Kvalitativní analýzy v klinické biochemii Metody kvalitativní analýzy jsou založeny obvykle na chemické reakci určované látky s činidlem. Látka se dokazuje vznikem charakteristického zbarvení roztoku, vznikem sraženiny, zákalu, fluorescence či plynného produktu. Kvalitativní důkaz (průkaz) látky hledá pouze odpověď zda je hledaná látka přítomna či ne. Tedy odpověď zní pouze ano (pozitivní) nebo ne (negativní). Typickými příklady jsou průkazy gravidity nebo dusitanů v moči, či průkaz okultního krvácení ve stolici. Semikvantitativní vyšetření vypovídá už také o množství hledané látky. Výsledek se hodnotí pomocí arbitrárních jednotek (0, 1, 2, 3, 4). Někde můžeme vidět i hodnocení na kříže, případně pro průkaz na hranici meze detekce označení stopa. Obvykle se jedná o subjektivní vizuální hodnocení. Je ovšem možné i objektivní hodnocení pomocí reflexní fotometrie a někdy se místo arbitrárních jednotek používá interval ohraničený kvantitativními hodnotami koncentrace. V kvalitativní a semikvantitativní analýze využíváme nejčastěji proužky (tedy prostředí celulózových nebo skleněných vláken se sofistikovaně umístěnými suchými reagenciemi). Funkce proužků pro základní vyšetření moče suchá činidla analyzovaný roztok (moč, krev, sérum nebo plazma) je aplikován na povrch pevné fáze difunduje do její matrice a přitom rozpouští suché činidlo, které je v matrici dispergováno rozpuštěné činidlo reaguje s analyzovanou látkou za vzniku barevného produktu výsledné zbarvení na povrchu pevné fáze je sledováno vizuálně nebo instrumentálně
Moč se vyšetřuje proužkem, který může mít řadu různých reagenčních políček. Výroba matrice jednotlivých reagenčních políček je na následujícím schématu. Technologie impregnace vláken 1. sušárna 2. sušárna Nezpracovaná matrice Matrice se suchým činidlem 1. impregnační stanice 2. impregnační stanice Technologie výroby je poměrně složitá zejména u vláken s několika vrstvami, protože je nutné zajistit, aby rozpouštědlo činidla, kterým se nanáší další vrstva, nerozpustilo činidlo z předchozí vrstvy. Také je nutné zvládnout technologii rovnoměrné vysušení vláken po impregnaci. Konstrukce proužků pro základní vyšetření moče
Proužky pro základní vyšetření moče je třeba chránit před vlhkostí, nepřiměřeným teplem a světlem, ale také nemrazit. Proužek se ponoří na 1 2 s do moče tak, aby byla pokryta všechna reagenční políčka. Výsledky se odečítají po 30 s. Tato doba by měla být poměrně přesně dodržována. Některé barevné reakce na políčku nejsou příliš spolehlivé (např. důkaz bílkoviny) a pozitivity bývají ještě potvrzovány barevnými nebo srážecími reakcemi v kapalném prostředí ve zkumavce. Aby byl popis základního vyšetření moče dobře srozumitelný, budeme popisovat analytické reakce na jednotlivých políčkách proužků a jako doplněk uvedeme reakci ve zkumavce, pokud se v praxi provádí. Průkaz glukózy Glukóza je nejvíce semikvantitativně vyšetřovaným analytem v moči. Reagenční políčko pro důkaz glukózy je impregnováno enzymy glukózaoxidázou a peroxidázou. Dalším reaktantem je buď je o-toluidin (následně oxidovaný na modrozelenou Schiffovu bázi) nebo 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin. V první ranní moči můžeme prokázat glykosurii již při koncentraci glukosy > 0,8 mmol/l. Falešnou negativitu může způsobit kyselina askorbová (vitamin C), která je akceptorem kyslíku. Nejčastěji se vyskytuje ve větším množství v moči těhotných. Podobně reagují redukující látky: salicyláty, homogentisová kyselina, DOPA (dihydroxyfenylalanin) aj.
