ZPŮSOBY IZOLACE VITAMÍNŮ Z LÉČIVÝCH PŘÍPRAVKŮ

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE ZPŮSOBY IZOLACE VITAMÍNŮ Z LÉČIVÝCH PŘÍPRAVKŮ (bakalářská práce) Vedoucí bakalářské práce: Vedoucí katedry: PharmDr. Ludmila Matysová, Ph.D. Prof. RNDr. Petr Solich, CSc.

Poděkování: Tímto chci poděkovat PharmDr. Ludmile Matysové, Ph.D. za její odborné vedení, vstřícnost, trpělivost a pomoc při vypracování této bakalářské práce. 1

Prohlášení: Prohlašuji, že tato bakalářská práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. V Hradci Králové dne 17. srpna. 2010 Blanka Kaluzsná 2

OBSAH 1 SEZNAM ZKRATEK... 5 2 Úvod... 6 3 Cíl práce... 7 4 Vitamín a... 8 4.1 All-trans-retinol... 8 4.2 Funkce vitamínu A... 9 5 Vitamín D... 10 5.1 Funkce vitamínu D... 11 6 Stanovení lipofilních vitamínů... 13 6.1 úvod... 13 6.2 Příprava vzorku... 13 6.2.1 Alkalická hydrolýza... 13 6.3 Extrakce... 14 6.3.1 Způsoby extrakcevitamínů... 15 6.3.2 Superkritická fluidní extrakce (SFE)... 17 6.3.3 Extrakce na pevné fázi (SPE)... 19 6.3.4 Přečištění organického extraktu... 20 7 Chromatografické metody... 21 7.1 Obecný princip chromatografie... 21 7.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)... 22 7.2.1 Mobilní fáze... 22 7.2.2 Stacionární fáze... 23 7.2.3 Vysokotlaká pumpa... 23 7.2.4 Dávkování... 23 7.2.5 Kolona... 23 7.2.6 Detektor... 23 3

7.3 Popis HPLC analýzy... 24 7.3.1 Chromatogram... 24 7.3.2 Příklady analýz HPLC... 25 8 Stanovení vitamínu A metodou HPLC... 26 9 Stanovení vitamínu D metodou HPLC... 27 10 Závěr... 28 11 Citovaná literatura... 29 4

1 SEZNAM ZKRATEK HPLC RBD GLE LLE SLE SFE SPE EDTA RP-HPLC GLC TBME MF vysokoúčinná kapalinová chromatografie retinol vázající protein extrakce plyn kapalina extrakce kapalina kapalina extrakce pevná fáze kapalina superkritická fluidní extrakce extrakce na pevné fázi etylendiamintetraoctová kyselina vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi plynová rozdělovací chromatografie terc-butylmetyleter mobilní fáze 5

2 ÚVOD Vitamíny jsou nepostradatelné organické látky plnící funkci koenzymů v základních biochemických procesech. Neplní funkci energetickou ani stavební, organismus není schopen je sám syntetizovat. Musí být přiváděny do organismu jako takové nebo ve formě provitamínů. Jedná se o nesourodou skupinu látek, které na základě jejich rozpustnosti dělíme do 2 skupin: a) vitamíny rozpustné ve vodě b) vitamíny rozpustné v tucích [1] 6

3 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce bylo vyhledání a popsání postupů, jimiž lze izolovat vitamíny z léčiv. Konkrétně jsem se soustředila na vitamíny A a D, zejména na jejich izolaci a analýzu pomocí HPLC. 7

4 VITAMÍN A Účinnými formami vitamínu A jsou retinol a retinal. Molekula retinolu obsahuje ve své molekule beta-ionový kruh a pět konjugovaných dvojných vazeb, z nichž čtyři jsou v postranním řetězci. Ty pak mohou vytvářet příslušné cis,trans-isomery (celkem 16). Z nich jsou jen dva biologicky účinné a to all-trans a 13-cis,trans-isomer. Strukturně je vitamín A blízký karotenoidům. V organismu vzniká vitamín A štěpením beta-karotenu pomocí enzymu beta-karoten-15,15 -dioxygenasy, která štěpí betakaroten na 2 molekuly retinolu. H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 OH CH 3 Obr. 1 all-trans-retinol CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CHO CH 3 Obr. 2 13-cis,trans-retinol 4.1 ALL-TRANS-RETINOL Retinol vytváří žluté jehlicovité krystaly mastného vzhledu. Je nerozpustný ve vodě a glycerolu, rozpustný v ethanolu, methanolu, chloroformu, etherech a v tucích. Volný retinol snáší zvýšenou teplotu, snadno se inaktivuje kyslíkem, oxidačními činidly a UV-zářením. Oxidace retinolu je urychlována přítomností těžkých kovů, zejména železa a mědi, dále pak peroxidy, které vznikají oxidací nenasycených mastných kyselin. Působením bílého světla na roztoky all-trans-retinolu nebo retinol palmitátu v hexanu dochází k jejich izomeraci na cis-isomery. V aplikační formě se musí retinol stabilizovat. Provádí se obdukce koloidním vodným roztokem želatiny a glukosy. Tím dojde k ochraně vitamínu A proti oxidaci. Mezinárodní jednotka IU vitamínu A je definována jako 0,344 mg krystalického all-trans-retinol acetátu a odpovídá právě 1 IU vitaminu A. Pro přepočet na IU platí [7]: 8

