Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně METODIKA VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM) Vypracovaná jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Autoři: Mgr. Světlana Sýkorová, CSc., Ing. Jana Bradová, Ing. Josef Fér,CSc. Říjen 2005
METODIKA VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM) Vypracovaná jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Světlana Sýkorová a kol. sykorova@vurv.vz Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha 2005 http://www.vurv.cz Text: 2005 S. Sýkorová, J. Bradová, J. Fér Foto: 2005 S. Sýkorová, J. Bradová Grafická úprava: 2005 M. Sýkora, L. Štočková Vydáno bez jazykové úpravy ISBN: 80-86555-74-7
Obsah: I. Úvod... 4 II. Schéma postupu při určení odrůdy brambor pomocí hlízových proteinů 5 III. IV. Metodika elektroforézy proteinů a enzymů hlíz brambor podle Bundessortenamt (1996) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) 6 Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro analýzu esteráz, peroxidáz a patatinů v bramborách podle Bundessortenamt (2002) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) zahrnuje i modifikaci metody UPOV (1996). 10 V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů. 26 VI. Příklad postupu při odrůdové identifikaci odrůdy ze vzorků konzumních brambor... 29 VII. Použitá literatura... 31
I. Úvod Odrůdy rostlin jsou jedním z nejvýznamnějších faktorů rozvoje zemědělství. Stále zvyšovanou výnosovou schopností, odolností k chorobám a škůdcům a zvyšovanou hodnotou pro pěstování i zpracování umožňují zemědělcům i zpracovatelům dosahovat lepších hospodářských výsledků. Ochrana práv šlechtitelů k odrůdám je v České republice zajišťována podle zákona č.132/1989 Sb., o ochraně práv k novým odrůdám rostlin a plemenům zvířat, který upravuje práva a povinnosti vznikající z vytvoření nových odrůd a z jejich obchodního využívání. Systém ochrany odrůd formulovaný tímto zákonem odpovídá principům Mezinárodní úmluvy na ochranu nových odrůd rostlin z roku 1961 podle UPOV (Union Internationale pour la Protection des Obtentios Vegetales), ve znění jejích revizí z roku 1972 a 1978 (Souček, 1997). Brambory jsou velmi důležitou a v lidské výživě nenahraditelnou plodinou a potravinou, kde význam odrůdy jako nositele kvality je nesporný. Brambory se stávají potravinou v okamžiku, kdy jsou uváděny do oběhu k přímému prodeji spotřebiteli a vztahuje se na ně ustanovení Zákona o potravinách ( Zákon č.110/97 Sb.). U konzumních brambor pozdních musí být uveden varný typ, odrůda, a při dovozu země původu. U konzumních brambor raných též barva dužniny, tvar hlíz a popř. označení drobné (Pivoňková, 1997). Ve světle těchto skutečností je zcela jasná nutnost identifikace, verifikace a možnosti kontroly pravosti odrůdy u brambor. Metoda identifikace odrůd založená na morfologických znacích rostlin a hlíz není příliš objektivní pro jejich závislost na podmínkách prostředí. Za nejvhodnější pro identifikaci odrůdy jsou pokládány stabilní znaky hlíz, z nichž byly již v 60.letech úspěšně využity jako genetické markery rozpustné proteiny, enzymy, případně jejich kombinace. Elektroforéza v polyakrylamidovém nebo škrobovém gelu v alkalickém i kyselém prostředí je vhodnou a účinnou metodou pro separaci těchto proteinů. Elektroforetické spektrum proteinů se neměnilo v hlízách skladovaných po několik měsíců v chladu ani v bramborách pěstovaných na různých lokalitách a v různých ročnících (Desborough,1983). V 60. a 70.letech byly intenzivně studovány možnosti identifikace odrůd brambor pomocí elektroforetických spekter proteinů a enzymů, např. Šašek (1974a,b) charakterizoval řadu československých i zahraničních odrůd brambor na základě polymorfismu proteinů po elektroforéze ve škrobovém gelu postupem (Paulik,1957). Mezi odrůdami byly zjištěny charakteristické rozdíly, avšak teplota skladování ani různé dávky gama záření neměly na bílkovinný komplex brambor podstatnější vliv. Katalog evropských odrůd brambor založený na variabilitě elektroforetických spekter proteinů a esteráz vypracovali Stegemann a Loeschcke (1977). Důležitost hlízových proteinů pro objektivní identifikaci odrůd brambor je nesporná, elektroforetická spektra těchto proteinů a enzymů jsou značně odrůdově specifická a geneticky podmíněná, nezávislá na ročníku ani lokalitě pěstování a nemění se ani po několik měsíců v dormantních hlízách skladovaných v chladu. Metody identifikace a verifikace odrůd brambor se mohou velmi vhodně uplatnit jak ve šlechtění, tak i v kontrole odrůdové pravosti,např. při obchodování s konzumními bramborami (Sýkorová, 1999). Předkládaná metodika identifikace odrůd brambor vychází z postupů používaných k tomuto účelu v SRN a přijatých jako oficiální metody UPOV. Jedná se o dva postupy (UPOV 1996 a UPOV 2002). V řadě případů jsme ověřili a částečně modifikovali oba postupy a získané poznatky uvádíme v předkládané metodice. I. Úvod 4
