Masarykova univerzita v Brně. Lékařská fakulta ERYTROCYTÁRNÍ ALOIMUNIZACE TĚHOTNÝCH ŽEN. Bakalářská práce V oboru zdravotní laborant

Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta ERYTROCYTÁRNÍ ALOIMUNIZACE TĚHOTNÝCH ŽEN Bakalářská práce V oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: MUDr. Alena Pejchalová Autor: Barbora Štaudová Brno, duben 2008

Jméno a příjmení autora: Barbora Štaudová Název bakalářské práce: Erytrocytární aloimunizace těhotných žen Pracoviště: Transfuzní oddělení a krevní banka FN Brno Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Alena Pejchalová Rok obhajoby bakalářské práce: 2008 Souhrn: Předmětem této práce je seznámit s problematikou erytrocytární aloimunizace u těhotných žen. Práce uvádí historii, příčiny a patofyziologii imunizace těhotných žen, možnosti jejich monitorování při riziku hemolytického onemocnění fetu a novorozence (HON), informuje o imunohematologických laboratorních vyšetřeních i konkrétních testech, rutinně používaných při vyšetření těhotných s rizikem HON. Podává přehled o imunohematologických vyšetřeních plodu, novorozence a matky po porodu. Údaje o těhotných ženách, získané za rok 2006 v archivu laboratoře Transfuzního oddělení a krevní banky FN Brno, rozdělené podle prevalence a typu aloimunizace, jsou zpracované ve statistické, závěrečné části práce. Klíčová slova: Erytrocytární aloimunizace, hemolytické onemocnění plodu a novorozence, imunohematologické vyšetření Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a aby byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Aleny Pejchalové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne. Barbora Štaudová

Použité symboly a zkratky: AIHA CMV dg. FMK Hb HON IUT Ig NAT PAT PCR RhIg autoimunní hemolytická anemie cytomegalovirus diagnostický fetomaternální krvácení hemoglobin hemolytické onemocnění plodu a novorozence intrauterinní transfuze imunoglobin nepřímý antiglobulinový test přímý antiglobulinový test polymerázová řetězová reakce anti-d protilátka profylaktická

Obsah 1. Úvod 2. Historie hemolytického onemocnění novorozence 3. Aloimunizace v těhotenství 3.1 Příčiny 3.2 Inkompatibilita v Rh antigenech 3.3 Inkompatibilita v AB0 antigenech 3.4 Inkompatibilita v antigenu Kell 3.5 Inkompatibilita v jiných krevních skupinách 4. Hemolytické onemocnění novorozence 4.1 Průběh HON 4.2 Léčba HON 4.2.1 Intrauterinní transfuze 4.2.2 Fototerapie 4.2.3 Výměnná transfuze 4.2.4 Léčba imunoglobuliny 5. Vyšetření v těhotenství 5.1 Imunohematologická vyšetření 5.1.1 Vyšetření krevní skupiny 5.1.2 Screeningové vyšetření antierytrocytárních protilátek pacienta 5.1.3 Identifikace antierytrocytárních protilátek 5.1.4 Titrace 5.1.5 Vyšetření imunních protlátek anti-a, anti-b 5.1.6 Přímý antiglobulinový test 5.1.7 Určení erytrocytárního antigenu 5.1.8 Eluční test

5.2 Další vyšetření 5.2.1 Typizace pomocí DNA analýzy 5.2.2 Amniocentéza 5.2.3 Kordocentéza 5.2.4 Ultrasonografické vyšetření 6. Profylaxe v těhotenství 7. Statistická část 8. Závěr

1. Úvod Předmětem a cílem této práce je seznámit s problematikou aloimunizace těhotných žen, se způsobem imunohematologického vyšetření těhotných, zvláště těhotných s rizikem hemolytického onemocnění novorozence, informovat o dalších postupech, souvisejících s diagnostikováním tohoto onemocnění a také stanovit prevalenci imunizovaných těhotných a typ aloimunizace dohledáním údajů archivovaných v imunohematologické laboratoři Transfuzního oddělení a krevní banky FN Brno. Tato práce je členěna do několika oddílů. V první části se seznámíme s historií těhotenské imunizace. V další části jsou uvedeny teoretické základy této problematiky. Jsou zde popsány příčiny a mechanizmy, které erytrocytární aloimunizaci způsobují a patofyziologie. Ve třetí části práce se pojednává o možných rizicích a následcích aloimunizace, o hemolytickém onemocnění plodu a novorozence. Poslední část se zabývá prevencí imunizace těhotných žen. Na teoretickou část navazuje část laboratorní, která obsahuje informace o jednotlivých laboratorních testech používaných při imunohematologickém vyšetřování těhotných žen, plodu nebo novorozence. Závěrem práce je statistické zpracování prevalence imunizovaných žen z počtu žen, které byly v roce 2006 vyšetřeny ve Fakultní nemocnici Brno. 7

2. Historie hemolytického onemocnění novorozence S historií erytrocytární aloimunizace je spojená i historie hemolytického onemocnění novorozence. Postupně jak se získávaly poznatky o tomto onemocnění, vznikala i prevence proti němu. Tento proces však prošel složitým vývojem, je spojený s mnoha jmény a pracemi. Jednou z prvních osob zabývající se touto problematikou byla v 1938 doktorka Ruth Darrowová z Ženské a dětské nemocnice v Chicagu. Své výsledky zakládala na dosažitelných rodinných studiích, ze kterých vyvodila tzv.konstantní faktor. Viděla, že potomstvo jedné matky inklinuje k nemoci spíše, než potomci jednoho otce. Také viděla, že první dítě bývá zřídkakdy postižené. Domnívala se tedy, že nemoc je získaná a nemá vztah k dědičnosti. Analýzami zjistila, že v matčině krvi vznikají, nejspíše nějakou imunitní reakcí, protilátky. Následně zjistila, že to, proti čemu imunizovaná matka protilátky tvoří, jsou červené krvinky. V té době byl jediný známý rozdíl mezi erytrocyty novorozence a dospělého hemoglobin F. Proto pokládala za antigen právě jej. Dalším, a to velice významným lékařem, byl Philip Levine. V roce 1939 publikoval první listy týkající se Hemolytického onemocnění novorozence. V této publikaci je popsán případ, kdy 25-letá žena porodila v druhém těhotenství mrtvé dítě. Protože při porodu ztratila hodně krve, dostala krevní transfuzi od svého muže. Ten, stejně jako ona, měl krevní skupinu 0. U pacientky však vznikla velmi těžká potransfuzní reakce. Vzorek jejího séra byl poslán doktoru Levinovi. Ten svými analýzami zjistil, že sérum reaguje jak s krví otce, tak ještě s dalšími 85 % obyvatel. Z tohoto pokusu bylo tedy jasné, že imunizující antigen v krvi nebo tkáni plodu je zděděný od otce. Příspěvkem doktora Levina byl fakt, že plod (jehož smrt zatím nebyla připisována nemoci) může imunizovat matku, což byl druhý zjištěný způsob imunizace po krevní transfuzi. Soupeřem doktora Levina byl doktor Alexander Weiner, který spolupracoval s doktorem Karlem Landsteinerem (rok 1901, objev tří krevních skupin). Prováděli pokusy s přenosem krve na zvířatech. Zjistili, že krvinky opice Macacus rhesus vyvolávají u králíků tvorbu protilátky, která reaguje s antigeny erytrocytů 85 % obyvatelstva. Tento antigen byl nazván Rh faktorem. V dalších výzkumech, které Weiner prováděl společně se svým kolegou Petersem, je poprvé zmínka o protilátkách anti-rh. obr. Karl Landsteiner 8