1 IU vitamínu A odpovídá 0,300 mg all-trans retinolu 0,344 mg all-trans-retinol acetátu 0,550 mg all-trans-retinol palmitátu 4.2 FUNKCE VITAMÍNU A Vitamín A je přijímán v potravě přímo nebo ve formě provitamínu, např. β - karotenu, který se ve střevě štěpí působením β-karoten-15,15 -dioxygenasou na dvě molekuly retinalu. Ty jsou poté redukovány na all-trans-retinol a esterifikovány dlouhým řetězcem mastné kyseliny (hlavně kyseliny palmitové). Po absorpci je retinol transportován přes chylomikrony do jater, kde je buď skladován jako retinyl ester, nebo je znovu transportován do plazmy jako volný alkohol navázaný na specifickou bílkovinu RBP (retinol vázající protein). Ta umožňuje transportovat retinol do potřebných tkání [3]. Koncentrace vitamínu A v plazmě se pohybuje v rozmezí 2,40-3,23 μmol.l-1. Vitamín A je potřebný pro normální růst a rozvoj. Hraje důležitou roli v mnoha metabolických procesech. Je potřebný pro vidění, má úlohu v reprodukci (syntéze pohlavních hormonů, spermatogenezi, v početí a formování placenty), v genetické regulaci, v regulaci buněčného dělení, při zvýšení imunitní odpovědi, přestavbě kostí a ve všech stádiích vývoje plic [3]. 9

5 VITAMÍN D Pod pojem vitamín D zařazujeme kalciferoly - tedy látky steroidního charakteru, které vykazují antirachitický charakter. Pro praxi mají význam hlavně dva zástupci - vitamín D 3 nebo-li cholekalciferol (9,10-seko- 10(19),5,7 - dehydrocholestatrien-3β-ol) a vitamín D 2 nebo-li ergokalciferol (9,10-seko- 10(19),5,7,22 -ergostatetraen-3β-ol). CH 3 C D HO A CH 2 Obr. 3 Vitamin D 2 (ergokalciferol) CH 2 HO Obr. 4 Vitamin D 3 (cholekalciferol) Vitamíny D vznikají z prekurzorů působením UV záření. Prekurzory nazýváme provitamíny D. Mezi provitamíny D patří cyklopentaperhydrofenanthreny s C-18 a C- 19 methylovými skupinami, C-3 hydroxylovou skupinou a C-5(6) systémem konjugovaných dvojných vazeb v kruhu B, které se vzájemně odlišují uspořádáním a délkou postranního řetězce v poloze C-17. Provitamín D 2 je ergosterol(obr.6) a provitamín D 3 je 7-dehydrocholestetrol (obr.7). 10

CH 3 HO Obr. 5 Ergosterol (provitamin D 2 ) HO Obr. 6 7-dehydrocholesterol (provitamin D 3 ) 5.1 FUNKCE VITAMÍNU D Vitamín D stimuluje absorpci vápníku ve střevě a v tomto smyslu nejúčinnější je forma 1,25-hydroxycholekalciferol. Vitamín D také zvyšuje střevní absorpci fosforu a zvyšuje jeho přestup ze střevního lumen do oběhu. V proximální části trávicího traktu je takto řízená absorpce fosfátů nezávislá na absorpci vápníku. Dalším důležitým mechanizmem, ve kterém hraje podstatnou roli vitamín D je řízení vstřebání fosfátu a vápníku v distálním tubulu ledviny. Vitamín D účinněji ovlivňuje zpětné vstřebání fosfátu, než vápníku. Další cílovou tkání, kde vitamín D působí je kost. Ovlivňuje ukládání vápníku do kosti, její formování a mineralizaci. Vitamín D stimuluje resorpci kosti zprostředkovanou osteoklasty a tento proces je zprostředkován hlavně formou 1,25-dihydroxycholekalciferolem. Nepostradatelná je role vitamínu D v řízení rovnováhy vápníku a fosfátu. Vitamín D vyrovnává kolísání hladin vápníku v krvi tím, že reguluje vstup a výstup vápníku třemi cestami: střevem, ledvinami a kostí. Málo jsou známy i ostatní vztahy mezi vitamínem D a některými dalšími minerály. Nedostatek zinku, např. snižuje hladinu vitamínu D a odpověď na nízký příjem kalcia. Deficit železa snižuje nejenom vstřebání tuku a vitamínu A, ale také zhoršuje vstřebání vitamínu D. Důležitá je pravděpodobně i interakce vitamínu D, hořčíku, vápníku a bóru. Nedostatek bóru v potravě zvyšuje demineralizaci kosti, zejména pokud je nedostatek hořčíku. 11

Vedle klasické úlohy vitamínu D v řízení kalciového a fosfátového metabolizmu má ještě mnoho dalších funkcí, které běžně nejsou uváděny, ale mají význačnou důležitost pro život člověka. Patří mezi ně účinek na diferenciaci buněk, výstavbu buněčných membrán, svalové funkce, imunitu a vliv na funkci centrálního nervového systému [4]. 12