Průkaz ketolátek Ketolátky v moči představuje aceton a kyselina acetoctová. Principem Legalovy (Rotherovy) reakce je průkaz ketoskupiny (z moče) nitroprussidem sodným v silně alkalickém prostředí hydroxidu sodného (imobilizovány na políčku). Zbarvení reakčního pole se mění podle množství ketonů od bezbarvého přes krémové, růžové až do temně fialového. Mez detekce ketonů je přibližně 50 mg/l. Moč obsahující pigmenty nebo metabolity levedopa (dihydroxyfenylalanin) může poskytovat falešně pozitivní výsledky. Průkaz bílkovin
Bílkoviny není ideální označení pro příslušné reagenční políčko. Většina reagenčních proužků totiž detekuje albumin a reakce bývá negativní v přítomnosti ostatních proteinů, např. Bence-Jonesovy bílkoviny; odezva na globuliny je podstatně slabší ve srovnání s albuminem. Metoda je založena na využití tzv. proteinové chyby indikátoru ph. Políčko je impregnováno tetrabromfenolovou modří pufrovanou na ph 3,0. V nepřítomnosti albuminu je proužek žlutý. Albumin (jeho aminoskupiny) poskytuje s barvivem komplex a barva políčka se mění přes žlutozelenou v zelenou až modrozelenou. Tato reakce probíhá při ph < 3,5 a okyselení moče je zajištěno pufrem z impregnace políčka. Citlivost metody se pohybuje mezi 0,15 až 0,2 g/l. Je-li moč alkalická (ph 8,0), musí se okyselit zředěnou kyselinou octovou na ph 5 6 a analýzu je třeba zopakovat s novým proužkem. Při důkazu albuminu interferují chininové a cholinové preparáty. Falešně pozitivní výsledky se objevují při kontaminaci moče vaginálním nebo uretrálním sekretem, je-li moč silně alkalická nebo když je odběrová nádobka kontaminována dezinfekčními prostředky či saponáty. Semikvantitativní důkaz albuminu proteinovou chybou indikátoru není dostatečně spolehlivý a proto se pozitivní reakce ještě potvrzuje důkazem močové bílkoviny ve zkumavce. Nejoblíbenější konfirmační důkaz je srážecí reakce bílkovin pomocí několika kapek 20 % kyseliny sulfosalicylové. Je možné použít i jiných srážecích postupů (kyselina trichloroctová). Z barevných reakcí se někdy využívá reakce s pyrrogalolovou červení. Semikvantitativní určení ph moče
ph moče určujeme pomocí reagenčního políčka obsahujícího tři indikátory: bromthymolovou modř, fenoftalein a methylovou červeň. Prolínáním barev těchto indikátorů lze získat široké spektrum barevných odstínů od oranžové pro kyselou moč, přes žlutou, zelenou až k modré pro alkalickou moč. Zkušený pracovník je schopen odečíst ph s přesností ± 0,5 jednotky v intervalu ph 4 9. Průkaz bilirubinu Bilirubin v moči představuje pouze konjugovaný bilirubin (mono- nebo diglukuronid), neboť jen konjugovaný bilirubin je ve vodě (moči) rozpustný. Bilirubin se prokazuje kopulací s diazotovaným dichloranilinem v silně kyselém prostředí za vzniku červeného až červenofialového zbarvení indikačního políčka. Za normálních okolností je bilirubin v moči negativní. Pozitivní reakce na bilirubin v moči se objevuje při koncentraci konjugovaného bilirubinu v krvi > 30 µmol/l. V moči prokážeme obvykle koncentrace > 9 µmol/l. Falešně pozitivní reakce bývá způsobena některými léčivy, které jsou v kyselém prostředí červené (např. fenazopyridin). Moč nesmí být vystavena přímému slunečnímu světlu, aby nedošlo k oxidaci bilirubinu, což by mělo za následek falešně nižší nález. Při vyšší koncentraci kyseliny askorbové nebo dusitanu v moči ztrácí reakce citlivost.
