DISKY PRO TESTOVÁNÍ CITLIVOSTI K ANTIBIOTIKŮM ZÁSOBNÍK PRO 50 DISKŮ STUDIUM CITLIVOSTI K ANTIMIKROBIÁLNÍM ČINIDLŮM 1- KLINICKÝ VÝZNAM Tyto disky se používají k semikvantitativnímu určení in-vitro citlivosti k antimikrobiálním činidlům rychle rostoucích bakterií a některých dalších druhů pomocí agarové difúzní metody. Tato metoda je založena na standardizovaném postupu publikovaném WHO (1) a podle CLSI (2, 3) a CA-SFM (4) a EUCAST (5) je považována za konsensuální standard (pravidelně ověřováno). Směrnice ohledně testování citlivosti k antibiotikům a interpretace výsledků naleznete v aktuálních dokumentech CLSI (2,3), CA-SFM (4) nebo EUCAST (5). 2- PRINCIP Papírové disky napuštěné antimikrobiálním činidlem definované koncentrace jsou umístěny na povrch odpovídajícího média (A), již naočkovaného kalibrovaným inokulem (A) čisté a čerstvé kultury testovaného bakteriálního kmenu. Po inkubaci (A) jsou Petriho misky vyhodnoceny a změřené zóny inhibice okolo disků jsou porovnány s kritickými hodnotami (A) pro různá testovaná antimikrobiální činidla pro určení klinické kategorie citlivosti (rezistentní, intermediální, citlivý ). Průměr zóny inhibice je úměrný citlivosti testovaného kmenu (A) ve shodě s aktuálními směrnicemi CLSI (2, 3) CA-SFM (4) EUCAST (5). 3- SLOŽENÍ Bio-Rad disky jsou 6,5 mm disky vyrobené z vysoce kvalitního savého papíru napuštěného přesnými koncentracemi antimikrobiálních činidel. Disky jsou zřetelně označené kódem, složeným z 1 až 3 písmen, vytištěných na každé straně disku (viz. Tabulka 1). Bio-Rad disky jsou dodávány v zásobnících s 50 disky zabalených ve vodotěsných obalech obsahujících absorbent vlhkosti. Tabulka 1: Bio-Rad disky pro testování citlivosti k antibiotikům OBSAH DISKU SYMBOL VELIKOST BALENÍ OBJEDNÁVACÍ Č. Amikacin AN 66148 Amoxicillin 25 µg AMX 66138 Amoxicillin + Clavulanic Acid 20 + 10 µg AMC 66178 Ampicillin 2 µg 10 µg AMN 2 AM 67288 66128 Ampicillin + Sulbactam 10 + 10 µg SAM 67018 Azithromycin 15 µg AZM 67008 Aztreonam ATM 66928 Bacitracin 1 / 10 UI B 66158 Carbenicillin 100 µg CB 100 66198 Cefaclor CEC 30 67498 Cefalexin CN 66208 Cefamandole MA 66238 Cefazolin CZ 66258 Cefepime FEP 66098 Cefixime 5 µg 10 µg CFM 5 CFM 10 67588 66418 Cefoperazone 75 µg CFP 75 CFP 30 67618 66298 Cefoperazone + Sulbactam 75 + SCF 105 66734 Cefotaxime 5 µg CTX 5 CTX 67718 66368 Cefotetan CTT 66428 Cefoxitin FOX 66228 Cefpirome CPO 66468 Cefpodoxime 10 µg CPD 66918 Cefprozil CPR 66488 Cefsulodin CFS 66938 Ceftazidime 10 µg CTZ 10 CAZ 67298 66308 Ceftibuten CTB 30 67638 Ceftriaxone CRO 66188 Cefuroxime CXM 66358 Cephalotin CF 66218 1
OBSAH DISKU SYMBOL VELIKOST BALENÍ OBJEDNÁVACÍ Č. Chloramphenicol C 66278 Ciprofloxacin 5 µg CIP 68648 Clarithromycin 15 µg CLR 67058 Clindamycin 2 µg CM 66328 Colistin 10 µg 50 µg CS 10 CS 50 67268 66348 Doripenem 10 µg DORI 10 67348 Doxycycline DO 66388 Ertapenem 10 µg ETP 10 67518 Erythromycine 15 µg E 66448 Flumequine UB 68918 Fosfomycin 50 µg 200 µg FOS 50 FOS 200 66458 67658 Fusidic Acid 10 µg FA 66518 Gentamicin 10 µg 15 µg / 10 UI GM GM GME 30 66608 66548 67318 Gentamicin (high load) 120 µg 500 µg GEN 120 GEN 500 67598 66578 Imipenem 10 µg IPM 66568 Isepamicin ISP 66838 Kanamycin K 66618 Kanamycin (high load) 1mg KAN 66628 Levofloxacin 5 µg LVX 66858 Lincomycin 15 µg L 66678 Linezolid 10 µg LZD 10 67878 Linezolid LZD 30 67388 