6 STANOVENÍ LIPOFILNÍCH VITAMÍNŮ 6.1 ÚVOD Stanovení lipofilních vitamínů zahrnuje několik zásadních kroků - přípravu vzorku, alkalickou hydrolýzu vzorku, extrakci vitamínů z hydrolyzátu, přečištění extraktu a samotné analytické stanovení. Lipofilní vitamíny jsou z chemické stránky nestabilní sloučeniny a dochází ke ztrátě jejich biologické aktivity, která je iniciována nebo katalyzována přítomností hydroxyperoxidů, vzduchem, světlem, vlhkostí, přítomností minerálních kyselin, těžkých kovů a dalšími oxidanty. Všechny tyto faktory jsou příčinou vysokých hodnot mezilaboratorní směrodatné odchylky stanovení těchto vitaminů [11]. 6.2 PŘÍPRAVA VZORKU Při zpracování vzorku je třeba se vyhnout přehřátí vzorku během jeho homogenizace. Vzorek se homogenizuje na částice o velikosti 0,5 mm a menší. Pokud možno, vzorek se nemele, ale pouze se roztírá v porcelánové misce. Homogenizace a úprava vzorku se děje těsně před jeho zmýdelněním a dalším zpracováním, aby se zabránilo ztrátám vitamínů [11]. 6.2.1 ALKALICKÁ HYDROLÝZA Vitamín A nemůže být kvantitativně extrahován samotnými organickými rozpouštědly z fortifikovaných forem vitamínu A (kapsle), neboť obal kapsle musí být narušen vodou nebo alkalickými roztoky. To je jeden z důvodů použití alkalické hydrolýzy v analýze lipofilních vitamínů. Alkalická hydrolýza má ještě další důležité vlastnosti mimo uvolnění vitamínu A z kapslí. Estery všech forem vitamínu A jsou přeměněny na alkoholické formy, tuky (glyceridy a fosfolipidy) jsou hydrolyzovány na volné mastné kyseliny a glycerol, které mohou být separovány od vitamínů extrakcí organickými rozpouštědly. Vlastní hydrolýza vzorku se provádí ethanolovým roztokem hydroxidu draselného za přítomnosti antioxidantů pod zpětným chladičem po dobu nejméně 30 minut ve speciální zmýdelňovací aparatuře. Po celou dobu saponifikace se doporučuje probublávat celou aparaturu mírným proudem dusíku, který saturuje dané prostředí a preventivně chrání přítomné vitamíny před vzdušnou oxidací. Pokud se jedná o acetát a palmitát retinolu, ty jsou více stabilnější vůči oxidaci než samotný 13

alkohol. Vitamín A je stabilní v přítomnosti alkálií, naopak extrémně citlivý je vůči kyselinám, které jsou promotorem jeho cis-trans isomerace. U vitamínu D je rovněž nutný přechod na příslušný previtamín, kdy dochází k ustavení rovnováhy mezi cholekalciferolem a prekalciferolem, resp. ergokalciferolem a prekalciferolem vlivem isomerace. Isomerace vitamínu D na jeho previtamín je katalyzována zejména zvýšenou teplotou při alkalické hydrolýze. Aktuální obsah vitamínu D ve vzorku zůstává konstantní pouze v případě, že rovnováha mezi vitamínem D a prekalciferolem je ustálena a je-li teplota menší než 20 o C, kdy rychlost isomerace je zanedbatelná. Důležité je rychlé ochlazení hydrolyzátu po ukončení vlastní hydrolýzy. Množství hydroxidu draselného použitého k hydrolýze je závislé na množství tuku ve vzorku. Uvádí se, že na každý 1 g tuku je nutné použít 5 ml 60 % roztoku hydroxidu draselného a 15 ml ethanolu. Jako další antioxidační činidla se používají např. samotný vitamín E, pyrogallol, sodná sůl kyseliny askorbové, butylhydroxytoluen. Nevýhodou některých antioxidačních činidel (pyrogallol, butylhydroxytoluen) je, že při extrakci lipofilních vitamínů ze zmýdelněné matrice rovněž přechází do organické fáze a může tak činit obtíže při vlastním stanovení vitamínů [11]. 6.3 EXTRAKCE Jedná se o separační proces, při kterém jsou v kontaktu dvě vzájemně nemísitelné fáze. Látky se rozdělují mezi tyto fáze na základě rozdílných rozdělovacích koeficientů. Čím větší je rozdíl mezi rozdělovacími koeficienty látek, tím dokonalejší je jejich oddělení. Cílem extrakce je selektivní až specifické oddělení analytu od ostatních složek nebo naopak oddělení rušících látek od analytu. Extrakce můžeme klasifikovat podle různých kritérií: a) Podle zúčastněných fází 1. Plyn kapalina (GLE, gas liquid extraction) extrakce těkavých látek plynem z kapaliny. Používá se v plynové chromatografii pro nakoncentrování těkavých složek vzorku 14