Průkaz urobilinogenu Urobilinogen se prokazuje na podobném principu jako bilirubin. Jen se používá jiný typ diazoniové soli (4-methoxybenzendiazoniumfluoroborát), která je specifická vůči urobilinogenu. Jelikož detekční limit 7 µmol/l je asi v polovině normálního rozmezí urobilinogenu v moči, bývají často tyto proužky po reakci s močí bledě růžové. Při pozitivní reakci ovšem proužky bývají červené. Falešně pozitivní reakci působí léky, které barví moč na červeno. Stání na slunečním světle působí oxidaci urobilinogenu a falešné snížení nálezu, rovněž použití formaldehydu (stabilizátor moče) likviduje urobilinogen. Průkaz krve
Krev se dokazuje reakcí hemoglobinu z erytrocytů, které jsou na proužku lyzovány. Využívá se katalytických vlastností hemoglobinu (podobně reaguje myoglobin) při oxidaci barevného indikátoru (3,3,5,5 -tetramethylbenzidin) organickým hydroperoxidem (2,5- dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid). Vzniká modrozelené zbarvení, které původně žlutý proužek zbarví zeleně. Proužek s reagenciemi je potažený síťovinou obsahující jodid draselný, který oxiduje kyselinu askorbovou, je-li ve vzorku moče přítomna. Detekční limit proužku je přibližně 5 erytrocytů/µl. Vysoké koncentrace dusitanů mohou reakci zpomalit. Falešně nižší výsledky může způsobit konzervace moče formaldehydem a také vysoká proteinurie (> 5 g/l). Falešně pozitivní výsledky jsou v případě nedokonalého vymytí čistících oxidačních prostředků při opakovaném používání sběrných nádobek. Průkaz leukocytů Leukocyty vylučované do moče jsou téměř výhradně granulocyty. Dokazují se reakcí při které se štěpí ester indoxylu esterázou z granulocytů (nebo histiocytů v případě zánětů) na indoxyl. Volný indoxyl poskytuje s diazoniovou solí fialové zbarvení. Mez detekce reakce se pohybuje v intervalu 10 25 leukocytů/µl, přičemž > 20 leukocytů/µl je považováno za
patologickou koncentraci. Reakce je hrubě orientační a v žádném případě nenahrazuje mikroskopické vyšetření. Nicméně výhodou esterázové reakce je to, že jsou prokázány nejen neporušené, ale také lyzované leukocyty, které v mikroskopu nevidíme. Reakce je vysoce specifická. Průkaz dusitanů Dusitany jsou detekovány Griessovou reakcí. Využívá se toho, že jakýkoliv dusičnan přítomný v moči je baktériemi redukován na dusitan. Aromatický amin s dusitany v prostředí kyselého pufru poskytuje diazoniovou sůl, která s kopulačním činidlem (3-hydroxy-1,2,3,4- tetrahydrobenzochinolinem dává červené azobarvivo. Intenzita zbarvení (růžová až fialová) odpovídá koncentraci dusitanů, ale nic neříká o závažnosti infekce. Mez detekce reakce je 11 µmol/l. Reakce je pozitivní zejména v přítomnosti gramnegativních bakterií. Vzorky nutno vyšetřit do 4 h od odběru, jinak je nebezpečí vnější bakteriální kontaminace. Falešně negativní výsledky jsou při vysoké diuréze, hladovění, parenterální výživě a dietě bez rostlinného podílu.
Specifická hmotnost Specifická hmotnost se prokazuje semikvantitativním testem. Nalezené hodnoty jsou v intervalu 1,003 1,040 a podávají informaci o koncentraci iontů v moči. Ionty vytěsňují z komplexu protony a ph na proužku se měří směsí tří indikátorů popsaných u měření ph. Při nízké koncentraci iontů je zbarvení tmavomodré a se zvyšující koncentrací iontů se mění na zelené až žlutozelené. Reakci neruší neionogenní látky (glukosa, močovina). Proteinurie > 1 g/l způsobuje falešně vyšší hodnoty specifické hmotnosti naměřené na proužku. Také je-li ph moče 7 je změřený výsledek vyšší o 0,005. Morfologická analýza moče Morfologická analýza moče má několik variant, ale pro všechny je společné, že mikroskopické vyšetření se má provádět v čerstvé moči, ne starší než 1 h. V krajním případě lze použít moč po konzervaci ještě 3 h po odběru, ale buněčné elementy mohou být už z části degradované vlivem nepříznivého ph nebo nízkého osmotického tlaku, je-li hustota moče < 1,010. K vyšetření se používá tzv. středního proudu první ranní moče. Obvykle se používá desetkrát koncentrovaný močový sediment. Zahuštění se dosáhne odstřeďováním moče 5 min při 400 g. Výskyt elementů se hodnotí ve 20 polích sklíčka při zvětšení 200x. Vyšetření bez zahuštění má smysl pouze k orientačnímu sledování akutních infekcí močových cest s výraznou leukocyturií a ke sledování hematurií. Obvykle se provádí morfologická analýza bez barvení, ale je možné také sediment vybarvit podle Sternheimera-Malbina roztokem genciánové violeti a safraninu O. V mikroskopu můžeme vidět v kyselé moči amorfní cihlově zbarvené uráty, či hnědé hrudky bilirubinu. V alkalické moči lze rozeznat amorfní uhličitan vápenatý a bezbarvé fosforečnany. V krystalické formě v kyselé moči bývá žlutá až hnědá kyselina močová, bezbarvý šťavelan vápenatý a urátová drť. V alkalické moči je možné spatřit krystaly nahnědlého močanu amonného, zelenavě fluoreskujícího fosforečnanu hořečnato-amonného a vápenatého a bezbarvého uhličitanu vápenatého. Můžeme identifikovat různé druhy válců (hyalinní, voskové, epiteliální, erytrocytární, leukocytární, granulované, dlaždicovité), buňky (erytrocyty, leukocyty, spermie) a parazity. Spolehlivé odečítání morfologického nálezu vyžaduje určitou zkušenost. Čtenáře odkazujeme na vynikající atlas močového sedimentu OKB MN Ostrava http://sediment.d2.cz/.