Objev Rh faktoru a protilátky anti-rh (později anti-d) otevřel nový pohled na transfuzní terapii a imunohematologii. Od r.1940 se objevují nové vývojové trendy, dochází ke vzniku nových laboratorních technik a metod. V roce 1960 jsou tyto základní testy plně vyvinuty do podoby, jakou známe dnes. Důležité poznatky plynuly z práce doktorů Nevalinna a Vainia z Finska. Rozvíjeli teorii, že Rh negativní matka, která je se svým Rh pozitivním dítětem v AB0 inkompatibilitě (např. je-li dítě krevní skupiny A a matka skupiny 0), je více chráněna před imunizací než matka, která je se svým Rh pozitivním dítětem AB0 kompatibilní. Tento poznatek ohlásil vývoj metod, které se podílely na prevenci Rh imunizace. Prací kliniků a vědců bylo přijít na způsob, jak zabránit Rh imunizaci. Levine, Weiner a potom i mnoho dalších vnímali, že imunizace matky je spojena s cirkulací fetálních erytrocytů v jejím krevním oběhu. Bylo jasné, že velké krvácení při porodu imunizaci vyvolá. Bylo ale nutné odhalit malá krvácení, která byla častější a ne tak nápadná. Techniku, která by odhalila malé množství fetální krve v matčině cirkulaci poskytli doktoři Kleihauer a Betke z Německa. Dr. Kleihauer byl hematolog, který se zabýval po mnoho let studiem fetálního hemoglobinu. Společně s dr. Betkem vyvinuli technologii, pomocí které rozlišili fetální erytrocyty od dospělých v obarveném krevním nátěru. Tato metoda byla velice citlivá a dokázala odhalit už jednu kapku krve plodu v mateřské cirkulaci. Možnosti prevence Rh imunizace vyplynuly z práce doktora Rona Finna, Cyrila Clarka a jejich kolegů na univerzitě v Liverpoolu. Druhou skupinou v oblasti této problematiky byli lékaři z Kolumbijské univerzity Vince Fred a John Gorman, kteří spolupracovali s dalšími odborníky. Liverpoolská skupina říkala, že podáním protilátky anti-d Rh negativním ženám předejdeme imunizaci zničením právě těch buněk, které imunizaci způsobily. Obě skupiny byly zajedno v tom, že se protilátky jen zřídkakdy vytvářejí během prvního těhotenství. K tomu přispěla zkušenost, že větší množství fetální krve, které navodilo tvorbu protilátek, se objevilo až v období porodu nebo při něm. Protilátky jako takové začaly být přítomny v krvi matky přibližně měsíc po porodu. Prevence mohla být úspěšná, pokud by se provedla ihned po porodu. Vzniklo tak první zajištění těhotných, používané v prevenci proti erytrocytární aloimunizaci u těhotných žen a to jako koncentrát anti-rh (anti-d) gamma globulin, který se matce podával jako injekce po porodu. Následovalo zkoušení v Liverpoolu i v New Yorku a postupně i v dalších zemích světa. Podle statistik se pouze u 184 žen z celkového počtu 75 075 takto léčených žen po porodu (tj. u 0,25 % žen) vytvořila protilátka anti-d během prvních šesti měsíců po porodu. Podle původních předpokladů to mělo být až u 3 904 (5,2 %) žen. Stále 9

tak zůstává malé procento žen, které vytvářejí protilátky ještě před porodem. Pro tyto ženy injekce anti-d imunoglobulinu po porodu nemá žádný význam. Pro tuto skupinu žen by naopak byla vhodná profylaktická injekce podaná již ve 28. týdnu těhotenství. 10

3. Aloimunizace v těhotenství Pojem erytrocytární aloimunizace znamená imunitní reakci na cizorodé antigeny, vyskytující se na povrchu erytrocytu. U těhotných žen erytrocytární aloimunizaci způsobují paternální antigeny červených krvinek plodu. Tento jev může mít pro plod nebo pro novorozence nepříznivé následky v podobě Hemolytického onemocnění plodu a novorozence. Některé povrchové erytrocytární antigeny mohou stimulovat matčin imunitní systém k tvorbě protilátek proti těmto antigenům. K tomu je však potřeba, aby došlo ke kontaktu krve matky a plodu (novorozence). Fyziologicky jsou oba krevní oběhy od sebe oddělené a krev se vzájemně nemísí. Avšak při porodu nebo jiných porodnických zákrocích a také při některých úrazech může dojít k fetomaternálnímu krvácení. Žena je senzibilizována a následná tvorba mateřských protilátek IgG třídy, které přes placentu prochází do fetálního oběhu, může ohrozit plod již při stávajícím obr. tvorby protilátek nebo při dalším těhotenství. Mezi více než padesáti různými antigeny, schopnými způsobit mateřskou aloimunizaci, jsou nejběžnější a nejdůležitější antigeny Rh systému. Především je to antigen D, způsobující nejzávažnější typy hemolytického onemocnění plodu a novorozence. Dalšími nejčastějšími a take významnými antigeny jsou antigeny c (antigen Rh systému) a antigen K1 (antigen skupiny Kell). Hemolytické onemocnění může vzniknout i při inkompatibilitě v AB0 antigenech. Těhotné ženy s rizikem aloimunizace je nutné cíleně vyhledávat, ženy již imunizované, s klinicky významnými protilátkami, pravidelně sledovat a monitorovat u nich průběh těhotenství s ohledem na možnost vzniku fetální anemie a zajistit pro ně léčbu při manifestním HON nebo při požadování transfuze. Imunohematologické diagnostikování se provádí v rámci prenatální, perinatální nebo postnatální péče, včetně péče profylaktické. 11