2. Kapalina kapalina (LLE, liquid liquid extraction) z analytického hlediska nejdůležitější, avšak dnes již je rychle vytlačována extrakcemi na tuhé fázi (SPE, solid phase extraction) 3. Tuhá fáze kapalina (SLE, solid liquid extraction) používá se velmi často v biologii, biochemii, organické a anorganické chemii. Získávají se takto např. alkaloidy, hormony a barviva. Tuhé organické materiály se za tepla extrahují organickými rozpouštědly, z tavenin se horkou vodou extrahují rozpustné anorganické soli. b) Podle způsobu provedení 1. Jednostupňová extrakce dochází k ustavení jedné rovnováhy mezi fázemi. Nejběžnějším případem je roztřepání v dělící nálevce 2. Mnohostupňová extrakce proces ustanovení rovnováhy se mnohokrát opakuje v oddělených krocích. Příkladem je několikanásobné roztřepávání v dělící nálevce nebo extrakce v zařízení podle Craiga. 3. Kontinuální fáze jsou při protiproudném pohybu v neustálém styku. Příkladem je extrakce v Soxhletově extraktoru či extraktorech na extrakci kapaliny kapalinou. c) Podle charakteru extrahovaných látek 1. Extrakce organických látek 2. Extrakce kovových chalátů 3. Extrakce iontových asociátů [12] 6.3.1 ZPŮSOBY EXTRAKCE VITAMÍNŮ Superkritická fluidní extrakce Superkritická kapalina Superkritické kapaliny můžeme definovat jako sloučeniny, které jsou ve stavu nad jejich kritickým tlakem (Pc) a nad jejich kritickou teplotou (Tc). Nad kritickou teplotou a tlakem se sloučenina nachází v kondenzovaném stavu s vlastnostmi mezi plynem a kapalinou (obr 5.). 15

Obr. 7 Fázový diagram CO 2 a H 2 O Pokud teplota kapaliny vzroste, její hustota se sníží. Jestliže tlak plynné fáze vzroste, hustota se zvýší. V kritickém bodě se hustoty stávají rovnocenné. Obecně superkritické kapaliny mají hustotu blízkou kapalinám a viskozitu podobnou plynům. Mohou difundovat skrz pevné látky jako plyny a rozpouští materiály jako kapalina. Tab. 1 Srovnání hustoty, viskozity a schopnosti difundovat pro typické plyny, kapaliny a superkritické kapaliny. Hustota (kg/m 3 ) Viskozita (cp) Difusivita (mm 2 /s) Plyny 1 0,01 1-10 Superkritické kapaliny 100-1000 0,05-0,1 0,01-0,1 Kapaliny 1000 0,5-1,0 0,001 Blízko ke kritickému bodu i malé změny tlaku nebo teploty způsobí velké změny v hustotě, což má za následek změnu mnoha vlastností. Se vzrůstajícím tlakem u kritické teploty se mohou tvořit pevné látky, ale pro mnoho materiálů je odpovídající tlak velmi vysoký, např. 5700 bar pro CO 2. Kritická teplota a tlak se pro různé sloučeniny velmi liší (Tab. 2). 16

Tab. 2 Kritické vlastnosti různých rozpouštědel. Rozpouštědlo Molekulová hmotnost Kritická Kritický tlak Kritická hustota (g/mol) teplota (K) (MPa - atm) (g/cm 3 ) CO2 44.01 304,1 7,38 (72,8) 0,469 H2O 18,02 647,3 22,12 (218,3) 0.348 Metan (CH4) 16,04 190,4 4,60 (45,4) 0,162 Etan (C2H6) 30,07 305,3 4,87 (48.1) 0,203 Propan (C3H8) 44,09 369,8 4,25 (41,9) 0,217 Etylen (C2H4) 28,05 282,4 5,04 (49,7) 0,216 Propylen (C3H6) 42,08 364,9 4,60 (45,4) 0,232 Metanol (CH3OH) 32,04 512,6 8,09 (79,8) 0,272 Etanol (C2H5OH) 46,07 513,9 6,14 (60,6) 0,276 Aceton (C3H6O) 58,08 508,1 4,70 (46,4) 0,278 6.3.2 SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE (SFE) Superkritická fluidní extrakce (SFE) je proces separace požadovaných složek z matrice použitím superkritické látky jako extrakčního rozpouštědla. Extrakce se provádí z pevných i kapalných vzorků. Nejpoužívanějším rozpouštědlem je oxid uhličitý, který je někdy modifikován přídavkem malého množství jiného rozpouštědla, např. ethanolu či methanolu. Rychlost extrakce a fázové separace je u SFE rychlejší než u běžné extrakce. Extrakční podmínky mohou byt kontrolovány, což umožňuje velmi efektivní separaci. SFE je závislá na hustotě látky, která může byt ovlivněna kontrolou tlaku a teploty. V případě kdy se jedna z podmínek SFE změní z kritické na běžnou, množství zbytkového rozpouštědla v extrahovaném materiálu je zanedbatelné. Základní princip SFE vychází z toho, že rozpustnost dané sloučeniny v rozpouštědle se mění s teplotou i s tlakem. Za normálních podmínek (25 C a 1 bar) je rozpustnost látky v plynu obvykle spojena přímo s tlakem par dané rozpuštěné látky a je zpravidla zanedbatelná. U superkritických kapalin, ačkoli je rozpustnost látek řadově desetkrát vyšší než u ideálního plynu, byly zaznamenány zákonitosti v jejich chování. 17