II. Schéma postupu při určení odrůdy brambor pomocí hlízových proteinů Pro konkrétní uplatnění metody elektroforézy hlízových proteinů brambor k identifikaci odrůdy, případně ke kontrole odrůdové deklarace v obchodní síti je možno použít již v praxi ověřený metodický postup (byl vypracován SZPI pro konkrétní kontrolní akci v roce 2001 a 2002). Metodický pokyn obsahoval následující části: cíl kontrolní akce, objekt kontrolní akce, termín (kdy bude uskutečněna), rozsah (počet kontrolovaných vzorků a jejich zajištění), velikost vzorku a metoda odběru, pověření laboratoře, která provede elektroforetické analýzy, postup při předávání vzorku do pověřené laboratoře, určení předpisu pro hodnocení (např. zjištění právní kvalifikace klamavého označení odrůdy, vzorec pro rozhodovací kriterium, zda vzorek vyhovuje nebo nevyhovuje, způsob předávání výsledku zadavateli (formulář protokolu o analýze), využití výsledků analýz (sankce, aj.). Dále uvádíme schéma konkrétního postupu. Do laboratoře byly denně inspektory SZPI dodány 4 vzorky po 15 hlízách s předávacími protokoly. Všechny vzorky měly odrůdovou deklaraci. Hlízy byly jednotlivě zváženy a jejich hmotnost zaznamenána. V tomto případě byla aplikována metoda elektroforézy hlízových proteinů podle UPOV (1996) viz kapitola III. Laboratoř provedla následující den elektroforetické analýzy dodaných 60 hlíz (spolu s etalonovými vzorky příslušných odrůd) a po barvení gelů přes noc byla v následujícím dnu spektra vizuálně vyhodnocena porovnáním s etalonovým spektrem příslušné odrůdy, zjištěn počet vyhovujících a nevyhovujících hlíz (odpovídajících či neodpovídajících odrůdové deklaraci), vypočtena hodnota koeficientu Q podle vzorce Q = (n+1). m CO / (n+1). m CO + (99-n). m DO, kde n je počet hlíz cizí odrůdy, m CO - průměrná hmotnost hlíz cizí odrůdy, m DO - průměrná hmotnost hlíz deklarované odrůdy. Vzorek byl označen za nevyhovující, když Q > 0,02 a závěr zněl: Ve vzorku byla zjištěna přítomnost cizích odrůd větší než 2% hmotnosti Současně byla uvedena hodnota koeficientu Q. V případě, kdy u vzorku, ve kterém byla určena směs odrůd, nebylo možné určit deklarovanou odrůdu, byla za deklarovanou odrůdu považována odrůda s nejvyšším % zastoupením. Vzorek byl označen za vyhovující, když Q 0,02 a závěr zněl: (v případě, že referenční odrůda byla k dispozici): Ve vzorku byla zjištěna přítomnost cizích odrůd menší nebo rovna 2% hmotnosti a v případě že referenční odrůda nebyla k dispozici: Byla zjištěna odrůdová jednotnost analyzovaného vzorku (množství cizích odrůd bylo menší nebo rovno 2% hmotnosti), majoritní odrůdu nebylo možno identifikovat vzhledem k chybějící referenční odrůdě. (Posledně uvedený případ nastával při kontrole odrůdové jednotnosti raných brambor z dovozu, kdy se velmi často jednalo o odrůdy, které nebyly v ČR registrovány.) Další návaznost využití výsledků (sankce, informace pro veřejnost, atd. ) kontrolní akce již byly zcela v kompetenci SZPI. II. Schéma postupu 5
III. Metodika elektroforézy proteinů a enzymů hlíz brambor podle Bundessortenamt (1996) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) 1. Extrakce proteinů hlíz 1.1. Extrakční roztoky Roztok Složky Navážka na 100 ml vodného roztoku Roztok Siřičitan sodný (Na 2 SO 3 5,00 g K1 Dvojsiřičitan sodný ( Na 2 S 2 O 5 ) 3,75 g Roztok Sacharoza 50,00 g K2 Amidočerň 10B extra 0,03 g Poznámka denně čerstvý denně čerstvý 1.2. Příprava extraktů proteinů Hlízy brambor necháme při 20 C dobře promrazit (minimálně 16 hod.) a při pokojové teplotě roztát. Do 6,5 ml centrifugačních zkumavek dáme 0,1 ml roztoku K1. Hlízy omyjeme pod tekoucí vodou, osušíme a rozkrojíme. Hlízovou vodu (4-5 ml) tlakem vymačkáme do centrifugačních zkumavek a promícháme skleněnou tyčinkou s roztokem K1. Centrifugujeme 15 minut při 3 000 ot. min. -1 při 10 C, odebereme 4 ml čirého supernatantu, který přeneseme do další zkumavky s 1,0 ml roztoku K2 a opět skleněnou tyčinkou promícháme. Extrakt potom rozdělíme do tří 1,5 ml kyvet se šroubovacím uzávěrem a zmrazíme. K elektroforéze použijeme buď čerstvý nebo rozmrazený extrakt, který pro snadnější nanášení napipetujeme do mikrotitrační destičky (vždy po 1 aliquotu - 150 µl do jamky). 2. Elektroforéza hlízových proteinů 2.1. Pufry Pufr Složky Podíl na 1 l vodného Poznámka roztoku Pufr 1 TRIS 30,26 g skladovatelný Kys. boritá 36,60 g Pufr 2 Pufr 1 125,00 ml denně čerstvý Pufr 3 Pufr 1 158,00 ml denně čerstvý III. Metodika elektroforézy (1996) 6
