IMUNOCYTOCHEMICKÁ METODA JEJÍ PRINCIP A VYUŽITÍ V LABORATOŘI Radka Závodská, PedF JU v Českých Budějovicích Imunocytochemická metoda - použítí protilátky k detekci antigenu v buňkách (Imunohistochemie- použítí protilátky k detekci antigenu v tkáních) Princip imunocytochemie fixace proteinu (antigenu) ve tkáních navázání specifické protilátky vizualizace protilátky Co jsou to protilátky Protilátky imunoglobuliny produkované bílými krvinkami B-lymfocyty - pět tříd imunoglobulinů : IgA, IgG, IgD, IgE, a IgM - mají schopnost rozpoznat a navázat se na určitý antigen - součástí imunitního systému Vazba proteinů k jiným molekulám proteiny se mohou vázat selektivně a s velkou afinitou k povrchu jiného proteinu (=ligandu) tvorba mnoha slabých nekovalentních vazeb povrchová kontura ligandu se velmi blízce shoduje s proteinem Nekovalentní vazby - vodíkové můstky: - O -H O = >N H O = atom H mezi dvěma elektronegativními atomy 1
- iontové vazby: + - mezi plně nabitými skupinami nebo skupinami s částečným nábojem - van de Waalsovy síly: na velmi blízké vzdálenosti jsou 2 atomy přitahovány slabou silou, která je dána jejich pohyblivými el. náboji + hydrofobní interakce - hydrofobní skupiny se spojí, aby minimalizovaly svůj kontakt s vodou Vazebné místo - oblast proteinu, která asociuje s ligandem - dutina na povrchu proteinu, která je tvořena specifickým uspořádáním aminokyselin aminokyseliny patří ke vzdáleným oblastem bílkovin, ale dostávají se blízko k sobě, když molekula bílkoviny zaujme svou trojrozměrnou konformaci 2
Molekula protilátky - 2 stejná vazebná místa - smyčky polypeptidového řetězce malá změna délky nebo pořadí aminokyselin velká rozmanitost vazebných míst rozsáhlá řada různých protilátek Molekula protilátky- schéma: Vazba protilátky a antigenu pořadí aminokyselin variabilní domény lehkého nebo těžkého řetězce změněno mutací velká rozmanitost vazebných míst rozsáhlá řada různých protilátek Vznik protilátek vytvářeny v organismu bílými krvinkami - B-lymfocyty klidový B-lymfocyt má v membráně navázané molekuly určitého typu protilátky - tento membránový protein slouží jako receptor pro rozeznání specifického antigenu po navázání antigenu je buňka stimulována k dělení a tvorbě stejného typu protilátky při opakované infekci stejným antigenem je reakce rychlejší 3
Produkce protilátek v laboratorních zvířatech imunizace pokusného zvířete injikací antigenu opakovaná injikace stimulace specifických B-lymfocytů k tvorbě protilátek do krevního oběhu dochází ke stimulaci mnoha různých B lymfocytů jsou namířeny proti různým epitopům určitého antigenu po úspěšné imunizaci se zvířeti odebere sérum obsahující spektrum protilátek proti různým epitopům příslušného antigenu polyklonální protilátky polyklonální protilátky - produkt mnoha různých klonů B-lymfocytů monoklonální protilátky - jediný typ protilátky fúze jediného B-lymfocytu s nádorovou buňkou (B-lymfocyt) hybridní buňka se množí a vylučuje protilátky jediného typu 4
Vizualizace protilátky označení protilátek vhodným markerem lze označit: - primární protilátku reaguje přímo s antigenem (přímá metoda) - sekundární protilátku váže se na primární protilátku ( nepřímá metoda) Přímá metoda vizualizace 5