Analýza konkrementů (kamenů) chemicky je stále méně používaná. Jedná se o kapkové reakce na průkaz vápníku, hořčíku, amonných iontů, oxalátů, fosfátů, kyseliny močové a cystinu. Vzhledem k tomu, že počet požadavků na tyto analýzy je malý, jeví se výhodnější tyto analýzy soustředit na několik vybraných pracovišť a provádět je spolehlivěji pomocí infračervené spektroskopie (popřípadě pomocí rentgenové difrakce - v ČR se tento postup používá zcela výjimečně). Příprava pro analýzu v infračervené oblasti vyžaduje promíchat 1 mg konkrementu s 300 mg bromidu draselného v achátovém moždíři a ze směsi vylisovat tabletu, která se pak měří ve vlnovém rozsahu 5 40 µm (podle zadání a typu přístroje). Konkrementy se někdy skládají z několika příměsí a rozborem IR spekter můžeme prokázat přítomnost minoritní složky v množství 15 20 %. Těhotenské testy Kontrolní proužek Absorbující políčko Důkazový proužek Nitrocelulosová membrána Políčko se zlatým konjugátem Políčko pro vzorek Těhotenské testy obvykle využívají principu sendvičové imunoanalýzy. Na membráně je nanesen konjugát myší monoklonální protilátky proti choriogonadotropinu (hcg) s koloidním zlatem (způsobuje červené zbarvení v testovací a kontrolní zóně). Po ponoření do moče po značku na proužku reaguje hcg (je-li přítomen) ze vzlínající moče se značenou protilátkou a vzniklý imunokomplex se v testovací zóně projeví jako červený proužek. Nezreagovaný konjugát je imunochromatograficky unášen do kontrolní zóny, kde je imobilizována kozí protimyší protilátka a tam vznikne další červený proužek (bez ohledu na přítomnost hcg). Místo koloidního zlata se může použít i jiné barvivo, ale koloidní zlato je obecně v imunochemických kvalitativních testech nejvíce používáno.
Průkaz drog Průkaz drog nebo jejich screening v moči nebo slinách používá podobný postup. Imunochromatografický nebo chromatografický princip je využíván i při aplikaci tenkovrstvé chromatografie v kvalitativní analýze drog. C-reaktivní protein C-reaktivní protein (CRP) je často sledovaný parametr bakteriálního zánětu v séru. K jeho důkazu je široká nabídka kvalitativních testů. Mez detekce je v případě aglutinačních testů kolem 10 mg/l CRP. Imunochemický princip vychází z latexových částic potažených protilátkou, které v přítomnosti CRP aglutinují (zákal) až precipitují (sraženina).
Okultní krvácení Okultní krvácení ve stolici je kvalitativním testem, kdy se prokazuje hemoglobin podobným způsobem jak byl popsán u proužků pro stanovení hemoglobinu v moči. Při testu Haemoccult se v případě pozitivní reakce objeví do 30 s od přidání činidla modré zbarvení, zatímco u negativního testu se modré zbarvení neobjeví. Kvalitativní a semikvantitativní testy tvoří menší část laboratorních testů v klinické biochemii. Nicméně se stále rozšiřuje nabídka, která umožňuje provádět analýzy jak dalšímu zdravotnickému personálu, tak také mimo oblast zdravotnictví (domácnosti, policie, sportovní střediska aj.). V těchto případech testy patří do dynamicky rostoucí oblasti testů v místě péče (POCT point of care test), ale používání kvalitativních testů na klinických odděleních v nemocnici může být někdy problematické, např. důkaz troponinu (test není v kvalitativní verzi zcela jednoznačný u mikroinfarktů). Literatura 1. Jacobs, D. S., Demott, W. R., Finley, P. R., Horvat, R. T., Kasten, B. L., Tilzer, L. L. Laboratory test handbook. Hudson (Cleveland) : Lexi-comp Inc, 1994, 1513 p., ISBN 0-916589-12-9. 2. Schneiderka, P., Bezdíčková, D., Jirsa, M. et al. Stanovení analytů v klinické biochemii 1. část. Praha : Karolinum, 1999, 153 s., ISBN 80-7184-761-5. 3. Táborský, O., Štern, P., Valovičová, E., Bezouška, K., Novák, M. Metody klinické biochemie. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, 1990, 160 s.