3.1 Příčiny Imunizace během těhotenství nastává, když se fetální erytrocyty, které exprimují pro matku cizí antigen, dostávají do jejího krevního oběhu. Tato situace se označuje jako fetomaternální krvácení. Jinou příčinou imunizace těhotné může být léčba transfuzí, kdy podání antigenně odlišných dárcovských erytrocytů navodí u těhotné imunitní odpověď. Vytvořená protilátka může být riziková i pro plod, pokud fetální erytrocyty exprimují daný antigen. Příčiny imunizace těhotné : Fetomaternální krvácení Předporodní Během porodu Potraty Spontánní Terapeutický Mimoděložní těhotenství Předčasně odloučení placenty Abdominální trauma Porodnické zákroky Amniocentéza Biopsie choriových klků Kordocentéza Manuální vyjmutí placenty Obrat plodu zevními hmaty Krevní transfuze 3.2 Inkompatibilita v Rh antigenech Inkompatibilita v D antigenu Rh(D) je nejčastější a nejzávažnější příčinou mateřské aloimunizace. Nastává v případech, kdy Rh(D) negativní matka má Rh(D) pozitivní plod. Ten má na svých erytrocytech antigen D, který je pro matku cizí. Pokud dojde k imunizaci (viz výše), mateřské lymfocyty rozpoznají tento cizí antigen a začnou proti němu vytvářet protilátky. Zpočátku jsou to protilátky třídy IgM, které nepřestupují pro svou velkou molekulu placentou, později ale dochází 12

k tvorbě protilátek třídy IgG, které už transplacentární bariéru překonat mohou. U jedné třetiny imunizovaných pacientek nacházíme protilátku IgG1, která způsobuje větší destrukci erytrocytů in utero a vede k anemii již u plodu. Anti-D protilátka podtřídy IgG3 bývá větším nebezpečím pro novorozence, kdy je příčinou novorozenecké hemolýzy a anemie. Při prvním těhotenství je riziko Rh(D) senzibilizace nízké, protože tvorba imunních protilátek trvá několik týdnů a vytvořené protilátky tak neohrozí současné těhotenství. V dalším těhotenství však stačí pouze malé množství fetálních erytrocytů (už 0,03ml fetálních erytrocytů) k navození sekundární imunitní odpovědi a imunitní systém začne s rychlou produkcí protilátek anti-d IgG. Rh antigeny plodu mohou antigenně působit už od osmého týdne intrauterinního vývoje. Čím více je matka imunizována, tím větší je riziko pro vznik a závažnost hemolytického onemocnění plodu a novorozence. Určitou roli u aloimunizace antigenem D hraje kompatibilita v AB0 systému. Pokud je matka se svým plodem shodná v AB0 antigenech, je riziko imunizace větší než u inkompatibilního vztahu matky a dítěte. Je to dáno tím, že inkompatibilní červené krvinky plodu jsou v mateřském organismu rychle ničeny a proto se snižuje doba vystavení D antigenu imunitnímu systému matky a zamezí se následné tvorbě protilátek (fetální erytrocyty jsou ničeny před tím, než antigen může stimulovat mateřské B buňky). V Rh systému kromě antigenu D rozpoznáváme další antigeny: C, c, E, e, Cw. I proti těmto antigenům mohou vznikat protilátky. Vztah těchto protilátek k hemolytickému onemocnění je různý: U protilátky anti-e nebo anti-cw mívá hemolytické onemocnění mírný průběh. Protilátka anti-c se může projevovat onemocněním s odlišnými klinickými projevy včetně těžké formy HON. Protilátka anti-e se vyskytuje vzácně, stejně tak i protilátka anti-c, bývají mírné příznaky HON. Kombinace protilátek (jako např. anti-c+e, které se často nacházejí společně) může způsobit vážné onemocnění. obr. protilátka IgG 13

3.3 Inkompatibilita v AB0 antigenech Hemolytické onemocnění plodu a novorozence, které souvisí se systémem AB0, se projevuje obvykle u AB0 nestejnoskupinových novorozenců matek skupiny 0. Je to dáno tím, že v séru žen skupiny 0 se nacházejí anti-a a anti-b protilátky třídy IgG, které mohou přecházet přes placentu a vázat se na erytrocyty plodu, pokud mají antigen A nebo B. Hemolýza spojená s účinky anti-a je více častá než hemolýza způsobená anti-b. Avšak hemolýza při AB0 neshodě je většinou mírná, novorozenci mají jen vzácně klinické projevy HON. Je to dáno tím, že antigeny A i B se vyskytují na více typech buněk v organizmu než pouze na červených krvinkách a proto se snižuje šance na navázání protilátky na fetální erytrocyty. Zvýšené hladiny protilátek anti-a a anti-b u matky nemusí mít vztah k HON a tak monitorování AB0 protilátek v těhotenství nemá prognostický význam. Diagnóza AB0 HON bývá stanovena na základě klinického nálezu u novorozence. 3.4 Inkompatibilita v antigenu Kell Druhým nejčastějším systémem, který se dává do souvislosti s hemolytickým onemocněním plodu a novorozence, je systém Kell. Antigeny této skupiny jsou po antigenu D nejvíce imunogenní. Systém obsahuje přes dvacet antigenů. Ve vztahu k hemolytickému onemocnění novorozence přikládáme největší vážnost antigenu K1. Protilátky, které vzniknou proti tomuto antigenu, působí jiným mechanizmem: potlačují erytropoezu plodu a vedou k jeho anemizaci. HON může vzniknout už při nižší koncentraci protilátky, než je tomu u jiných typů inkompatibilit. Další antigeny, které se v tomto systému vyskytují, jsou například K2, K3 a K4. Protilátky proti těmto antigenům však nebývají (s výjimkou anti-k2) spojované s manifestním HON. 3.5 Inkompatibilita v jiných krevních skupinách Existuje velké množství antigenně specifických antierytrocytárních protilátek. O těch nejdůležitějších, které se uplatňují v patogenezi HON, již bylo pojednáno. K dalším patří např. protilátky proti antigenům skupiny Kidd, Duffy, MNSs, Diego, LW, protilátky proti antigenům s vysokou (Gerbich) nebo nízkou (Wright) četností výskytu v populaci. Některé protilátky lze zařadit mezi nevýznamné pro HON, nezpůsobující hemolytické onemocnění, např. protilátky proti antigenům P1, Lewis, H, N. 14

4. Hemolytické onemocnění plodu a novorozence 4.1 Průběh HON Důsledkem erytrocytární aloimunizace u těhotných žen může být HON a to v různém stupni závažnosti. Jak k tomuto onemocnění dochází již víme. Mateřské protilátky přestupují placentou do oběhu plodu a navazují se na jeho erytrocytární antigeny. Erytrocyty senzibilizované protilátkou pak podléhají urychlené destrukci buď již intrauterinně nebo i po narození. Vlivem zkráceného přežívání červených krvinek dochází ve fetální hematopoetické tkáni ke zvýšené tvorbě nových erytrocytů. Některé z těchto nově vzniklých buněk mohou do krve přecházet v nevyzrále formě (jako retikulocyty nebo erytroblasty). Tyto buňky však nemohou plnit svoji funkci. Pokud nově vytvořené funkční červené krvinky přiměřeně nahrazují rozpadlé buňky, nedochází k anemii a udržuje se kyslíková kapacita krve. Pokud však hematopoesa není dostačující, vzniká anemie, která může mít pro plod - podle stupně závažnosti - různé následky, a to i fatální. Kromě anemie je dalším vážným příznakem hemolytického onemocnění hyperbilirubinemie. Při hemolýze červených krvinek dochází k uvolnění bilirubinu a ke zvýšení jeho sérové hladiny, protože novorozenecká játra nejsou schopná tak velké množství bilirubinu zpracovat (kvůli deficitu enzymu, který se na tomto procesu podílí). Před narozením je fetální bilirubin metabolizovaný matčinými játry, ale po narození ho již musí novorozenec zpracovat sám. Riziko hromadění bilirubinu je v tom, že může v nekonjugované formě poškodit nervový systém. Bilirubin je příčinou žlutého zabarvení tkání a kůže, tj. novorozenecké žloutenky (icteru). Klinická vážnost HON má různou variabilitu. K základním typům patří: Během těhotenství: Lehká anemie, hyperbilirubinemie a žloutenka degradace bilirubinu nedostačuje, anemie je uspokojivě kompenzovaná. Těžká anemie se zvětšenými játry a slezinou zcela nedostačující kompenzace anemie, sekundárně dochází k postižení dalších orgánů. Hydrops fetalis nejzávažnější typ postižení, provázený hromaděním tekutiny, které postihuje subkutánní tkáň, pleuru, perikard nebo dutinu břišní (ascites). Vede k selhání srdce, když srdce není schopné přečerpávat velké množství tekutiny. 15