Mecillinam 10 µg MEC 66768 Meropenem 10 µg MEM 67048 Metronidazole 4 µg MTR 68908 Mezlocillin 75 µg MZ 66708 Minocycline MNO 66728 Moxalactam MOX 66698 Moxifloxacin 5 µg MXF 5 67098 Mupirocin 5 µg MUP 67088 Nalidixic Acid NA 68618 Neomycin 30 UI N 66748 Netilmicin 10 µg NET 10 NET 67798 66758 Nitrofurantoin 100 µg NIF 100 67328 Nitrofurantoin 300 µg FT 68678 Nitroxolin 20 µg NI 68778 Norfloxacin 10 µg 5 µg NOR 10 NOR 5 66338 68238 Ofloxacin 5 µg OFX 68938 Oxacillin 1 µg 5 µg OX1 OX 66888 66848 Oxolinic Acid 10 µg OA 68628 Pefloxacin 5 µg PEF 68228 Penicillin 1 IU 6 µg / 10 IU P 1 P 67788 67218 Pipemidic Acid 20 µg PI 68638 Piperacillin 75 µg 100 µg PIL 30 PIP 75 PIP 100 68478 67258 67228 Piperacillin + Tazobactam 30 + 6 µg 75 + 10 µg 100 + 10 µg PTZ 36 TZP 85 TZP 110 67338 66498 67238 Polymixin 50 µg / 300 UI PB 67248 Pristinamycin 15 µg PT 67278 Quinupristin-Dalfopristin 15 µg QD 15 67528 Rifampicin 5 µg RA 5 RA 30 66648 67308 Sparfloxacin 5 µg SPX 66538 Spectinomycin 100 µg SPT 68798 Spiramycin 100 µg SP 67378 Streptomycin 10 µg S 67418 Streptomycin (high load) 300 µg STR 300 67608 2
OBSAH DISKU SYMBOL VELIKOST BALENÍ OBJEDNÁVACÍ Č. 500 µg STR 500 67428 Sulfonamides 300 µg 200 µg SSS 300 SSS 200 67578 68408 Teicoplanin TEC 68948 Telithromycin 15 µg TEL 15 67538 Tetracycline TE 67448 Ticarcillin 75 µg TIC 67458 Ticarcillin + Clavulanic Acid 75 + 10 µg TCC 67468 Tigecycline 15 µg TGC 15 67398 Tobramycin 10 µg TM TOB 30 67488 67358 Trimethoprim + Sulfamethoxazole 1.25 + 23.75 µg SXT 68898 Trimethoprim 5 µg TMP 68888 Vancomycin 5 µg VA 5 VA 67828 68928 *CLSI obsahy disku jsou označeny tučně. 4- UCHOVÁVÁNÍ Datum exspirace se vztahuje výhradně na disky v neporušených zásobnících uchovávaných v souladu s instrukcemi výrobce. Datum exspirace a číslo šarže jsou uvedeny na každém obalu (kazeta a obal). Zásobníky s disky musí být uchovávány ve svých obalech při teplotě mezi +2 C a +8 C na suchém místě. Před otevřením musí být obaly se zásobníky temperovány na laboratorní teplotu (18-30 C). Po aplikaci disků, vraťte nepoužité zásobníky do teploty mezi +2 C a +8 C. Nepoužívejte disky po uplynutí doby exspirace. Nepoužívejte zásobníky disků ponechané při laboratorní teplotě (18-30 C) déle jak 8 hodin bez ověření přijatelné míry účinnosti před dalším použitím tohoto zásobníku. Pokud jsou zásobníky po použití uchovávány v dispensoru, musí být uchovávány při +2-8 C na suchém místě s adsorbentem vlhkosti umístěným vevnitř. Stabilita disků v otevřených zásobnících umístěných v dispensorech (dle doporučení uchovávaných s adsorbenty vlhkosti) byla ověřena za běžných podmínek použití na 6 týdnů, s výjimkou pro antibiotické disky označené symbolem, pro které je stabilita v týdnech vyznačena uvnitř symbolu. 5- POTŘEBNÝ MATERIÁL, NENÍ SOUČÁSTÍ VÝROBKU Zásobník disků: 6-7 disků katalogové č. 50294 12-16 disků katalogové č. 50295 Kultivační média ve shodě s aktuálními směrnicemi (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ) Reagencie Bakteriální kmeny pro kontrolu kvality Opacitní kontrola ekvivalentní ke standardu 0,5 Mac Farlandu Laboratorní vybavení nezbytné pro testování citlivosti k antibiotikům pomocí agarové difúzní metody 6- UPOZORNĚNÍ Dodržujte instrukce aktuálních směrnic (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ). Dodržujte vždy aktuálně platné techniky a pokyny týkající se ochrany proti mikrobiologickým rizikům. Po použití sterilizujte kultury a veškerý kontaminovaný materiál. 