2.2. Gelové roztoky Zásobní roztoky Zásobní roztok 40% AA 2 %BIS 2 % Pers. Složky Množství Poznámka Akrylamid 400 g Destilovaná voda do 1000 ml velmi toxický!! Methylen BIS Akrylamid 20,0 g Destilovaná voda do 1000 ml velmi toxický!! Persíran amonný 0,2 g (Ammonium Persulfate) denně čerstvý Destilovaná voda do 10 ml Rozpis složek pro různé objemy gelu Složky Objem gelu 40 ml 80 ml 100 ml 120 ml 150 ml 200 ml pufr 3 30,32 ml 60,64 ml 75,8 ml 90,96 ml 113,7 ml 151,6 ml AA 40% 4,68 ml 9,36 ml 11,7 ml 14,04 ml 17,55 ml 23,4 ml BIS 2% 4,96 ml 9,92 ml 12,4 ml 14,88 ml 18,6 ml 24,8 ml siřičitan sodný 0,0165 g 0,033 g 0,042 g 0,05 g 0,063 g 0,084 g DMAPN* 0,2 ml 0,4 ml 0,5 ml 0,6 ml 0,75 ml 1,0 ml pers. 2% 0,76 ml 1,52 ml 1,9 ml 2,28 ml 2,85 ml 3,8 ml * 3 (Dimethylamino) propionitril 2.3. Barvicí roztoky Barvicí roztoky Složky Množství Barvicí roztok 1 Coomassie Blue G 250 Coomassie Blue R 250 Dest. voda 250 mg 750 mg 100 ml Barvicí roztok 2 Barvicí roztok 3 Barvicí roztok 4 Kyselina trichloroctová Kyselina octová Dest. voda Methanol Barvicí roztok 1 Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O Dest. voda Na H 2 PO 4 x 1 H 2 O Dest. voda 120 g 140 ml 1600 ml 300 ml 50 ml 53,7 g do 1 l 20,7 g do 1 l III. Metodika elektroforézy (1996) 7
2.4. PAGE hlízových proteinů 2.4.1.Přístroje Vertikální elektroforetický přístroj (např. OWL Scientific, USA) pro 2 gely nebo jiný přístroj na vertikální elektroforézu v polyakrylamidovém gelu. Zdroj stejnosměrného proudu nejméně na 400 V a 150 ma Kryostat (chladicí termostat ) Kývací třepačka Chlazená odstředivka Mraznička Analytické váhy 2.4.2.Příprava gelu - 2 plotny (60x110x1 mm) Připravit 80 ml gelu podle rozpisu v kapitole 2.2. (složky přidávat v pořadí uvedeném v tabulce). Roztok ihned plynule nalít do kyvet a gely opatřit vzorkovými hřebeny. Polymerace trvá 3-4 minuty. Gely před použitím necháme ještě nejméně 30 minut dále polymerovat. 2.4.3. Nanášení vzorků Nanášíme pomocí dávkovače Hamilton (50 µl) 6 µl extraktu (viz 1.2.) do každé kapsy v gelu. 2.4.4. Podmínky dělení pro 2 paralelní gely Elektrodový pufr: Pufr 2 Teplota: 7-10 C v elfo prostoru (zajistí se pomocí kryostatu) Proud: zpočátku 78 ma (10 minut), potom nastavit 140 ma, ustaví se podmínky cca 90 ma a 400 V (30 minut) Napětí: ohraničit na max.400 V Výkon: ohraničit na max. 100 W Směr dělení: od katody (-) k anodě (+) Označení čela: pruh amidočerni Doba dělení: cca 10 + 30 min., po těchto 40 minutách ukončit dělení 2.4.5. Barvení proteinů Na 2 gely: 350 ml barvicího roztoku 2; 2 hodiny kývat a potom nechat stát přes noc. K odbarvení promýt 2 x 30 minut ve vodě a 1x 30 minut v 2% glycerinu. Gely vysušit na vzduchu mezi 2 vrstvami celofánu (zvlhčeném 2% glycerinem). 2.5. Hodnocení výsledku elektroforézy 2.5.1. Vizuální Získaná elektroforetická spektra hlízových proteinů lze již v nevysušeném stavu vyhodnotit vizuálně porovnáním s etalonovým spektrem deklarované odrůdy. Při tomto způsobu hodnocení můžeme rozhodnout, které hlízy odpovídají a které neodpovídají odrůdové III. Metodika elektroforézy (1996) 8
deklaraci. U neodpovídajících hlíz však nemůžeme určit, které odrůdě náležejí. Uschované usušené gely lze archivovat pro případnou kontrolu správnosti vizuálního vyhodnocení, případně je vyhodnotit pomocí softwaru Sortbest. 2.5.2. Hodnocení pomocí počítačového programu Sortbest V rámci výzkumného projektu je postupně vytvářen registr denzitogramů registrovaných odrůd brambor. Po vložení denzitogramu neznámé odrůdy program porovnáváním s již uloženými údaji vybírá nejpodobnější denzitogram, podle hodnoty koeficientu podobnosti lze potom s určitou pravděpodobností přiřadit neznámému vzorku odrůdovou deklaraci. Příklady identifikace neznámé odrůdy pomocí záznamů uložených v počítačové knihovně programu Sortbes. III. Metodika elektroforézy (1996) 9