Rozpuštění látky v superkritické kapalině je výsledkem kombinace tlaku par a interakčního efektu mezi látkou a rozpouštědlem. Rozpustnost jednotlivých složek může být zvýšena přidáním jiného rozpouštědla tzv. co-solventu. Přidáním tohoto cosolventu se odkrývá další oblast vlastností rozpouštědla a to dává možnost ovlivnit chemickou povahu látky. Co-solventy poskytují takový mechanismus reakce, při kterém může být měněna selektivita extrakce. Při SFE se vzorek látky nejprve dostane do kontaktu se superkritickou kapalinou, dojde k difúzi superkritické kapaliny v materiálu, a poté přejde extrahovaná látka ze vzorku do rozpouštědla. Extrahovaná látka se úplně separuje ze superkritické kapaliny díky teplotním či tlakovým změnám. Vzhledem k rychlejší difúzi je extrakce rychlejší než u běžných kapalin. Výhody a nevýhody superkritických kapalin ve srovnání s běžnými kapalnými rozpouštědly pro separaci: Výhody: * rozpustnost může byt ovlivněna tlakem či teplotou; * superkritické kapaliny jsou snadno obnovitelné a odstranitelné z extraktu díky jejich těkavosti; * nejsou toxické; * vysoko vroucí složky jsou extrahovány za poměrně nízkých teplot; * separace, kterou nelze provést za běžných podmínek, může být efektivní; * teplotně labilní sloučeniny mohou byt extrahovány s minimálním rozkladem; Nevýhody: * je požadován vysoký tlak; * vysoké náklady na zařízení 18

Gámiz-Gracia et al. stanovili vitamíny D2 a D3 v různých farmaceutických přípravcích,které zahrnovaly dva typy kapek, jeden pudr a jeden granulovaný přípravek. Shromažďování během SFE bylo provedeno do pasti s nerezovými kuličkami, které byly po extrakci propláchnuty methanolem. Ostnatá křemelina byla použita pro optimalizaci extrakčních parametrů, zahrnující teplotu (40-80 C), hustotu (0,60-0,95 g/ ml), průtokovou rychlost ( 0,5-2,5 ml/min), čas a režim extrakce, eluent (0.15 1.5 ml toluenu, methanolu a diethyetheru) a velikost vzorku. Optimalizované podmínky byly SC-CO 2 na 40 C a 281 barů ( 0,90 g/ml) a 1 minuta statické extrakce byla následovaná 20 minutami dynamické extrakce při průtokové rychlosti 2,0 ml/min, 0,5g vzorku a 0,25 ml diethyletheru přidaného ke vzorku 10 minut před SFE. Přídavek diethyletheru zvýšil výtěžek vitamínu D, toluen neovlivnil výtěžek a methanol poskytnul dokonce výtěžnost nižší. Teplota pasti během extrakce nebyla daná, což znesnadňuje interpretovat negativní výsledky s ethanolem. Použití nerezových kuliček pro zachycení závisí jen na kryogenním chlazení, které způsobuje kondenzaci spoluextrahovaného modifikátoru docela přijatelně a to pak vedlo k rychlému průlomu cílových substancí. Výtěžnost různých farmaceutických přípravků se pohybovaly mezi 85% až 105% a relativní směrodatná odchylka byla v rozmezí 2% a 12%.[9] 6.3.3 EXTRAKCE NA PEVNÉ FÁZI (SPE) SPE je jednoduchá a rychlá technika používaná k extrakci vzorků z matric, mezi jinými, nutričních látek z potravy a léčiv a jejich metabolitů z biologických tekutin. Důležitá je optimalizace SPE k zajištění efektivity následujících instrumentálních analýz. Před SPE je nezbytné odstranit tukové částice z emulgovaného vzorku s vysokým obsahem tuku kvůli optimalizaci retence analytu, protože velké množství lipofilních látek zadržených na reverzní fázi, snižuje její kapacitu pro analyt. Předchozí experimenty s hexanem/chloridem sodným ukázaly, že tento postup je vhodný pro vitamín D2, ale ne pro vitamín A a β -karoten.[10] Stopové množství vitamínu A a β -karotenu biologických tekutinách a potravinách je stanoveno HPLC. Avšak, extrakce stopového množství retinol acetátu, vitaminu A a β -karotenu v potravinových doplňcích, obsahujících emulgující činidlo, nebyla předtím prostudovaná. Vzorky použité zde jsou v práškové formě a obsahují 50 rozdílných komponent jako vitamíny rozpustné ve vodě a v tucích, rostlinné oleje, aminokyseliny, organické kyseliny, cukry a minerály. Vitamín A (2,5 µg/g) a β -karoten 19