7- POSTUP Vzorky: Disky nelze použít pro testy probíhající přímo na biologických vzorcích. Viz aktuální směrnice definující přípravu inokula z čisté, čerstvé kultury (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ). Pro všechny kroky testování citlivosti k antibiotikům a interpretace výsledků odkazujeme na doporučené postupy CLSI (2,3), CA-SFM (4) nebo EUCAST (5) : CLSI (2,3), CA-SFM (4), nebo EUCAST (5) navrhuje standardní techniky pro přípravu inokula, naočkování Petriho misek, volbu a uspořádání testovacích disků, inkubační teplotu a inkubační čas. Neustále dodržujte zásady správné laboratorní praxe. 8- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Přesně změřte průměry inhibičních zón a porovnejte s kritickými průměry uvedenými aktuálními směrnicemi (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ). Ke každému mikroorganismu je přiřazena klinická kategorie (intermediálně rezistentní, citlivý nebo necitlivý ) jako funkce změřeného průměru a kritického průměru pro testovaná antibiotika. Kriteria klinické kategorizace podle kritických průměrů jsou pravidelně revidována CLSI(2,3), CA-SFM(4), EUCAST(5). 3
9- ÚČINNOST / KONTROLA KVALITY TESTU Účinnosti antibiotických disků jsou systematicky kontrolovány požitím následujících kmenů: - Escherichia coli ATCC 25922 - Staphylococcus aureus ATCC 25923 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 - Haemophilus influenzae ATCC 49247 - Enterococcus faecalis ATCC 33186 - Clostridium perfringens ATCC 13124 - Enterococcus faecalis ATCC 29212 - Clostridium sporogenes ATCC 19404 Tabulka 2 uvádí akceptovatelné limity průměrů zón inhibice získaných agarovou difúzní metodou pro referenční kmeny uvedené níže. Obsah disku Standard Akceptovatelný průměr zóny (mm) Limity kontroly kvality E. coli S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae H. influenzae ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 27853 ATCC 49619 ATCC 49247 Amikacin CLSI 19-26 20-26 18-26 Amoxicillin 25 µg Vnitřní 19-25 Amoxicillin+clavulanic acid 20/10 µg CLSI 18-24 28-36 Ampicillin 10 µg CLSI 16-22 27-35 Ampicillin + Sulbactam 10/10 µg CLSI 19-24 29-37 Azithromycin 15 µg CLSI 21-26 Aztreonam CLSI 28-36 23-29 Bacitracin 10 UI Vnitřní 17-22 Carbenicilin 100 µg CLSI 23-29 18-24 Cefaclor CLSI 23-27 27-31 Cefalexin Vnitřní 18-23 25-30 Cefamandole CLSI 26-32 26-34 Cefazolin CLSI 21-27 29-35 Cefepime CLSI 31-37 23-29 24-30 Cefixime 10 µg Vnitřní 26-30 Cefixime 5 µg CLSI 23-27 Cefoperazone Vnitřní 26-30 21-25 21-25 Cefoperazone 75 µg CLSI 28-34 24-33 23-29 Cefoperazone + Sulbactam 75/ Vnitřní 27-33 23-30 Cefotaxime CLSI 29-35 25-31 18-22 Cefotetan CLSI 28-34 17-23 Cefoxitin CLSI 23-29 23-29 Cefpirome Vnitřní 29-35 26-32 23-29 Cefpodoxime 10 µg CLSI 23-28 19-25 Cefprozil CLSI 21-27 27-33 Cefsulodin Vnitřní 20-28 25-32 Ceftazidime CLSI 25-32 16-20 22-29 Ceftibuten CLSI 27-35 Ceftriaxone CLSI 29-35 22-28 17-23 Cefuroxime CLSI 20-26 27-35 Chloramphenicol CLSI 21-27 19-26 Ciprofloxacin 5 µg CLSI 30-40 22-30 25-33 Clarithromycin 15 µg CLSI 26-32 Clindamycin 2 µg CLSI 24-30 Colistin 10 µg CLSI 11-17 11-17 Colistin 50 µg CA-SFM 17-22 Doxycycline CLSI 18-24 23-29 Ertapenem 10 µg CLSI 29-36 13-21 Erythromycine 15 µg CLSI 22-30 Flumequine Vnitřní 25-31 Fosfomycin 50 µg CA-SFM 24-35 Fosfomycin 200 µg CLSI 22-30 25-33 Fusidic acid 10 µg CA-SFM 29-34 Gentamicin 10 µg CLSI 19-26 19-27 16-21 4