IV. Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro analýzu esteráz, peroxidáz a patatinů v bramborách podle Bundessortenamt (2002) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) zahrnuje i modifikaci metody UPOV (1996) 1. Počet hlíz na test: - pro DUS ( odlišnost, uniformitu a stálost) : 10 hlíz - pro kontrolu identity: 4 hlízy Hlízy musí být zralé, sklizené ihned po zaschnutí listů, při skladování v rozmezí teplot 4 až 10 C mohou být použity nezávisle na sezóně, dokud nezačnou klíčit. 2. Přístroje a zařízení: mrazák (minimálně na -20 C) chlazená centrifuga kryostat třepačka (kývačka) na ploché gely vertikální elektroforetický přístroj pro 2 gely* zdroj stejnosměrného proudu alespoň na 400 V a 150 ma** běžné laboratorní vybavení (analytické váhy, lednice, automatické pipety, dávkovače Hamilton), aj. *Může být použit jakýkoli vhodný přístroj pro elfo, jestliže umožňuje udržování konstantní teploty gelů. Tloušťka gelu by neměla být vyšší než 1,5 mm. ** Zdroj proudu by měl umožnit nastavení konstantního proudu nebo konstantního napětí. 3. Chemikálie: Všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší 3.1. Chemikálie pro extrakci proteinů Amidočerň 10 B Siřičitan sodný Na 2 SO 3 Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 Sacharóza 3.2. Chemikálie pro elektroforézu 40% Akrylamid roztok (AA) (velmi toxický!!) (AA) Persíran amonný (APS) 2% Methylen Bis - akrylamid roztok (BIS) (velmi toxický!!) Kyselina boritá Bromfenolová modř (BPB) 3- (Dimethylamino) propionitril (DMAPN) Ethanol IV. Metodika elektroforézy (2002) 10
Glycin Kyselina chlorovodíková Sacharóza N,N,N N - Tetramethylethylenediamine (TEMED) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) 3.3. Chemikálie pro barvení proteinů Aceton Coomassie Blue G 250 Coomassie Blue R 250 Dianisidin-2HCl (extrémně toxický!!) Hydrogenfosforečnan dvojsodný dodekahydrát (Na 2 HPO 4. 12 H 2 O) Fast Blue RR Salt Ledová kyselina octová Glycerol 30% Peroxid vodíku Methanol 1-Naftylacetát Dihydrogenfosforečnan sodný monohydrát (NaH 2 PO 4. 1 H 2 O) Kyselina trichloroctová (TCA) 4. Roztoky 4.1.Extrakční roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka 4.1.1 Extrakční roztok A Siřičitan sodný Na 2 SO 3 Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 Deionizovaná voda 5,00 g 3,75 g do 100 ml 4.1.2. Extrakční roztok B 4.1.3 Extrakční roztok C Sacharóza Amidočerň 10B Deionizovaná voda Extrakční roztok A Extrakční roztok B 500 g 0,3 g do 1000 ml 10 ml 100 ml lze skladovat při 6 C lze skladovat při 6 C denně čerstvý IV. Metodika elektroforézy (2002) 11
4.2. Pufry a gelové roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka TRIS 30,26 g Gelový pufr 4.2.1.1 Kys.boritá 36,6 g zásobní Deionizovaná voda do 1000 ml 4.2.1.2 40% roztok AA 4.2.1.3 2 % roztok BIS 4.2.1.4 2 % roztok APS 4.2.1.5 Elektrodový pufr AA Deionizovaná voda BIS Deionizovaná voda APS Deionizovaná voda Pufr 4.2.1.1 Deionizovaná voda 40 g do 100 ml 2 g do 100 ml 1 g do 50 ml 125 ml 875 ml Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok Denně čerstvý Denně čerstvý 4.2.2. Pufry a roztoky pro PAGE ph 8,9 pro patatiny a (peroxidázy) č. Roztok Složky Množství Poznámka TRIS 75,4 g Upravit ph na Pufr na dělicí 4.2.2.1 Deionizovaná voda do 1000 ml 8,9 přidáním (spodní) gel 4.2.2.2 Pufr na zaostřovací (horní) gel 4.2.2.3 Zaostřovací gel TRIS Bromfenolová modř Deionizovaná voda Pufr 4.2.2.2 40% AA 2 % BIS Deionizovaná voda 16 g 100 mg do 1000 ml 280 ml 45 ml 73 ml 150 ml 80 g HCl Upravit ph na 6,7 přidáním HCl Sacharóza 4.2.2.4. 40 % AA viz 4.2.1.2 komerční rozt. 4.2.2.5 2 % BIS viz 4.2.1.3 komerční rozt. 4.2.2.6 2 % APS viz 4.2.1.4 denně čerstvý 4.2.2.7 10 % ethanol 4.2.2.8 Zásobní el. pufr 4.2.2.9 Elektrodový pufr ethanol Deionizovaná voda TRIS Glycin Deionizovaná voda Pufr 4.2.2.8 Deionizovaná voda 10 ml do 100 ml 5,2 g 3,5 g do 1000 ml 50 ml do 1000 ml denně čerstvý IV. Metodika elektroforézy (2002) 12