(9 µg/g) jsou prezentovány v hodnotách 8000 a 2222 nižších než rostlinné oleje (20 mg/g). [10] Byly připraveny standardní roztoky vitamínu A ( c= 2,5 µg / 100ml) a β-karotenu (10g/100ml). Vzorek byl připraven rozpuštěním nutričního přípravku (10g) v 5% roztoku sulfátu sodného, který obsahoval 1mM sodné soli EDTA. K extrakci byly použity Bond Elut C 18 kartridže, které byly aktivovány metanolem a následně byl aplikován vzorek nutričního přípravku a standard vitamínu A a β -karotenu. Na výtěžnost SPE mělo vliv použití různých eluentů. Optimální eluce vitamínu A a β -karotenu bylo dosaženo ethanolem a 2-propanolem[10]. Tab. 3 Efekt rozdílných rozpouštědel na eluci vitamínu A a beta karotenu [10]. Eluent Recovery (%) ß-karoten VA, mean ± S.D. (n=5) mean ± S.D. (n=5) Methanol 87,7 ± 2,5 85,1 ± 2,95 Etanol 100 ± 2,091 100 ± 2,99 2-propanol 100 ± 3,01 100 ± 3,01 Acetonitrile 81,2 ± 2,45 83,5 ± 2,75 6.3.4 PŘEČIŠTĚNÍ ORGANICKÉHO EXTRAKTU Přečištění extraktu zavádí do pracovního postupu krok navíc, který je možným zdrojem dalších chyb. Proto se, pokud toto není nezbytně nutné, dnes nepoužívá. Z možných postupů přečištění extraktu je možné zmínit srážení sterolů ze surového extraktu, extrakci kapalina-kapalina, tenkovrstvou chromatografii a sloupcovou chromatografii. Srážení sterolů se provádí digitoninem v ethanolovém roztoku za studena za vzniku komplexu digitonin-sterol a následnou reextrakcí vitamínu. Nejrozšířenějším čistícím krokem je použití sloupcové chromatografie, která má široké možnosti použití sorbentů - oxid hlinitý, silikagel a oxid hořečnatý a používá se většinou při spektrofotometrické koncovce stanovení vitamínu A. Dnes je vytlačována technikou SPE. Oxid hlinitý se používá aktivovaný při teplotě 600 o C a následně deaktivovaný 2 až 10 % vody. Oxid hlinitý musí být neutrální povahy, jeho kyselé i bazické vlastnosti musí být minimalizovány. Silikagelový sorbent se používá především v technice SPE[11]. 20

7 CHROMATOGRAFICKÉ METODY V současné době jsou nejvýznamnějšími separačními metodami, které jsou zároveň i metodami kvantitativně analytickými. Zakladatelem je ruský chemik a botanik Michail Semjonovič Cvet (1872 1919), který ve skleněné koloně naplněné uhličitanem vápenatým rozdělil listová barviva. 7.1 OBECNÝ PRINCIP CHROMATOGRAFIE Základní princip chromatografického procesu je založen na nestejnoměrném rozdělování složek směsi mezi dvě navzájem nemísitelné, nebo velmi omezeně mísitelné fáze, z nichž jedna je stacionární (nepohyblivá) a druhá je mobilní (pohyblivá). Složky směsi se liší svojí afinitou k oběma fázím a dělené složky mají snahu střídavě vnikat do obou fází a liší se vzájemně dobou setrvání v jednotlivých fázích. Po určité době se ustaví dynamická rovnováha, kdy poměr látkových množství každé látky ve fázi stacionární a mobilní je konstantní [14]. Tab. 4 Rozdělení chromatografických metod [14]. Mobilní fáze Stacionární fáze Název metody Separační mechanismus Kapalina Plynová rozdělovací ch. Rozdělování a rozdělovací koeficient Plyn Pevná látka Plynová adsorpční ch. Adsorpce, adsorpční izoterma Pevná látka Plynová ch. na molekulových sítech Sítový efekt Kapalinová rozdělovací kapalina Rozdělování a rozdělovací ch. rovnováha Papírová a tenkovrstvá ch. Gelová permeační ch. Sítový efekt kapalina Kapalinová adsorpční ch. Adsorpce, adsorpční Tenkovrstvá ch. izoterma Pevná látka Iontová ch. Výměna iontý, výměnná rovnováha Biospecifická chem. Afinitní a bioafinitní ch. reakce 21

7.2 VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) Mezi chromatografickými metodami zaujímá významné místo technika HPLC. Zkratka je odvozena od dvou přípustných názvů této techniky a to high performance liquid chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) nebo high pressure liquid chromatography (vysokotlaká kapalinová chromatografie). Mobilní fází je v tomto případě kapalina. Stacionární fází je film příslušné látky zakotvený na povrchu nosiče nebo pevný adsorbent. Přístroj, na kterém se provádí HPLC analýzy se nazývá kapalinový chromatograf. Obr. 8 Schématický nákres kapalinového chromatografu. Kapalinový chromatograf tvoří tyto hlavní části: zásobníky s mobilní fází, vysokotlaká pumpa, dávkovač, kolona a detektor. Metoda HPLC existuje jako tzv. normální a reversní. Normální HPLC Při normální HPLC je stacionární fáze polárnější než fáze mobilní. Reverzní HPLC Při reverzní HPLC je naopak stacionární fáze méně polární než fáze mobilní. Reverzní HPLC bývá též označovaná jako RP HPLC (reverse phase HPLC). Pro stanovení lipofilních vitamínů se nejčastěji používá reverzní HPLC. 7.2.1 MOBILNÍ FÁZE Mobilní fází v RP HPLC může být např. voda, methanol, acetonitril a jejich směsi v různých vzájemných poměrech, pufry a další. Zásobníky jsou skleněné láhve, 22