K příznakům, které mohou svědčit pro HON, patří: plodová voda s obsahem bilirubinu (žlutavě zabarvená), ultrazvukový nález zvětšených jater, sleziny, srdce nebo hromadící se tekutina v dutině břišní plodu a průkaz anemie u plodu. Po narození: Lehká hyperbilirubinemie a mírná anemie nejlehčí a nejčastější typ. Těžká hyperbilirubinemie a žloutenka dětská játra zde nejsou schopná zpracovat velké množství bilirubinu. Játra jsou zvětšená, anemie pokračuje. Kernicterus poškození mozkových center dítěte způsobené zvýšením hladiny bilirubinu. Nekonjugovaný bilirubin se dostává do krve a protože blood brain barier (membranózní struktura, která chrání mozek před škodlivinami) není plně vyvinuta, může bilirubin přejít do mozku a ovlivnit normální nervový vývoj. Novorozenec s příznaky HON bývá bledý při anemii, má žlutě zbarvenou kůži nebo i bělmo očí, u těžkých forem bývají zvětšená játra a slezina. Žloutenka se většinou rozvíjí až po porodu, do 24 až 36 hodin. 4.2 Léčba HON Pokud je onemocnění diagnostikované, je důležité sledovat jeho klinický průběh a u těžkých stavů zajistit pro plod nebo novorozence vhodnou léčbu. Za těžkou formu HON se v imunohematologii považuje situace, kdy je nutné podat transfuzi intrauterinní, exsanguinační nebo transfuzi v prvním týdnu života. 4.2.1 Intrauterinní transfuze Podání intrauterinní transfuze (IUT) je rizikové pro možné komplikace, provázející tento výkon. Indikací pro IUT je těžká anemie. IUT se provádí obvykle po 24. týdnu těhotenství a většinou po podání první transfuze následuje série dalších transfuzí. IUT se podává jako pomalá transfuze dárcovských erytrocytů, aplikovaná cestou pupeční žíly pod kontrolou ultrazvuku. obr. Intrauterinní transfuze 16

Erytrocyty, které používáme pro IUT, mají být čerstvé, maximálně do 5 dní po odběru, ozářené (prevence reakce štěpu proti hostiteli u příjemce s nedostatečně vyvinutým imunitním systémem). Erytrocyty musí být negativní pro detekci cytomegaloviru - toho lze dosáhnout jejich deleukotizací. Množství transfundované krve záleží na velikosti a stáří plodu a pohybuje se od 75 do 150ml. Krev má být skupiny 0 Rh(D) negativní, bez antigenu, proti kterému je vytvořená mateřská protilátka. Transfundované erytrocyty musí být kompatibilní s mateřským sérem. Aby nedošlo k objemovému přetížení plodu, mají mít vysoký hematokrit (kolem 75 %). Novorozenci, kterým byly podané IUT, se rodí jako Rh(D) negativní jedinci s obvykle negativním výsledkem přímého antiglobulinového testu. Je to proto, že při narození může být více než 90 % erytrocytů dárcovského původu. Po porodu je plod ohrožen hyperbilirubinemií a take anemií. Základními postupy v léčbě novorozeneckého HON je fototerapie, výměnná transfuze, substituční transfuze (top up) a léčba pomocí intravenozních imunoglobulinů. 4.2.2 Fototerapie Je to základní a neinvazivní metoda při léčbě hyperbilirubinemie. Podstatou je, že nekonjugovaný bilirubin přijme foton a změní tak svoji strukturu. Tento nový izomer se neváže s kyselinou glukuronovou, je rozpustný ve vodě a vylučuje se do žluči a moče. Tímto způsobem dochází ke snížení bilirubinémie. Při fototerapii se používají různé druhy světla (výbojky, zářivky, studené světlo) i světlo o různé vlnové délce. Nejúčinnější je tzv.modré světlo (460nm), které je nejblíže absorpčnímu spektru bilirubinu. obr. Fototerapie 17

4.2.3 Výměnná transfuse - exsanguinace Při výměnné transfuzi dochází k odstranění bilirubinu, protilátek proti erytrocytům a poškozených erytrocytů novorozence a k jejich náhradě erytrocyty a plazmou dárce krve. Do pupečníkového pahýlu se zavede katetr. Novorozenci se odebere 5 20 ml krve a ihned se nahrazuje stejným množstvím krve od dárce. Této metodě říkáme pull and push. obr.výměnné transfuze 4.2.4 Léčba imunoglobuliny U dětí, které nesplňují kriteria pro výměnnou transfuzi, se podávají intravenózně imunoglobuliny. Profylaktická dávka imunoglobulinů, přibližně 0,5g/kg, by měla snížit fagocytózu senzibilizovaných erytrocytů novorozence v buňkách retikuloendoteliálního systému a snížit tak hemolýzu. 18

5. Vyšetření v těhotenství Vstupní vyšetření v těhotenství podstupují všechny těhotné, protože i Rh(D) pozitivní ženy mohou tvořit protilátky proti erytrocytům. V ČR se toto vyšetření provádí mezí 10. 16. týdnem, obvykle ve 12. týdnu těhotenství. Kromě vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům se určuje krevní skupina v systému AB0 a antigen D. Další vyšetření se v těhotenství provádí ve 28. týdnu a opět obsahuje vyšetření antigenů AB0 a D a vyšetření nepravidelných antierytrocytárních protilátek. Pokud jsou obě vyšetření negativní, těhotnou není nutné dále imunohematologicky vyšetřovat. Pacientky s nálezem protilátek proti erytrocytům, pokud se jedná o protilátky rizikové pro HON, je nutné pravidelně sledovat. Další vyšetření protilátek se u nich provádí ve 20. týdnu těhotenství a dále každé 4 týdny. Kontroluje se specifita protilátky, sleduje se její množství pomocí titrace vyšetřovaného séra, a to až do dosažení hodnoty kritického titru nebo do 28. týdne těhotenství, odkdy je vhodné sledovat imunohematologický nález již po 2 týdnech (opět kontrola specifity protilátky a určení titru). Pokud se titr protilátky zvyšuje, pokud protilátka reaguje v kritickém titru (tj. v titru, při kterém může dojít k HON u protilátky anti-d se jedná o titr 16/32) nebo je-li v anamnéze pacientky údaj o HON v předchozích těhotenstvích, je přínosné testování antigenů na erytrocytech otce spojené s určením zygozity nebo genotypizační vyšetření provedené z mateřské periferní krve. Těhotné ženy, které jsou v riziku HON, musí být předané do péče specializovaného gynekologické pracoviště. Pacientky s protilátkami pro HON nevýznamnými se sledují ve stejném režimu jako pacientky bez protilátek. Imunohematologické vyšetření se provádí také u novorozenců. Má být provedené u novorozenců, které mají klinické známky HON a u novorozenců matek, 19