4.3. Barvicí roztoky pro patatiny, peroxidázy a esterázy č. Roztok Složky Množství Poznámka 4.3.1 Zásobní roztok Coomassie Br. Blue G 250 Coomassie Br. Blue R 250 deionizovaná voda 0,25 g 0,75 g do 100 ml 4.3.2 4.3.3. 4.3.4. 4.3.5. Barvicí roztok pro patatiny Barvicí pufr A pro esterázy Barvicí pufr B pro esterázy Barvicí pufr pro peroxidázy Dianisidinový roztok 4.3.6. 2% glycerin TCA Ledová kys. octová vodovodní voda methanol roztok 4.3.1 Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O deionizovaná voda NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O deionizovaná voda Dianisidin-2HCl deionizovaná voda Glycerol deionizovaná voda 240g 280 ml 3 300 ml 600 ml 100 ml 53,7 g do 1000 ml 20,7 g do 1000 ml 1 g do 100 ml 20 g do 1000 ml míchat alespoň 1 hodinu důkladně; protřepat před použitím může být skladován při 6 C 1 týden 5. Pracovní postup 5.1.Příprava vzorků Hlízy zmrazit na -20 C ( minimálně 16 hod.) a pak nechat rozmrazit při pokojové teplotě. Pro analýzu každé hlízy je potřebná 2 ml centrifugační kyveta obsahující 0,4 ml extrakčního roztoku C (4.1.3). Rozmrzlé hlízy se rozříznou a vymáčknou. 1,5 ml šťávy se zachytí do výše uvedené kyvety a promíchá s extrakčním roztokem C (míchání). Dále se centrifuguje 15 minut při 3 000 ot.min -1 a 10 C. Supernatanty se přenesou do nové prázdné centrifugační kyvety a zmrazí se pro pozdější provedení elfo. Před začátkem elfo se extrakty rozmrazí a alikvoty (150 µl) se přenesou do jamek mikrotitrační destičky. IV. Metodika elektroforézy (2002) 13
5.2. Příprava gelů 5.2.1. Příprava gelů pro PAGE ph 7,9 pro esterázy (patatiny rychleji) Rozpis složek pro různé objemy gelu Složky Objem gelu 40 ml 80 ml 100 ml 120 ml 150 ml 200 ml pufr 3 30,32 ml 60,64 ml 75,8 ml 90,96 ml 113,7 ml 151,6 ml AA 40% 4,68 ml 9,36 ml 11,7 ml 14,04 ml 17,55 ml 23,4 ml BIS 2% 4,96 ml 9,92 ml 12,4 ml 14,88 ml 18,6 ml 24,8 ml siřičitan sodný 0,0165 g 0,033 g 0,042 g 0,05 g 0,063 g 0,084 g DMAPN* 0,2 ml 0,4 ml 0,5 ml 0,6 ml 0,75 ml 1,0 ml pers. 2% 0,76 ml 1,52 ml 1,9 ml 2,28 ml 2,85 ml 3,8 ml - Sestavit suché a čisté gelové kazety - Připravit cca 100 ml gel. roztoku (T: 4,9%; C: 4,7%): - Po pečlivém rozpuštění a rozmíchání 108 mg siřičitanu sodného v 55 ml deionizované vody se přidají následující roztoky: 30 ml 4.2.1.1. (zásobní gel. pufr) 30 ml 4.2.1.2 ( 40% AA) 30 ml 4.2.1.3 (2% BIS) Polymerace se nastartuje přidáním: 1,2 ml DMAPN 4,5 ml 4.2.1.4 (2% APS) - Po zamíchání se gely pečlivě nalijí, aby se zabránilo tvorbě bublinek vzduchu. Hřebeny pro vytvoření kapes v gelu se vloží do kapalného gelu a polymerace probíhá při pokojové teplotě alespoň 15 minut. Hřebeny se potom vyjmou. Vzniklé kapsy se promyjí a naplní elektrodovým pufrem (4.2.1.5). 5.2.2. Příprava gelů pro PAGE ph 8,9 pro peroxidázy a patatiny - Sestavit suché a čisté gelové kazety - Každý gel se skládá z dělicího a zaostřovacího gelu - Příprava cca 100 ml dělicího gelu (T: 5,5%; C: 4,4%) - Následující jednotlivé složky jsou přidávány za pomalého míchání: 60 ml gel. pufru 4.2.2.1 14 ml deionizované vody 14 ml 4.2.2.4. (40 % AA) 13 ml 4.2.2.5 (2% BIS) Polymerace se nastartuje přidáním: 100 μl TEMED 6 ml 4.2.2.6 (2% APS) IV. Metodika elektroforézy (2002) 14
- Gely se pečlivě nalijí tak, aby se netvořily bublinky vzduchu a polymerace probíhá alespoň 15 minut při pokojové teplotě. Gelové kazety by neměly být zcela naplněny, aby byl prostor pro 14 mm vrstvu zaostřovacího gelu. Povrch gelu se pečlivě opatrně převrství 10% ethanolem (4.2.2.7) pomocí injekční stříkačky. Po skončení polymerace (po cca 30 minutách) se povrch gelu omyje deionizovanou vodou a osuší filtračním papírem. - Příprava zaostřovacího gelu: Přidávat a pomalu míchat: 15 ml roztoku 4.2.2.3 (obsahuje 4.2.2.2, 40% AA, 2% BIS,. deion. voda, sacharoza) 60 μl TEMED 375 μl 4.2.2.6 (2% APS) - Gely se pečlivě nalijí tak, aby se nevytvořily vzduchové bublinky, vloží se hřebeny pro tvorbu jamek a polymerace probíhá alespoň 15 minut. Potom se hřebeny opatrně vyjmou a jamky v gelu se promyjí a naplní elektrodovým pufrem 4.2.2.9 5.3. Nanášení vzorků - Pro elektroforézu esteráz a peroxidáz je nanášeno do každé jamky 6 12 μl extraktu z mikrotitrační destičky ( v závislosti na velikosti jamek). - Pro elektroforézu patatinů je nanášeno do každé jamky 3-6 μl extraktu z mikrotitrační destičky ( v závislosti na velikosti jamek). 5.4. Elektroforéza 5.4.1. Podmínky PAGE ph 7,9 pro esterázy Elektrodový pufr 4.2.1.5 Proud /2 gely (11 cm šířka, 1 mm tloušťka) 10 minut 78 ma, 30 minut 100 ma* Napětí max. 400 V Teplota 5 15 C Směr migrace do katody (-) k anodě (+) Migrační vzdálenost dráha za 40 minut * hodnoty 100 ma není dosaženo, protože napětí je limitováno na 400 V 5.4.2 Podmínky pro PAGE ph 8,9 pro patatiny (a peroxidázy) Elektrodový pufr 4.2.2.9. Proud /2 gely (11 cm šířka, 1 mm tloušťka) 80 ma (průchod horním gelem), potom 160 ma** Napětí max. 300 V Teplota 5 15 C Směr migrace do katody (-) k anodě (+) Migrační vzdálenost 6 cm bromfenolová modř (čelo) od rozhraní gelů ** hodnoty 160 ma není dosaženo, protože napětí je limitováno na 300 V IV. Metodika elektroforézy (2002) 15