kterých může být několik s různými mobilními fázemi, které je možné spolu automaticky mísit v předem zvoleném poměru. Na rozdíl od GLC zde mobilní fáze vstupuje do interakce se složkami analyzované směsi a konkrétní složení mobilní fáze může významným způsobem ovlivňovat celou analýzu (kvalitu separace). 7.2.2 STACIONÁRNÍ FÁZE Stacionární fáze je tvořena mikročásticemi silikagelu (3-10 µm) na kterých je navázána vlastní stacionární fáze. Vlastní stacionární fáze může být tvořena například nepolárními uhlovodíky (C8 oktan, C18 oktadekan), nebo polárnějšími uhlovodíky s funkční skupinou ( např. -CN a pod). 7.2.3 VYSOKOTLAKÁ PUMPA Vysokotlaká bezpulzní pumpa je velmi důležitou součástí HPLC aparatury. Kolony pro HPLC jsou plněny mikročásticemi, které při průchodu mobilní fáze kladou značný odpor. Z toho důvodu musí být mobilní fáze pod vysokým tlakem (až 40 MPa), aby mohla projít přes kolonu. Dostatečný tlak a konstantní průtok mobilní fáze zajišťuje právě vysokotlaká pumpa. 7.2.4 DÁVKOVÁNÍ Vzorek je dávkován do proudu mobilní fáze pomocí dávkovací smyčky nebo pomocí automatického dávkovače. 7.2.5 KOLONA Zpravidla se jedná o nerezovou trubici o vnitřním průměru okolo 4 mm a délce typicky 5-25 cm, která je naplněna stacionární fází. O schopnosti kolony separovat určité směsi na jednotlivé složky opět rozhoduje zejména typ stacionární fáze zakotvené na silikagelovém nosiči. 7.2.6 DETEKTOR V metodě HPLC je dostupná opět řada různých detektorů, které se liší principem funkce, konstrukcí, selektivitou, citlivostí, mezí detekce a lineárním dynamickým rozsahem. Metoda HPLC využívá tyto typy detektorů: spektrofotometrický detektor (UV- VIS), fluorescenční detektor, hmotnostní spektrometr, refraktometrický detektor a další. Volba detektoru opět závisí na konkrétní aplikaci. Často používaným detektorem je 23

detektor spektrofotometrický (UV-VIS) a fluorescenční. Podmínkou použití těchto detektorů je, aby daný analyt absorboval záření určité vlnové délky, a nebo aby emitoval flourescenční záření. Pokud analyt sám o sobě neabsorbuje záření v oblasti UV-VIS nebo neemituje fluorescenční záření, je použití těchto detektorů podmíněno derivatizací vzorku, kdy je vzorek chemickou reakcí převeden na sloučeniny, které mají potřebné vlastnosti - absorpce UV-VIS, fluorescence. 7.3 POPIS HPLC ANALÝZY Aparaturou protéká mobilní fáze, která je ze zásobních lahví vedena přes vysokotlakou pumpu do kolony, z ní do detektoru a dále pak do odpadu. Dávkovačem je do proudu mobilní fáze nadávkován vzorek (řádově několik µl). Vzorek je unášen mobilní fází do kolony, kde dochází k separaci jednotlivých složek. Výstup z kolony vede do detektoru, kde jsou jednotlivé složky detekovány. Signál z detektoru je zaznamenáván pomocí počítače a tisknut v podobě chromatogramu. HPLC analýza je ve srovnání s GLC analýzou mnohem méně citlivá na teplotu kolony a průtokovou rychlost mobilní fáze. Je však citlivá na složení a ph mobilní fáze. Výhodou HPLC je schopnost analyzovat termolabilní látky (např. vitamíny a jiné), které by při použití plynové chromatografie degradovaly a byly by tak neanalyzovatelné. Analýzy některých směsí a látek je možné provádět jak metodou HPLC tak GLC (např. mastné kyseliny). 7.3.1 CHROMATOGRAM Výsledkem HPLC analýzy je chromatogram. Pokud je zkoumaná směs dobře rozdělena, pak každý pík na chromatogramu odpovídá jedné ze složek směsi. Poloha píku na ose x uváděná pomocí retenčního času (určeno podle polohy vrcholu) určuje o jakou látku se jedná - kvalitativní analýza, plocha píku nebo jeho výška určuje koncentraci látky ve směsi - kvantitativní analýza. Identifikace píků se provede tak, že se na stejné separační koloně za stejných experimentálních podmínek provede analýza předem připravené směsi o známém kvalitativním složení, tzv. standardní směs. Pokud se retenční časy píků na chromatogramu neznámé směsi shodují s retenčními časy píků směsi o známém složení, pak se jedná o stejné látky. Koncentrace látek ve směsi se určuje z ploch nebo výšek píků metodou kalibrace, pro kterou existuje více způsobů provedení. 24

7.3.2 PŘÍKLADY ANALÝZ HPLC Vitamíny rozpustné ve vodě / v tucích, kortikoidy, kortikosteroidy, antidepresiva, karbonylové sloučeniny (environmentální analýzy), třaskaviny, výbušniny a pod [13]. 25