které neabsolvovaly předepsaná imunohematologická vyšetření. Novorozencům se vyšetřují AB0 a D antigeny a přímý antiglobulinový test. Při podezření na AB0 typ HON se došetřují imunní protilátky anti-a, anti-b. Pokud se v séru novorozence nachází více protilátek, lze protilátku, která má zásadní důležitost v onemocnění, specifikovat pomocí elučních testů. 5.1 Imunohematologická vyšetření Pro imunohematologická vyšetření se používá žilní srážlivá nebo nesrážlivá krev, pro některá vyšetření lze použít take pupečníkovou krev. Krevní vzorek k vyšetření se v preanalytické fázi připraví centrifugací zkumavky se vzorkem odebrané plné krve při 3000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Do separátních zkumavek se oddělí sérum (plazma) a erytrocyty. 5.1.1 Vyšetření krevní skupiny Při tomto vyšetření se sleduje exprese A/B/D antigenů na erytrocytech pacienta pomocí monoklonálních diagnostických sér. V séru (nebo plazmě) se testují přirozené AB0 protilátky diagnostickými erytrocyty. Pracovní postup Připraví se 3% suspenze vyšetřovaných erytrocytů v pufrovaném roztoku NaCl. Někteří výrobci diagnostik doporučují vyšetřované erytrocyty promýt, promytí je nutné provést při vyšetřování pupečníkové krve (k odstranění příměsí). Vyšetření krevních skupin se obvykle provádí zkumavkovým testem. Vyšetřují se jak antigeny (aglutinogeny), tak protilátky (aglutininy). Vyšetření AB0 antigenů: 1. Do 5 označených zkumavek se dají vždy 2 kapky diagnostického séra: anti-a, anti-b, dvě diagnostika anti-d (dva různé klony anti-d, které nedetekují antigen DVI) a kontrolní sérum. 2. Do každé zkumavky se přidá po 2 kapkách připravené 3% suspenze 20

3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. vyšetřovaných erytrocytů. Obsah zkumavek se promíchá a nechá 15 minut inkubovat při pokojové teplotě. Centrifugace 1 minutu při 1000 otáčkách. Resuspenduje se obsah ve zkumavkách a makroskopicky hodnotí aglutinace. Vyšetření AB0 protilátek: Do 4 označených zkumavek se dají 2 kapky diagnostických erytrocytů 0, A1, A2, B. Přidají se 2 kapky vyšetřovaného séra (plazmy). Obsah zkumavek se promíchá a 15 minut inkubuje při pokojové teplotě. Centrifugace 1 minutu při 1000 otáčkách. Resuspenduje se obsah ve zkumavkách a makroskopicky hodnotí aglutinace. Při vyšetření krevní skupiny dítěte do 6 měsíců se určují pouze AB0 antigeny na erytrocytech, nestanovují se AB0 protilátky (přirozené protilátky nemusí být vytvořené, navíc mohou být přítomné mateřské imunní AB0 protilátky). Interpetace výsledků: Aglutinace ve zkumavce znamená pozitivní výsledek testu, prokazuje antigen. Chybění aglutinace značí negativní výsledek testu, antigen chybí. Aby výsledky testů byly validní, musí být negativní výsledek testu při vyšetření s kontrolním sérem. 5.1.2 Screeningové vyšetření antierytrocytárních protilátek pacienta Při tomto vyšetření se ve vyšetřovaném séru nebo plazmě detekují nepravidelné protilátky proti erytrocytům. Používají se k tomu alespoň tři typy diagnostických erytrocytů se známým a pro výrobce předepsaným zastoupením erytrocytárních antigenů. Vyšetření se provádí pomocí sloupcové aglutinace v gelu testem LISS/ NAT, který lze doplnit o enzymový test (ID karty pro screening protilátek). 1. 2. Pracovní postup: ID karta s mikrozkumavkami se označí. Do mikrozkumavek se přidá 50µl odpovídajícího typu 0,8% dg. erytrocytů a 25µl vyšetřované plazmy (séra). Do karet NaCl/Enzym navíc 25µl Diluentu1. 21

3. 4. 5. Inkubace 15 minut v ID inkubátoru. Centrifugace 10 minut i ID centrifuze. Makroskopicky se hodnotí reakce. obr. typizační séra Interpetace výsledků: Pozitivní výsledek: aglutinace vytvořená jako linie erytrocytů na povrchu gelu nebo jako shluk v gelu prokazuje přítomnost protilátky. Hodnocení síly reakce na 1+ až 4+. Negativní výsledek sediment na dně mikrozkumavky, protilátka nenalezena. Pokud se získá pozitivní výsledek testu je nutné protilátku došetřit (identifikovat) viz.dále. 5.1.3 Identifikace antierytrocytárních protilátek Pokud je screeningové vyšetření antierytrocytárních protilátek pozitivní, musí následovat identifikace protilátky určení specifity. Identifikace se provádí pomocí širšího panelu diagnostických erytrocytů, které mají známé zastoupení antigenů stejným testem, který byl použitý jako screeningový. Na základě získaných reakcí v porovnání s hodnotící tabulkou, kterou dodává výrobce diagnostika, se určí protilátka. Vyšetření pomocí metody sloupcové aglutinace v gelu testem LISS/NAT a jednofázovým enzymovým testem: Pracovní postup: 1. 1ml ID Diluentu 2 se smísí s 10 µl vyšetřované krve, tím se připraví cca 0,8 % suspenze erytrocytů pacienta (autokontrola). 2. ID karty NaCl/Enzym a ID karty LISS/Coombs a jejich mikrozkumavky se označí. 3. Do označených zkumavek se přidá 50 µl 0,8 % suspense odpovídajícího typu diagnostických erytrocytů (používá se minimálně 8 typů), do poslední 50 µl 0,8 % připravené suspenze erytrocytů pacienta. 4. Do všech mikrozkumavek se přidá 25 µl vyšetřovaného séra. Do karet ID NaCl/ Enzym navíc ještě 25 µl ID Diluentu 1. 22