Akceptovatelný průměr zóny (mm) Limity kontroly kvality Obsah Standard E. coli S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae H. influenzae disku ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 27853 ATCC 49619 ATCC 49247 Gentamicin 10 UI CA-SFM 22-26 24-28 16-22 Imipenem 10 µg CLSI 26-32 20-28 Isepamicin Vnitřní 21-26 17-23 16-23 Kanamycin CLSI 17-25 19-26 Levofloxacin 5 µg CLSI 29-37 25-30 19-26 Lincomycin 15 µg CA-SFM 25-29 Linezolid CLSI 25-32 Mecillinam 10 µg CLSI 24-30 Meropenem 10 µg CLSI 28-34 29-37 27-33 Mezlocillin 75 µg CLSI 23-29 19-25 Minocycline CLSI 19-25 25-30 Moxalactam CLSI 28-35 18-24 17-25 Moxifloxacin 5 µg CLSI 28-35 28-35 17-25 Mupirocin 5 µg Vnitřní 18-26 Nalidixic Acid CLSI 22-28 Neomycin 30 UI Vnitřní 17-23 18-27 Netilmicin CLSI 22-30 22-31 17-23 Nitrofurantoin 300 µg CLSI 20-25 18-22 Nitroxolin 20 µg Vnitřní 20-26 Norfloxacin 5 µg Vnitřní 27-34 13-23 17-24 Norfloxacin 10 µg CLSI 28-35 17-28 22-29 Ofloxacin 5 µg Vnitřní 25-32 21-28 14-20 Oxacillin 5 µg CA-SFM 27-34 Oxacillin 1 µg CLSI 18-24 Oxolinic Acid 10 µg Vnitřní 22-30 Pefloxacin 5 µg CA-SFM 29-35 26-29 Penicillin 6 µg CLSI 26-37 Pipemidic Acid 20 µg Vnitřní 22-30 Piperacillin 100 µg CLSI 24-30 25-33 Piperacillin 75 µg Vnitřní 24-33 Piperacillin + Tazobactam 75/10 µg Vnitřní 22-29 24-31 24-33 Piperacillin + Tazobactam 100/10 µg CLSI 24-30 27-36 25-33 Polymixin 300 UI CLSI 13-19 Pristinamycin 15 µg CA-SFM 27-32 Quinupristin-Dalfopristin 15 µg CLSI 21-28 19-24 15-21 Rifampicin 5 µg CLSI 26-34 Rifampicin CA-SFM 34-39 Sparfloxacin 5 µg CLSI 30-38 27-33 21-29 Spectinomycin 100 µg Vnitřní 19-25 Spiramycin 100 µg Vnitřní 18-26 Streptomycin 10 µg CLSI 12-20 14-22 Sulfonamides 300 µg CLSI 24-34 Sulfonamides 200 µg Vnitřní 17-27 Teicoplanin CLSI 15-21 Telithromycin 15 µg CLSI 27-33 17-23 Tetracycline CLSI 18-25 24-30 Ticarcillin 75 µg CLSI 24-30 21-27 Ticarcillin+clavulanic acid 75/10 µg CLSI 24-30 29-37 20-28 Tigecycline 15 µg CLSI 20-27 20-25 23-29 Tobramycin 10 µg CLSI 18-26 19-29 19-25 Trimethoprim 5 µg CLSI 21-28 19-26 Trimethoprim + 1,25/23,75 Sulfamethoxazole µg CLSI 23-29 24-32 Vancomycin CLSI 17-21 5
Pro kontrolní limity (vnitřní standardy) : Gentamicin 120 µg: E. faecalis ATCC 33186 (16-23 mm) Streptomycin 300 µg: E. faecalis ATCC 33186 (14-20 mm) Gentamicin 500 µg: S. aureus ATCC 25923 (30-34 mm); E. faecalis ATCC 29212 (18-28 mm) Kanamycin 1mg: S. aureus ATCC 25923 ( 14 mm); E. faecalis ATCC 29212 ( 10 mm). Streptomycin 500 µg: S. aureus ATCC 25923 (24-28 mm); E. faecalis ATCC 29212 (14-25 mm). Metronidazole 4µg: Clostridium perfringens ATCC 13124, Clostridium sporogenes ATCC 19404 15 mm Cefoperazone + Sulbactam 75/30µg : E. coli ATCC 35218 (24-30 mm) Haemophilus influenzae ATCC 10211 je doporučený jako platný dodatečný kmen na kontrolu kvality k ověření růstových vlastností HTM. Navzdory nedostatku spolehlivých závazných kritérií o difůzi disku pro S.pneumoniae s určitými beta-laktamy, kmen Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 byl navržen jako kontrola kvality difůze všech disků se všemi Streptococcus spp. Pro test spectinomycinového disku s akceptovatelnými průměry zón 23 až 29 mm (CLSI/NCCLS) je