8 STANOVENÍ VITAMÍNU A METODOU HPLC Pro stanovení vitamínu A z multivitaminových tablet je nejdříve zapotřebí tablety rozdrtit a následně rozpustit ve vhodném rozpouštědle např. v isopropanolu. Do chromatografické kolony je vstřikován roztok se směsí různých vitamínů, takže dochází k současnému stanovení více vitamínů. Při stanovení vitamínu A v kapslích, se kapsle rozpustí ve vhodném rozpouštědle. V dostupné literatuře bývá popisováno stanovení zejména z tablet a z kapslí. Následující tabulka zahrnuje nalezené možnosti v literatuře. Tab. 5 26

9 STANOVENÍ VITAMÍNU D METODOU HPLC Vitamín D bývá nejčastěji stanovován z léčiv pomocí HPLC. Tomuto stanovení předchází extrakce. V současnosti se využívá zejména SFE. Lze ji použít při farmaceutických analýzách tablet, krémů, kapek, mastí a infůzí. Pokud stanovujeme vitamín D z kapek, přidáváme vzorek přímo ke křemelině v extrakční cele. Pokud se jedná o pevné vzorky, je třeba je rozemlít, příslušné množství umístit do extrakční cely. Ve všech případech se přidává 0,25 ml diethyletheru před extrakcí [17]. V dostupné literatuře bývá popisováno stanovení zejména z tablet, případně i z mastí či kapek. Následující tabulka zahrnuje možnosti nalezené v literatuře. Tab. 6 27

10 ZÁVĚR Rešeršní práce je dělena na tři hlavní části. V první je pojednáno o chemických a biologických vlastnostech vitamínů A a D. Následující část je věnována popisu fáze před samotnou HPLC separací, zahrnuje přípravu vzorku, alkalickou hydrolýzu, extrakci a přečištění organického extraktu. Poslední část se zabývá chromatografickými metodami a stanovením vitamínů A a D metodou HPLC. Pro stanovení vitamínů rozpustných v tucích se používá zejména RP HPLC a k detekci se používá UV-VIS spektrofotometr. 28

11 CITOVANÁ LITERATURA [1] http://xantina.hyperlink.cz/organika/prirodni/vitaminy.html 7/2010 [2] Lenka Grossmanová, Bakalářská práce Vitamíny D a K, Brno 2007, Masarykova Univerzita. [3] Edem D.O.: Vitamin A: A Review. Asian J Clin Nutr 2009; 1(1): 65-82. [4] http://www.nexars.com/cs/vitamin-d.php 5/2010 [5] J.T.Gillingham.: J. Assoc. Off. Anal. Chem. 50, 828 (1967) [6] D.Glick : J. Biol. Chem. 156, 643 (1944) [7] IUPAC-IUB, Commission on Biochem. Nomenclature, Biochim. Biophys. Acta 107, 1 (1965) [8] Marcela Lišková, Syntézy za neklasických podmínek - E-Learningový kurs,str. 133 140,vystaveno 12.5.2008 [citováno 4.5.2010], dostupné z: http://is.muni.cz/dok/rfmgr.pl?lang=cs;furl=%2fth%2f77987%2fprif_m%2f;info= [9] Charlotta Turnera, Jerry W. Kingb, Lennart Mathiassona, Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis, Journal of Chromatography A,, 936 (2001) 215 237 [10] Hiroshi Iwase,,Simultaneous sample preparation for high-performance liquid chromatographic determination of Vitamin A and _-carotene in emulsified nutritional supplements after solid-phase extraction, Analytica Chemica Acta 463 (2002) 21 29 [11] http://hplc1.sweb.cz/vitamin/lipofil_problem.htm - 6/2010 [12] http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/extrakce.pdf - 6/2010 [13] old.lf3.cuni.cz/chemie/cesky/materialy_b/chromatografie.doc 6/2010 [14] www.fp.tul.cz/kch/texty/fp/acs/chromatograficke-metody.ppt - 6/2010 29

[15] Dietmar E. Breithaupt Stefanie Kraut, Simultaneous determination of the vitamins A, E, their esters and coenzyme Q10 in multivitamin dietary supplements usingan RP- C30 phase. Eur Food Res Technol (2006) 222: 643 649, DOI 10.1007/s00217-005- 0195-7 [16] Slawomir Wielinski and Andrzej Olszanowski, Development and validation of HPLC method for simultaneous determination of fat soluble vitamins in capsules, J. LIQ. CHROM. & REL. TECHNOL., 24(2), 201 213 (2001) [17] L. Gámiz-Gracia / M. M. Jiménez-Carmona / M.D. Luque de Castro, Determination of Vitamins D 2 and D 3 in pharmaceuticals by supercritical-fluid extraction and HPLC separation with UV Detection, Chromatographia Vol. 51, No. 7/8, April 2000 [18] É. I. Kozlov, I. A. Solunina, M. L. Lyubareva and M. A. Nadtochii, HPLC determinativ of vitamins A,D and E in multivitamin composition, Vol. 37, No. 10, pp. 50 53, October, 2003 30