5.5. Barvení: 5.5.1. Barvení esteráz: Gely z PAGE ph 7,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky se směsí 120 ml barvicího pufru A (4.3.3.) a 80 ml barvicího pufru B (4.3.4.) a inkubují se na kývací třepačce.50 mg 1-naftylacetátu se rozpustí ve 3 kapkách acetonu a ředí se deionizovanou vodou, dokud se roztok nezakalí. Roztok se přidá k pufrům a gelu. 100 mg Fast Blue RR se suspenduje v 5 ml acetonu a zředí 5 ml deionizované vody. Tento roztok se přidá ihned k pufrovým roztokům a gelu. Doba barvení se pohybuje mezi 15 a 40 minutami. Potom jsou gely inkubovány na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále se gely inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu. 5.5.2. Barvení peroxidáz: Gely z PAGE ph 8,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky naplněné 200 ml barvicího pufru (4.3.4.) a inkubují se na kývací třepačce. Přidá se 10 ml roztoku dianisidinu (4.3.5.). Po 30 sec se reakce nastartuje přidáním 260 μl 30% H 2 O 2. Doba barvení se pohybuje mezi 10 a 20 minutami. Pro odbarvení se gely inkubují na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále se inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu. 5.5.3. Barvení patatinů: Gely z PAGE ph 8,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky naplněné 300 ml barvicího pufru (4.3.2.) a inkubují se na kývací třepačce 3 hodiny. Gely se ponechají v barvicí lázni přes noc bez třepání. Pro odbarvení se gely inkubují na třepačce 2 x 30 minut s vodovodní vodou a dále se inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu. 6. Identifikace proteinových alel. 6.1. Identifikace alel esterázových isoenzymů Pozice jednotlivých esterázových isoenzymů jsou kalibrovány odrůdou Sieglinde. Odrůda Sieglinde vykazuje 3 pruhy s vysokou enzymatickou aktivitou v následujících pozicích: 75 + 77 + 88. Esterázové ieoenzymy bramborových hlíz jsou vysoce polymorfní. Pro jasnou interpretaci byly zymogramy rozděleny do čtyř bloků pruhů. Bloky pruhů Est 1 a Est 4 mají jen nízkou enzymatickou aktivitu. Bloky pruhů Est 2 a Est 3 mají naopak vysokou enzymatickou aktivitu. Pro stanovení odlišnosti, jednotnosti a stálosti (DUS) jsou používány pouze bloky Est 2 a Est 3. IV. Metodika elektroforézy (2002) 16
Obrázek IV.1.: Esterázy odrůdy Sieglinde a přehled bloků Est 1, Est 2, Est 3 a Est 4 Brambory jsou vegetativně množený tetraploidní druh. Proto je třeba očekávat mnoho heterozygotních genotypů. Jednotlivé genotypy mohou být rozlišeny pouze podle genové dávky. Takové genotypy se často nacházejí v Est 2 a Est 3. Kombinace mezi null- alelou a aktivními alelami a genotypy majícími plnou dávku genu vykazují identické pruhy. Proto jsou vyhodnoceny jako identické. Est Est Př. Zn. Es Est Př. odrůdy Zn. Est Est Př. Zn. 2 3 odrůdy t 2 3 2 3 odrůdy a o Desirée 4 b o Cleopatra 18 c o Obelix 22 d o Achat 5 d b Vital 23 d c Krometa 19 e o Sibu 20 f o Wali 12 g b Premiere 26 h o Jetta 6 i o Renate 8 i b Selma 7 i c Karakter 15 j o Hansa 1 j b Ute 9 j c Karolin 3 k o Belita 13 k d Junior 17 l o Roxy 16 l c Sieglinde 2 o o Ulla 11 IV. Metodika elektroforézy (2002) 17
6.1.1. Schemata genotypů v rámci lokusu Est 2 Obrázek IV.2.: Schematické znázornění alel v rámci lokusu Est 2 V Est 2 vykazuje většina genotypů 2 pruhy (označené a-1). Byly detekovány genotypy s více než 2 pruhy. Tyto typy mohou být interpretovány jako kombinace dvou genotypů obsahujících dva pruhy. Genotyp Genotyp Př. odrůdy Pozn. Est 2 Est 3 dl o Leyla nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + Est 3: o dl c Aiko nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + Est 3: c jf o Protea Existuje překrytí genových produktů 75 a 77 náležejícím genotypu Est 2: l s genovým produktem náležejícím genotypu Est 1. Proto není možné získat jasnou separaci mezi hybridy typu Est2: l x d a genotypy Est 2:d. Proto genotyp dl a genotyp l nebudou vyhodnoceny jako rozdílné. 6.1.2. Schemata genotypů v rámci lokusu Est 3 Obrázek IV.3.: Schematické znázornění alel v rámci lokusu Est 3 IV. Metodika elektroforézy (2002) 18
