolismu kalprotektinu. Plazmatický kalprotektin znak zánětu Koncentrace plazmatického kalprotektinu jsou spolehlivým znakem průběhu revmatoidní artritidy a ukazují stav zánětu kloubů, avšak pro další průběh nemoci nejsou prediktivní (Madland a spol. 2002). Kalprotektin je cenným markrem časného plicního zánětu (Stockley a spol. 1984) a pro rozlišení bakteriálních a virových infekcí je zcela srovnatelný s CRP. U septických stavů, meningitidy a pneumonie jsou jeho plazmatické hodnoty 40 až 130krát vyšší než normální koncentrace (Sander a spol. 1984). Pacienti s aktivní tuberkulózou mají také vyšší plazmatické koncentrace kalprotektinu.
Koncentrace sérového kalprotektinu se zvyšují i u bakteriálních infekcí ledvin a u příjemců ledviny a srdce v průběhu akutního odhojení aloštěpu (Stříž a spol. 2001a). Kalprotektin je znakem komplikací při transplantaci orgánů, a to zejména v kombinaci s prokalcitoninem, kdy je vysoce specifický pro systémové bakteriální infekce (Jarešová a spol. 1999). Kalprotektin u alergických onemocnění Hodnoty kalprotektinu poskytují cenné informace o bakteriální infekci a probíhajícím zánětu. Vztah tohoto antimikrobiálního peptidu k alergickým onemocněním není v současné době ještě prozkoumán. U atopické dermatitidy byl nalezen kalprotektin ve všech biopsiích v epitelu podobně jako ve vzorcích lupusu, lichen planus a dermatitis herpetiformis, zatímco v normální zdravé kůži byl vázán pouze na komplexy mazových žlázek a chlupů (Gabrielsen a spol. 1986). Hodnoty fekálního kalprotektinu nepomáhají v rozlišení potravinové alergie a intolerance (Arslan a spol. 2002). Buněčný kalprotektin Exprese kalprotektinu na buněčné membráně poskytuje další infomace o lokálním průběhu zánětu nebo infekce. V plicích je membránový kalprotektin znakem monocytů, které tam vycestovaly z krevního řečiště, neboť je přítomen na 84 % krevních mononukleárů, ale jen na 10 % alveolárních makrofágů zdravých lidí (Stříž a spol. 2001b). Makrofágy s expresí kalprotektinu byly nalezeny u ANCA-pozitivní renální vaskulitidy, urtikarie, kontaktní dermatitidy a melanomu. Kalprotektin je konstitutivně produkován keratinocyty gingivy. Lokální koncentrace kalprotektinu v ústní dutině se zvyšuje při infekcích (např. ve slinách se jeho koncentrace zvýší při kandidóze). Vysoké koncentrace v sulkové tekutině (vyplňující prostor úponu gingivy k zubům) a v gingivální tkáni jsou nalézány u parodontózy. Fekální kalprotektin ELISA test na fekální kalprotektin je neinvazivním a jednoduchým vyšetřením (vzorek stolice o váze 1 2 g může být zaslán poštou, protože kalprotektin ve stolici je neobyčejně stabilní). Test je vysoce citlivý a specifický pro gastrointestinální nádorová onemocnění a IBD (inflammatory bowel disease). Koncentrace kalprotektinu ve stolici odrážejí aktivitu nemoci u IBD a mohou být použity pro sledování odpovědi na terapii a pro detekci relapsů (Fagerhol 2000, Aadland a Fagerhol 2002). Onemocnění horní části trávicího traktu ukazují jen malé změny, zatímco průměrné hodnoty fekálního kalprotektinu významně vzrostou u nádorů a IBD (viz níže). Průměrné koncentrace kalprotektinu ve stolici (mg/l) u onemocnění trávicího traktu stanovené Nycotest Phi Cal ELISA testem (Nycomed, Oslo, Norsko) (podle Summertona a spol. 2002). zdraví jedinci 4,5 kolorektální polypy 4 adenom 4 gastritis/duodenitis 5 Barrettův jícen 7 žaludeční vřed 7 karcinom jícnu/žaludku < 30 Crohnova choroba 31
kolorektální karcinom 53 ulcerativní colitis 116 Citlivostí a dynamikou změn koncentrace předčí kalprotektin stanovený metodou ELISA i některé klasické markry zánětu jako CRP. Je však nutné být velmi opatrný při hodnocení sérových koncentrací u neutropenických pacientů, kde jsou výsledky často falešně negativní. V těchto případech musí údaje sledovat časovou dynamiku, a to v kombinaci s dalšími markry zánětu. Ani toto omezení však nesnižuje význam tohoto markru pro odhalení infekce v organismu. Tato práce byla finančně podpořena grantem 524/01/0917 GAČR a grantem 6843-3 IGA MZdČR. RNDr. Ilja Trebichavský, CSc. Sektor imunologie a gnotobiologie Mikrobiologický ústav AVČR 549 22 Nový Hrádek LITERATURA 1. Aadland E, Fagerhol MK. Faecal calprotectin: a marker of inflammation throughout the intestinal tract. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002; 14: 823-825. 