Nepřímá metoda vizualizace Vysvětlivky: antigeny - A, B primární protilátka Rabbit anti-a - protilátka proti králičímu antigenu A sekundární protilátka - Goat anti-rabbit - protilátka (imunoglobulin Ig G) proti králičí protilátce fluorescenční barvivo - Fluorescent-staining tag (např.cyanin) buňka - Cell Možnosti značení a detekce enzym (enzym křenové peroxidázy, alkalické fosfatázy) optický mikroskop fluorescenční barvivo fluorescenční a konfokální mikroskop koloidní zlato elektronový mikroskop Protilátky s konjugovaným enzymem enzymy po dodání příslušného substrátu tvoří nerospustný barevný produkt např. křenová peroxidáza (HRP) + 3,3 -diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB) vznikne hnědé barvivo nerozpustné ve vodě i alkoholu detekce světelným mikroskopem neurony circadiánních hodin v mozku hmyzu (foto Závodská) 6
Protilátky značené fluorescenčním barvivem fluorofory po ozáření (excitaci) světlem jsou schopny absorbovat světlo určité vlnové délky a následně vyzařovat (emitovat) světlo o delší vlnové délce napr. Cyanin, DAPI, GFP Pigment Dispersní Hormon (PDH) v mozku Drosophila melanogaster (foto Sehadová) Nespecifické imunohistochemické reakce způsobeny vazbou protilátky ke kolagenu či jiným bílkovinám nutno vysytit nespecifická vazebná místa tzv. normálním sérem (ze stejného druhu zvířete jako sekundární protilátka) Kontrola specifity reakce stejný postup pro tkáň, která zaručeně obsahuje a která zaručeně neobsahuje hledaný antigen náhrada primární protilátky kontrolním sérem ze stejného zvířecího druhu (popř. zvířete = preimunní sérum) vysycení primární protilátky antigenem 7
Immunocytochemická metoda a její použití v laboratoři Imunocytochemické šetření lze provádět: v celé části tkáně - tzv. totální preparáty na paraplastových řezech rozdíly: - způsob fixace - délka inkubace s primární i sekundární protilátkou - zalévací média - mikroskopická analýza Imunocytochemie na paraplastových řezech A) Fixace tkání a příprava paraplastových řezů Pitva a fixace tkání - pitva hmyzích tkání ve fyziologickém roztoku (= Ringerův roztok) - fixace v Bouin-Hollande roztoku přes noc ve 4 oc - antigen nesmí být vyplaven a musí být zachovány jeho antigenní vlastnosti Vymytí fixáže z tkání - 70 % etanol Dehydratace tkáně vzestupnou alkoholovou řadou a převedení do rozpouštědla a paraplastu 96% EtOH 100% EtOH chloroform Zalití tkáně do paraplastu Příprava paraplastových bločků na krájení Orientace tkáně na dně bločku (vzhledem k rovině řezu) Polymerizace paraplastu při pokojové teplotě (nejméně 2 hod) Krájení tenkých řezů na mikrotomu 8
Odstranění paraplastu z řezů Xylen- rozpouštědlo paraplastu Sestupná alkoholová řada -převedení do vodního prostředí: 96% EtOH 70% EtOH destil. voda Fosfátový pufr- ph 7.4 B) Imunocytochemie Blokování nespecifických vazebných míst - 10% kozí sérum Aplikace primární protilátky - např. králičí protilátka proti určitému antigenu Inkubace s primární protilátkou - přes noc při 4o C Vymytí primární protilátky -fosfátový pufr - 3 x 10 Aplikace sekundární protilátky - např. kozí protilátka proti králičím IgG Vymytí sekundární protilátky- fosfátový pufr - 3 x 10 min C) Tvorba trvalých preparátů Převedení preparátů z vodního prostředí do organického rozpouštědla přes alkoholovou řadu: 70% EtOH 96% EtOH 100% EtOH xylen Montování preparátů do zalévacího média - např. DPX, kanadský balzám Literární zdroje: Alberts B. a kol.: Základy buněčné biologie, Espero publishing, Ústí nad Labem,2001 Campbell N.A., Reece,J.B: Biology. The Benjamin/Cummings Publishing Copany, Inc., 1996 Závodská R. : Biologie buněk, Scientia, 2006 9
Obrázky v textu o principu imunocytochemie převzaty z Alberts a kol. (2006) 10