5. 6. 7. Inkubace 15 minut v ID inkubátoru. Centrifugace 10 minut v ID centrifuze. Makroskopicky se hodnotí reakce. Interpretace výsledků: Pozitivní reakci značí aglutinace v gelu nebo na povrchu gelu. Hodnotí se síla reakce na 1+ až 4+. Negativní reakci, kdy protilátka nereaguje s antigenem na dg. erytrocytech, lze detekovat jako sediment na dně zkumavky. 5.1.4 Titrace Titrováním vyšetřovaného séra obsahujícího protilátku se orientačně určuje množství protilátky v séru. Toto vyšetření není zcela přesné, nic nevypovídá o charakteru a vlastnostech protilátky, je však snadno dostupné a poskytuje dostačující informaci o tom, kdy je nutné zahájit sledování těhotné jinými metodami než imunohematologickými (ultrazvuk). 1. 2. 3. 4. Pracovní postup: Připraví se řada 12 aglutinačních zkumavek, označených čísly ředění v geometrické řadě (1:2, 1:4, 1:8 ) a pomocná zkumavka. V pomocné zkumavce se smíchá 2 x 0,1ml séra a 2 x 0,1ml izotonického roztoku NaCl a obsah se promíchá. Do první zkumavky se napipetuje 0,1 ml vyšetřovaného séra. Z obsahu pomocné zkumavky se přemístí 0,1 ml do druhé zkumavky v řadě. Do pomocné zkumavky se opět přidá 2 x 0,1ml izotonického roztoku NaCl a z jejího obsahu se znovu po promíchání přemístí 0,1 ml do třetí zkumavky v řadě. Takto se pokračuje až do ukončení titrování v poslední zkumavce. Do všech 12 zkumavek v řadě se přidá 0,1 ml 2-3 % suspenze dg. erytrocytů s antigenem odpovídajícím vyšetřované protilátce. Zkumavky se inkubují 1 hodinu při 37 C, jejich obsah se opakovaně promyje roztokem NaCl. 23

5. 6. Po poslední centrifugaci se odstraní supernatant a do každé zkumavky se přidají 2 kapky AGH séra. Obsah zkumavek se protřepe, centrifuguje, hodnotí se aglutinace. Interpretace výsledků: Výsledek je vyjádřen jako opačná hodnota nejvyššího ředění séra, při kterém protilátku detekujeme a která je hodnotitelná makroskopicky. Je udáván jako číslo konečného titru (např. poslední pozitivní reakce je v ředění 1:128, tzn. konečný titr je 128). 5.1.5 Vyšetření imunních protilátek anti-a, anti-b u novorozence U AB0 typu HON může být přímý antiglobulinový test (PAT) negativní. Proto se při podezření na tento typ HONu používá jako screeningová metoda test na zjištění mateřských imunních protilátek anti-a a/nebo anti-b v séru (plazmě) novorozence. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Pracovní postup: Podle skupiny dítěte se použijí dg. erytrocyty A1 nebo B, dále kontrolní erytrocyty skupiny 0. U všech typů erytrocytů se připraví jejich 0,8 % suspenze v diluentu 2 (cca 1ml ID Diluentu 2 a 10 µl erytrocytů). Označí se ID karta LISS/Coombs ( A nebo B a 0) Do mikrozkumavek se napipetuje 50 µl odpovídajících diagnostických erytrocytů a 25 µl séra (plazmy) novorozence. Inkubace 15 minut v ID inkubátoru. Centrifugace 10 minut v ID centrifuze. Reakce se hodnotí makroskopicky. Interpretace výsledků: Pozitivní reakci značí aglutinace v gelu nebo na povrchu gelu a prokazuje nález protilátky. Hodnotí se síla reakce na 1+ až 4+. Negativní reakci, kdy protilátka není přítomná, lze detekovat jako sediment na dně zkumavky. 24

5.1.6 Přímý antiglobulinový (Coombsův) test Při tomto vyšetření se detekují erytrocyty senzibilizované protilátkou in vivo. Pozitivní výsledek prokazuje protilátku navázanou na erytrocyty, která může být příčinou hemolýzy. 1. 2. 3. 4. Pracovní postup metodou sloupcové aglutinace v gelu: Smícháním 1 ml ID Diluentu 2 s10 µl vyšetřované krve ve zkumavce se připraví 0,8 % suspenze vyšetřovaných erytrocytů pacineta. Do ID karet LISS/Coombs se přidá 50 µl připravené suspenze erytrocytů. Centrifugace 10 minut v ID centrifuze. Makroskopicky se hodnotí aglutinace. Interpretace výsledků: Pozitivní reakci značí aglutinace v gelu nebo na povrchu gelu. Reakce se hodnotí dle síly 1+ až 4+. Negativní reakci, kdy protilátka nesenzibilizuje erytrocyty, lze detekovat jako sediment na dně zkumavky. 5.1.7 Určení erytrocytárního antigenu Při tomto testu se serologicky zjišťují membránové antigeny erytrocytů pomocí serologické aglutinační reakce mezi antigenem a protilátkou. Používají se k tomu komerční specifická antiséra s protilátkovou aktivitou proti vyšetřovanému antigenu. Zjišťuje se fenotyp vyšetřovaných erytrocytů. 1. 2. 3. Pracovní postup pro zkumavkové vyšetření: Připraví se 3 % suspenze vyšetřovaných erytrocytů. Do označené zkumavky se přidá diagnostické sérum a připravené vyšetřované erytrocyty a to v množství, které doporučuje výrobce diagnostika. Dle doporučení výrobce se nastaví take inkubační čas a teplota. Hodnotí se získané reakce. 25

Hodnocení výsledků: Provádí se podle doporučení, které je uvedeno v příbalovém letáku daného diagnostického sera hodnocením viditelné aglutinace. 5.1.8 Eluční test Při elučním testu dochází k uvolnění vazby mezi antigenem a protilátkou. Uvolněná protilátka přechází do elučního roztoku, ve kterém ji lze prokázat a specifikovat. Rozlišuje se několik technik eluce např. tepelná eluce, mražená eluce, mikrovlny. Chemicky je možné vazbu mezi antigenem a protilátkou narušit např. změnou ph, působením organických rozpouštědel. 1. 2. 3. 4. Pracovní postup při eluci teplem: Sediment erytrocytů se 3x propere ledovým izotonickým roztokem NaCl a centrifuguje 3 minuty při 3000 otáčkách. Supernatant se odstraní. K sedimentu erytrocytů se přidá stejné množství izotonického roztoku NaCl, inkubace 10 minut při 56 C. Centrifugace v předehřátých zkumavkách 3 minuty při 3000ot. Eluát (bez erytrocytů) se přenese do zkumavky. Provede se vyšetření eluátu na přítomnost protilátek screeningovým testem nebo identifikace protilátky. Hodnocení výsledků: Hodnocení je shodné s hodnocením při vyšetření antierytrocytárních protilátek. 5.2 Další vyšetřovací metody 5.2.1 Vyšetření mateřské krve pomocí DNA analýzy Tato metoda je jedna z nejnovějších pro určení fetálního genotypu. Používá se nejčastěji pro stanovení RhD, ale lze jí použít i pro jiné krevní skupiny. Její velkou předností je, že se jedná o neinvazivní proces. Vyšetření se provádí pomocí PCR v reálném čase na DNA izolované z mateřské plazmy, kdy se detekují paternální alely, které nenese matka. Vyšetření se provádí u aloimunizovaných těhotenství s rizikem HON, zvláště při zjištěné heterozygocii pro antigen u otce. 26