2. Arslan G, Odegaard S, Elsayed S, Florvaag E, Berstad A. Food allergy and intolerance: response to intestinal provocation monitored by endosonography. Eur J Ultrasound 2002; 15: 29-36. 3. Bhardwaj RS, Zotz C, Zwadlo-Klarwasser G, Roth J, Goebeler M, Mahnke K, Falk M, Meinardus-Hager G, Sorg C. The calcium-binding proteins MRP8 and MRP14 form a membraneassociated heterodimer in a subset of monocytes/macrophages present in acute but absent in chronic inflammatory lesions. Eur J Immunol 1992; 22: 1891-7. 4. Brandtzaeg P, Dale I, Fagerhol MK. Distribution of a formalin-resistant myelomonocytic antigen (L1) in human tissues. II. Normal and aberrant occurrence in various epithelia. Am J Clin Pathol 1987; 87: 700-7. 5. Clohessy PA, Golden BE. Calprotectin-mediated zinc chelation as a biostatic mechanism in host defence. Scand J Immunol 1995; 42: 551-556. 6. Dale, I., Fagerhol, M. K., and Naesgaard, I.: Purification and partial characterization of highly immunogenic human leukocyte protein, the L1 antigen. Eur J Biochem 1983; 134: 1-6. 7. Fagerhol MK. Calprotectin, a faecal marker of organic gastrointestinal abnormality. Lancet 2000; 356: 1783-1784. 8. Gabrielsen TO, Dale I, Brandtzaeg P, Hoel PS, Fagerhol MK, Larsen TE, Thune PO. Epidermal and dermal distribution of a myelomonocytic antigen (L1) shared by epithelial cells in various inflammatory skin diseases. J Am Acad Dermatol 1986; 15: 173-179. 9. Hessian PA, Edgeworth J, Hogg N. MRP-8 and MRP-14, two abundant Ca(2+)-binding proteins of neutrophils and monocytes. J Leukoc Biol 1993; 53: 197-204. 10. Jaresova M, Striz I, Cermakova J, Lacha J, Sedlacek J, Mudra K, Hana I, Vitko S. Serum procalcitonin concentrations in transplant patients with acute rejection and bacterial infections. Immunol Lett 1999; 69:
355-358. 11. Kligman D, Hilt DC. The S100 protein family. Trends Biochem Sci 13: 437-43., 1988. 12. Loomans HJ, Hahn BL, Li QQ, Phadnis SH, Sohnle PG. Histidine-based zinc-binding sequences and the antimicrobial activity of calprotectin. J Infect Dis 1998; 177: 812-4. 13. Madland TM, Hordvik M, Haga HJ, Jonsson R, Brun JG. Leukocyte protein calprotectin and outcome in rheumatoid arthritis. A longitudinal study. Scand J Rheumatol 2002; 31: 351-4, 2002. 14. Nisapakultorn K, Ross KF, Herzberg MC. Calprotectin expression inhibits bacterial binding to mucosal epithelial cells. Infect Immun 2001; 69:3692-3696. 15. Sampson B, Kovar IZ, Rauscher A, Fairweather-Tait S, Beattie J, McArdle HJ, Ahmed R, Green C. A case of hyperzincemia with functional zinc depletion: a new disorder? Pediatr Res 1997; 42:219-225. 16. Sander J, Fagerhol MK, Bakken JS, Dale I. Plasma levels of the leucocyte L1 protein in febrile conditions: relation to aetiology, number of leucocytes in blood, blood sedimentation reaction and C-reactive protein. Scand J Clin Lab Invest 1984; 44: 357-362. 17. Srikrishna G, Panneerselvam K, Westphal V, Abraham V, Varki A, Freeze HH. Two proteins modulating transendothelial migration of leukocytes recognize novel carboxylated glycans on endothelial cells. J Immunol 2001; 166: 4678-4688. 18. Steinbakk M, Naess-Andresen CF, Lingaas E, Dale I, Brandtzaeg P, Fagerhol MK. Antimicrobial actions of calcium binding leucocyte L1 protein, calprotectin. Lancet 1990; 336: 763-765. 19. Stockley RA, Dale I, Hill SL, Fagerhol MK. Relationship of neutrophil cytoplasmic protein (L1) to acute and chronic lung disease. Scand J Clin Lab Invest 1984; 44: 629-634. 20. Stříž I, Jarešová M, Lácha J, Sedláček J, Vítko S. MRP 8/14 and procalcitonin serum levels in organ transplantations. Ann Transplant 2001a; 6: 6-9. 21. Stříž I, Pokorná-Sochůrková H, Zheng L, Jarešová M, Guzman J, Costabel U. Calprotectin expression and mononuclear phagocyte subpopulations in peripheral blood and bronchoalveolar lavage. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis 2001b; 18: 57-63. 22. Summerton CB, Longlands MG, Wiener K, Shreeve DR. Faecal calprotectin: a marker of inflammation throughout the intestinal tract. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002; 14: 841-845. 23. Voganatsi A, Panyutich A, Miyasaki KT, Murthy RK. Mechanism of extracellular release of human neutrophil calprotectin complex. J Leukoc Biol 2001; 70: 130-134.