doporučena Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226. Rozklad oxacillinového disku je nejlépe určen pomocí QC organismu Staphylococcus aureus ATCC 25923, s akceptovatelným průměrem zón 18 až 24 mm. Podle směrnic EUCAST (verze 1.2, 2010) jsou účinnosti antibiotických disků systematicky kontrolovány požitím následujících kmenů: - Escherichia coli ATCC 25922 - Staphylococcus aureus ATCC 29213 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - Enterococcus faecalis ATCC 29212 - Haemophilus influenzae NCTC 8468 Tabulka 3 uvádí akceptovatelné limity průměrů zón inhibice získaných agarovou difúzní metodou pro referenční kmeny uvedené níže. Obsah disku E.coli ATCC 25922 Akceptovatelný průměr zóny (mm) Limity kontroly kvality S. aureus ATCC 29213 P. aeruginosa ATCC 27853 S. pneumoniae ATCC 49619 H.influenzae NCTC 8468 E. faecalis ATCC 29212 Ampicillin 2 µg 19-25 15-21 Cefotaxime 5 µg 25-31 29-35 Ceftazidime 10 µg 23-29 21-27 Doripenem 10 µg 27-35 28-35 31-37 Gentamicin 12-18 Linezolid 10 µg 21-27 23-29 19-25 Netilmicin 10 µg 18-24 20-26 15-21 Nitrofurantoin 100 µg 17-23 18-24 Penicillin 1 IU 12-18 Piperacillin 21-27 Piperacillin+ Tazobactam 30/6 µg 23-29 20-26 Tobramycin 12-18 Vancomycin 5 µg 17-23 10-16 10- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je uvolněna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným akceptačním kriteriím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u výrobce. 11- LIMIT POUŽITELNOSTI Klinická kategorizace (rezistentní, intermediální, citlivý ) se může odlišovat v rozmezí maximálně jednoho milimetru, což odpovídá běžné hranici chyby v laboratoři. Mohou být použita i jiná antimikrobiální činidla než uvedená v tabulce 2. Testy citlivosti s použitím těchto činidel by měly být interpretovány na základě přítomnosti nebo absence jasných zón inhibice a musí být považovány jen za kvalitativní do té doby, než budou ustanoveny jako závazné zóny. Zaznamenávejte veškeré rozměry zón. Účinnost testu nezávisí pouze na aktivitě disku, ale také na dalších faktorech jakými je používání vhodného inokula a kontrolních kmenů, vhodné a předem otestované kultivační médium a správné uchovávání. Výsledná interpretace, stejně jako veškeré laboratorní interpretace, nemůže být založena na výsledcích jednoho samotného testu, ale na přehledu klinických dat a biochemických, cytologických a imunologických výsledků. 6
12- LITERATURA 1. World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1992. Technical report series 822. W.H.O., Geneva. 2. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Approved standard M2-A10. Performance standards for antimicrobial susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa. 3. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. CLSI document M100-S19. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 20th informational supplement, Wayne, Pa. 4. CA-SFM: Comité de l antibiogramme. 2010. French Society of Microbiology. 5. EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST QC Tables V1.2. 2010. 6. V. Loncle-Provot, E. Keller, M.O. Gourdin, M.L. Garrigues. Etude de la stabilité des disků antibiotiques dans les conditions d'utilisation en routine, 18th inter disciplinary meeting on anti-infectious chemotherapy, Paris, Dec.3/4 1998. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 01/2011 www.bio-rad.com 7