(6.2. Identifikace alel peroxidázových isoenzymů) je zde uvedena jen pro úplnost (viz text) Elektroforéza a identifikace peroxidázových isoenzymů nebyla prováděna vzhledem k vysoké toxicitě substrátu pro identifikaci o dianisidinu, který je klasifikován např. podle Katalogu Sigma 2004-2005 Biochemikálie a Reagencie na str. 628 jako probably carcinogenic. Peroxidázové isoenzymy hlíz brambor jsou monomerické enzymy. Pozice jednotlivých isoenzymů jsou kalibrovány odrůdou Amigo. Odrůda Amigo vykazuje dva pruhy 59 + 68. Obrázek IV.4.: Isoenzymy peroxidáz odrůdy Amigo Genotyp Příklad Znač. Genotyp Příklad Znač. a Hansa 1 f Diana 7 b Corine 2 g Thomana 6 c Tomensa 3 h Kanjer 8 d Amigo 4 j 1 e Jetta 5 Obrázek IV.5.: Schematické znázornění alel v rámci peroxidázového lokusu Genotypy označené hvězdičkou vykazují snižující se genovou dávku v jednotlivých peroxidázách. Mohou být interpretovány jako kombinace mezi aktivními alelami a nullalelou. Takové genotypy jsou považovány za genotypy s plnou genovou dávkou. Genotyp j IV. Metodika elektroforézy (2002) 19
dává zymogramy blízké ke genotypu a; takže genotypy a a j nejsou označeny jako rozdílné. Oba genotypy mají tutéž značku :1 6.3.Identifikace alel patatinů Patatiny jsou monomerické peptidové řetězce Tabulka alel patatinů a označení s příklady odrůd Genotyp Příklad odrůdy Genotyp Příklad odrůdy Genotyp Příklad odrůdy 1.01 Secura 4.08 Sommergold 7.08 Adletta 2.01 Erntestolz 4.09 Wali 7.09 Ukama 2.02 Desiree 4.10 Juliver 8.01 Berolina 2.03 Pompadur 4.11 Pepo 8.02 Escort 2.04 Delia 4.12 Saturna 8.03 Darwina 3.01 Quarta 4.13 8.04 Shepody 3.02 Irmgard 4.14 Aiko 8.05 Kardal 3.03 Ulla 4.15 Amigo 8.06 Padea 3.04 Fasan 4.16 8.07 Elles 3.05 Karolin 4.17 Oktan 8.08 Solara 3.06 Gloria 5.01 Belita 8.09 Thomana 3.07 Junior 5.02 Solina 8.10 Karida 3.08 Danva 6.01 Artana 8.11 Vebeca 3.09 Combi 6.02 Quinta 8.12 Arnika 4.01 Indira 7.01 Fausta 8.13 Krometa 4.02 Christa 7.02 8.14 Sirius 4.03 Pia 7.03 Pallina 8.15 Alba 4.04 Rubin 7.04 Grata 8.16 Feska 4.05 Cleopatra 7.05 Atica 9.01 Calla 4.06 Felsina 7.06 Karnico 10.01 Liu 4.07 Cinja 7.07 Franca 10.02 Kranich IV. Metodika elektroforézy (2002) 20
6.3.1.Grupování elfo spekter Patatiny jsou definovány jejich elektroforetickou mobilitou (REM hodnota). Pozice jednotlivých patatinů jsou ilustrovány na příkladu odrůdy Hansa. Obrázek IV.6.: Patatiny odrůdy Hansa Patatiny jsou extrémně polymorfní proteiny. Počet alelických kombinací je vyšší než 80. Proto je grupování patatinových spekter nutné. Patatiny s vysokou mobilitou (REM mezi 33 a 60) jsou použity pro grupování. Tyto patatiny jsou identické s A-, B-, C- a D pruhy podle Stegemanna a Löschke (1976). Tvoří 8 skupin: skupinu 1 skupinu 8. Navíc existují dvě speciální skupiny: skupina 10 je definována přítomností pruhu 36 a skupina 9 je definována absencí B-pruhu. Obrázek IV.7: Schémata jednotlivých skupinových spekter patatinů IV. Metodika elektroforézy (2002) 21
Tabulka: Hodnoty REM v jednotlivých skupinách Hansa Skupina patatinů 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 21 21 21 21 21 21 21 26 26 26 26 26 26 26 26 26 26 26 33 A 33 33 33 33 33 36 43 B 43 43 43 43 43 43 43 43 43 50 C 50 50 50 50 50 50 59 D 59 59 59 59 59 59 6.3.2.Analýza intenzit pruhů Rozdíly v intenzitách pruhů mohou být způsobeny rozdílnou genovou dávkou. Jsou pozorovány v pozicích 15, 21, 26, 31, 33 a 34. Vyskytují se např. v typu 5.01. Obrázek IV.8.: Příklady rozdílů v intezitách pruhů v rámci podskupiny patatinů 5.01 Spektra se liší pouze v intenzitách pruhů hodnocených jako identické. IV. Metodika elektroforézy (2002) 22
6.3.3.Schemata skupin a podskupin spekter Obrázek IV.9.a: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 1 3 Obrázek IV.9.b: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupiny 4 Obrázek IV.9.c: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 5 7 IV. Metodika elektroforézy (2002) 23
Obrázek IV.9.d: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupiny 8 Obrázek IV.9.e: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 9,10 Poznámka ke skupinám 5 8 Pruh 33 je mimořádně intenzivní a překrývá pruh 31; proto pruh 31 není v přítomnosti pruhu 33 vůbec patrný. Platí to i v případě snížené intenzity pruhu 33. IV. Metodika elektroforézy (2002) 24
IV. Metodika elektroforézy (2002) 25