V prvním kroku se odebere vzorek matčiny krve, z něhož se izoluje DNA plodu. DNA v matčině plazmě je tzv. směsnou a fetální DNA se v ní vyskytuje ve velmi nízkých koncentracích. Takto izolovanou DNA se naamplifikuje a určí se genotyp plodu. obr. PCR in real time Tato neinvazivní metoda se již dnes v některých zemích provádí rutinně (např. Velká Británie, Francie, Nizozemí). Zavedena je i v České republice. Vyšetření lze provést již od 10. týdne gravidity z 10 ml nesrážlivé periferní krve těhotné ženy. 5.2.2 Vyšetření plodové vody - amniocentéza Amniocentéza je metoda, která se používá pro získání plodové vody. Z ní se dá určit mnoho důležitých parametrů (stanovit karyotyp plodu, biochemická vyšetření, stanovit genotyp), ale z hlediska problematiky HON bývala důležitá k získání hodnoty bilirubinu a zhodnocení plicní zralosti plodu. Plodová voda je získána tenkou aspirační jehlou, která se za kontroly ultrazvuku zavede přes abdominální stěnu a dělohu do děložní dutiny. Koncentraci bilirubinu (a tím i stupeň intrauterinní hemolýzy) měříme spektrofotometricky při 450nm. Hodnotu zaznamenáváme do semilogaritmického grafu a porovnáváme se stářím obr. Amniocentéza gestace 27

(hodnota bilirubinu má v různém stáří gestace různý klinický význam). Grafy, které v tomto případě používáme, jsou tzv. Lileyův a nebo novější Queenanův graf. obr. Queenanův graf Pokud by kvůli hrozícímu HONu mělo dojít k předčasnému porodu, je velice důležitá plicní zralost plodu. Plicní sklípky jsou v průběhu těhotenství zkolabované a bez vzduchu. Po prvním nadechnutí musí sklípky zůstat roztažené. K tomu je zapotřebí látka, která zabraňuje opětovnému kolabování, tzv. surfaktant (směs lipidů, proteinů a karbohydrátů např. lecitin, sfyngomyelin, fosfatydilglycerol). Tento surfaktant se však vyvíjí až v pozdním stádiu těhotenství (mezi 34. a 37. týdnem) a je produkován fetálními plícemi. Aby u předčasného porodu nedošlo k syndromu dechové tísně (respirační distress syndrome), používá se amniocentéza ke stanovení hladin složek surfaktantu, tzn. ke kvantifikaci fosfatidylglycerolu, určení poměru lecitin/sfyngomyelin. 28

5.2.3 Vyšetření pupečníkové (umbilikální) krve - kordocentéza Kordocentéza se používá k odběru pupečníkové krve. Punkce pupečníkové žíly se provádí jehlou přes břišní a děložní stěnu, stejně jako amniocentéza, za kontroly ultrazvuku. Odebírají se přibližně 2 3 ml krve, obvykle po 20. týdnu gestace. V diagnostice HON slouží pupečníková krev ke stanovení hemoglobinu, hematokritu, počtu retikulocytů, bilirubinu a pro přímý antiglobulinový test. Je velice přínosným ukazatelem hemolýzy, avšak výkon je provázený velkým rizikem možných komplikací spojených s úmrtím plodu (např. trombóza pupečníku). Orientačně hodnoty hemoglobinu v pupečníku ve vztahu k HONu (nutno přepočítat dle stáří gestace): Mírná anemie Hb 120g/l Středně těžká anemie Hb 70 120g/l Těžká anemie Hb méně než 70g/l obr. kordocentéza 5.2.4 Ultrasonografické vyšetření Pomocí ultrazvuku vyšetřujeme u plodu velikost sleziny a jiných orgánů, přítomnost tekutiny v dutině břišní a jednou z nejnovějších ultrazvukových metod, Dopplerovou technikou, je měření rychlosti toku v arteria cerebri media. Tato metoda je ideálním pro včasnou detekci anemie u plodu. Mozková céva může být totiž snadno prostorově zobrazena pomocí barevného dopplerovského vyšetření. Zvýšený srdeční výdej a snižující se viskozita krve vedou u anemického plodu ke zvýšení průtokové rychlosti krve, kterou lze ultrazvukem monitorovat a zobrazit. Vyšetření může být prováděno od 18. týdne těhotenství, po 35. týdnu však již není diagnosticky přínosné. Výsledky tohoto vyšetření jsou udávány v násobcích mediánu (tzv. MOM). Výhodou metody je, že se jedná o neinvazivní a velmi spolehlivé vyšetření. obr. Měření rychlosti průtoku arterie cerebri dítěte 29

6. Profylaxe Jak již bylo zmíněno, hlavním rizikem aloimunizace je vznik hemolytického onemocnění plodu a novorozence. Proto je velice důležité aloimunizaci předcházet. Současná profylaxe je omezena pouze na Rh(D) HON, pro jiné typy HON neexistuje. Základem této prevence je cílené vyhledávání pacientek, které jsou vhodnými kandidátkami pro imunoprofylaxi a vlastní parenterální podání anti-d IgG profylaktické protilátky (RhIg). Dalším krokem, který se uplatňuje v prevenci aloimunizace žen, je podání výhradně Rh(D) negativních transfuzních přípravků obsahujících erytrocyty ženám, které jsou Rh(D) negativní. Erytrocyty, transfundované Rh(D) negativním ženám ve fertilním věku, by také neměly exprimovat antigen c a antigen K1. Správná indikace k podání RhIg je velice důležitá. Podání RhIg v nevhodnou dobu nebo v nedostatečném množství nemusí dostatečně chránit před aloimunizací. Pokud je novorozenec Rh(D) pozitivní, podává se jeho Rh(D) negativní matce, u které nebyla zjištěna protilátka anti-d, do 72 hodin po porodu standardní dávka 250-300 µg (podaná dávka dostačuje pro kompenzaci běžného fetomaternálního krvácení, tzn. 10 µg RhIg stačí přibližně na 1 ml fetální krve). Přibližně u 0,1 % porodů však překračuje FMK množství 30 ml. V těchto případech je nutné podat větší množství anti-d protilátky. V některých zemích se provádí rutinní poporodní screening na FMK u všech žen pomocí kvalitativního testu s ovčími rozetami a při pozitivitě i kvantitativní Kleihauer Betkeho test. Na základě jeho výsledku se opakovaně podá odpovídající množství RhIg. 30 obr. mechanizmus profylaxe

Profylaktická anti-d se podává těhotné ženě také prenatálně, např. v případech: Ukončené těhotenství (z jakéhokoliv důvodu) po 8. týdnu Intrauterinní úmrtí plodu Silné krvácení Úrazy břicha Obrat plodu zevními hmaty Mimoděložní těhotenství Invazivní dg. zákroky odběr choriových klků, kordocentéza, amniocentéza 31

7. Statistická část V imunohematologické laboratoři Transfuzního oddělení a krevní banky FN Brno bylo v roce 2006 provedeno celkem 14 358 vyšetření těhotných žen. Všechny ženy měly vyšetřené nepravidelné protilátky screeningovým testem. Z uvedeného počtu vyšetření byly pouze u 2 % vyšetřených nalezeny protilátky proti erytrocytům. Statistická část je zaměřená na tuto malou skupinu imunizovaných pacientek. Rozlišuje jednotlivé typy protilátek a uvádí jejich procentuální zastoupení. Malý koláčový graf na screening protilátek pozitivní vs. negativní (tzn.98 % negativní, 2 % pozitivní). Pozitivní screening při vyšetření protilátek byl u 2 % pacientek, tj. u 290 žen. Při došetření těchto 290 vzorků, tj. při identifikaci protilátek v séru pomocí dg. panelových erytrocytů, bylo 68 vyšetření negativních (nepotvrdil se nález protilátky), dalších 95 vyšetření bylo typických pro nález nespecifických protilátek (nevýznamných pro HON), u 15 vyšetření byly zjištěny protilátky, které nebylo možné specifikovat (neměly význam pro HON) a zbývajících 112 vyšetření bylo charakteristických pro konkrétní, specifickou protilátku. Mezi těmito specifickými protilátkami převažovaly z protilátek s klinickým významem protilátky anti-d, anti-cw, anti-e a anti-c. Kromě nich byly v obdobném rozsahu zastoupené také klinicky nevýznamné protilátky anti-m a anti-lea. 32

V tabulce a následně v grafu jsou uvedeny jednotlivé protilátky, jejich číselné a procentuální zastoupení a souvislost s HON. Rozdělení původně (při screeningu) pozitivních protilátek po identifikaci: Negativní 68 24 % Nespecifické protilátky 95 33 % Protilátky bez specificity 15 5 % Specifické 112 38 % Sloupcový graf Ke vztahu k HONu mají největší vztah některé protilátky specifické. Tabulka nám udává procentuální zastoupení těchto protilátek ve vztahu ke všem protilátkám. Graf ukazuje množství v procentech v rámci pouze specifických protilátek. anti-d 17 % anti-k 1,03 % anti-e 3,4 % anti-d+c 1,37 % anti-cw 4,48 % anti-c 1,03 % anti-m 3,7 % anti-le(a) 3,7 % anti-le(b) 0,68 % 33

anti-le(a+b) 0,34 % anti-p1 0,34 % anti-s 0,34 % AIHA 0,34 % Koláčový graf specifických protilátek. 34

8. Závěr V této práci byla popsaná problematika erytrocytární aloimunizace těhotných žen od příčin a mechanizmu vzniku imunizace přes rizika související s imunizací, byl uvedený algoritmus a způsob imunohematologického vyšetřování imunizovaných těhotných s rizikem HON a byla podaná informace i o jiných typech vyšetření. Jak je z práce patrné, existuje řada diagnostických postupů a způsobů, které pomáhají sledovat stav matky i plodu a existují možnosti, jak léčebně i preventivně při projevech hemolytického onemocnění zasáhnout. Zdravotní péči o aloimunizovanou těhotnou ženu zajišťuje tým zdravotníků různých profesí, spolupráce gynekologů s imunohematology však může být považovaná za zásadní. 35

Seznam použité literatury EVA TESAŘOVÁ A KOLEKTIV. Vybrané kapitoly - transfuzní lékařství a imunohematlogie. Transfuzní oddělení a KB FN Brno, 2007. Gynekologie po promoci, červenec/srpen 2006, ročník 6, číslo 4. Medical Tribune cz. Část: Boj s Rh inkompatibilitou by mohl být brzy mnohem snazší. Přednášky imunohematologie a transfuzního lékařství FN Brno (v rámci bakalářského studia). Technical Manual of the American association of blood banks. 1985 ISBN 0-915355-06-X. Mollison s blood transfusion in clinical medicine. Blackwell Publishing Company 2005 ISBN 978-0-632-06454-0 GEOFF DANIELS, Human blood groups. Blackwell Publishing Company 2002 ISBN 0-632-056460 Calda P, Žižka Z., Řežábek K., Mašata J., Bendl J.: Diagnostika a terapie plodu ohroženého Rh imunizací. Čs. Gynek 1993; 58:278-282 Goach A., Parker J., Wray J., Qureshi H.: Guideline for blood grouping and antibody testing in pregnancy. British Committee for Standards in Haematology, 2006. www.bchguidelines.com. Laboratorní postupy v imunohematologii TO a KB FN Brno. http://www.neonatology.org/classics/mj1980/ch07.html http://www.gyne.cz/clanky/2001/601cl3.htm http://www.emedicine.com/med/topic3529.htm#targeta http://www.emedicine.com/ped/topic959.htm 36

http://www.medscape.com/viewarticle/442196 http://www.drzdravicko.cz/main/drdefault.aspx?template=thealth. ascx&phcontent=articleshow.ascx&catid=29&lngid=0&artid=165 http://www.pubmedcentral.nih.gov/pagerender.fcgi?artid=1911951&pageindex=1# page http://en.wikipedia.org/wiki/hemolytic_disease_of_newborn http://en.wikipedia.org/wiki/hydrops_fetalis http://en.wikipedia.org/wiki/hemolytic_disease_of_the_newborn_%28anti- Kell%29 http://en.wikipedia.org/wiki/kernicterus http://en.wikipedia.org/wiki/neonatal_jaundice http://en.wikipedia.org/wiki/hemolytic_disease_of_the_newborn_%28abo%29 http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043n.pdf http://www.zdravcentra.sk/cps/rde/xbcr/zcsk/gpp_4-2004_04_c4.pdf http://tbn0.google.com/images?q=tbn:9hy39t5tzd2asm:http://www.nlm.nih.gov/ medlineplus/ency/images/ency/fullsize/1062.jpg http://tbn0.google.com/images?q=tbn:dmfgq4brd3bg1m:http://www.pennhealth. com/health_info/pregnancy/graphics/images/en/19175.jpg http://tbn0.google.com/images?q=tbn:9imfrbnwu22qom:http://osulibrary.oregonstate.edu/specialcollections/coll/pauling/blood/pictures/people/people-landsteiner.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1c/coombs_test_schematic.png/350px-coombs_test_schematic.png 37

http://tbn0.google.com/images?q=tbn:a38fe1ip2gmfzm:http://www.nlm.nih.gov/ medlineplus/ency/images/ency/fullsize/17170.jpg http://images.google.com/images?q=tbn:ohqmevw0qza7lm:http://www.olympusamerica.com/dsg_section/images/prod_assets/top_product_heads/1008_header. jpg http://tbn0.google.com/images?q=tbn:u_is7ppsxpb9vm:http://www.walgreens. com/library/graphics/images/en/17173.jpg http://www.walgreens.com/library/graphics/images/en/17092.jpg http://images.picsearch.com/is?cqoazxoolrjjrxw0nbpvypcqxx6ikx7fbnw a6_lpxx0 http://images.google.com/images?q=tbn:qndcypw1tiwmjm:http://ghr.nlm.nih. gov/handbook/illustrations/igg.jpg http://images.picsearch.com/is?bj1dwjmvvdn-hqi08jc_bdhh45q-dneqrk_ FCnw-wUs 38