V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů Pro ilustraci uvádíme fotografie získaných elektroforetických spekter níže uvedených registrovaných odrůd brambor a některých etalonových odrůd používaných pro kalibraci spektra. Na první pohled je patrné, že mezi jednotlivými odrůdami jsou dobře rozlišitelné rozdíly. S 112 Sirius Etalony: Ha - Hansa S 113 Symfonia Si - Sieglinde S 114 Tábor Ob - Obelix S 115 Tara S 116 Ukama S 117 Van Gogh S 118 Vilma S 119 - Vladan V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů 26
Získaná elektroforetická spektra jsou na gelech proměřena, vypočteny hodnoty REM, sestavena tabulka hodnot REM a jejich grafické znázornění (schemata). Tímto způsobem je vytvářen celý katalog elektroforetických spekter hlízových proteinů (patatinů) všech registrovaných odrůd brambor. Pro ilustraci uvádíme několik ukázek získaných schemat. S 112 - SIRIUS 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM S 113 - SYMFONIA 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM S 114 - TÁBOR 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM S 115 - TARA 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM S 116 - UKAMA 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů 27
S117 - VAN GOGH 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM S 118 - VILMA 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM S 119 - VLADAN 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 REM V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů 28
VI. Příklad postupu při odrůdové identifikaci odrůdy ze vzorků konzumních brambor V srpnu 2005 byly v supermarketu Delvita zakoupeny balené konzumní brambory rané s odrůdovou deklarací (Marabel a Vivaldi) (obr. 1,2 identifikační štítky na obalových siťkách). Z každé síťky bylo náhodně odebráno po 5 hlízách (metodika UPOV předepisuje analýzu 4 hlíz pro odrůdovou identifikaci). Postupem uvedeným v kapitole IV. byly připraveny extrakty hlízových proteinů a provedena elektroforéza patatinů. Na gel byly společně s testovanými extrakty naneseny i extrakty z etalonů odrůd Marabel a Vivaldi a provedeno vizuální porovnání s testovanými hlízami. Dále byly usušené gely vyhodnoceny pomocí programu Sortbest s cílem identifikovat odrůdu. Získaná elektroforetická spektra jsou zobrazena na obr. 3 a 4. Bylo zjištěno, že v obou případech byla získaná elektroforetická spektra testovaných hlíz zcela shodná s etalonovými spektry příslušných odrůd (Marabel, Vivaldi). Současně bylo zjištěno, že všech 5 testovaných hlíz od každé odrůdy vykázalo rovněž navzájem shodná elektroforetická spektra patatinů, že tedy vzorky byly odrůdově homogenní a odpovídaly odrůdové deklaraci. VI. Příklad postupu při identifikaci odrůdy ze vzorku konzumních brambor 29
Obrázky VI.3 a VI. 4.: Elektroforetické spektrum vzorků zakoupených konzumních brambor s odrůdovou deklarací Vivaldi a Marabel a spektrum etalonových odrůd Vivaldi (S 42) a Marabel (S9) VI. Příklad postupu při identifikaci odrůdy ze vzorku konzumních brambor 30
VII. Použitá literatura Desborough,S.L.: Potato (Solanum Tuberosum L.). S.D.Tanksley,T.J.Orton(Eds.) Isozymes in Plant genetics and breeding, Part B. Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam: 1983, s. 167-188. Paulik,M.D.:. Starch gel electrophoresis in a discontinuous system of buffers. Nature. 180, 1957, s.1477. Pivoňková,V.: Změny v obchodování s konzumními bramborami v souvislosti s platností Zákona o potravinách a tabákových výrobcích. Bramborářství, 1997, 6. Souček, J.: Ochrana odrůd brambor v ČR a uplatňování licenčních poplatků při prodeji certifikované sadby brambor. Bramborářství, 1997, 6. Stegemann, H.- Loeschke,V.: Index of European Potato Varieties. Identification by electrophoretic spectra, National registers, Appraisal of Characteristics, Genetic Data. Mitt.Biol.Bundesanst. Berlin-Dahlem, Heft 168,1976 Stegemann, H.- Loeschke,V.: Das europäische Kartoffelsortiment und seine Indexierung. Potato Res.20, 1977, s.101-110. Sýkorová,S. : Identifikace odrůd brambor (Solanum tuberosum L.) pomocí elektroforézy proteinů a enzymů. Rostl. Výroba,45, 1999: 193-196. Šašek,A.: Elektroforetické rozdíly ve složení bílkovinných komplexů domácích a zahraničních odrůd brambor. Gen. a Šlecht. 10 (3), 1974 b, s 197-206. Šašek,A.: Vliv ozáření a teploty skladování na frakční složení bílkovin brambor. Gen. a Šlecht.10 (3), 1974 a, s.207-212. UPOV TWA 31/6 Bundessortenamt (Rio de Janeiro 2002) Draft test guedelines for potato UPOV, Bundessortenamt, 1996, Draft test guedelines for potato VII. Použitá literatura 31