Průkaz a druhové zastoupení termotolerantních kampylobakterů v potravinách a prostředí Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy Průkaz a druhové zastoupení termotolerantních kampylobakterů v potravinách a prostředí Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka Ph.D Vypracovala: Bc. Marcela Králová Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Průkaz a druhové zastoupení termotolerantních kampylobakterů v potravinách a prostředí vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala panu Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D za vedení mé diplomové práce a paní MVDr. Ivaně Koláčkové, Ph.D za cenné rady a odbornou pomoc při praktických zkouškách. Také bych ráda poděkovala své rodině a přátelům za podporu a trpělivost během studia.

ABSTRAKT Kampylobakterióza je nejčastější alimentární onemocnění v České republice a počty hlášených případů se stale zvyšují. Tato práce je zaměřena na průkaz a druhové zastoupení termotolerantních kampylobakterů v potravinách a prostředí. Přehledně popisuje jednotlivé druhy kampylobakterů, jejich dopad na lidské zdraví a uvádí základní pravidla prevence rizika onemocnění. Cílem této studie je určit výskyt kampylobakterů ve vybraných typech potravin a prostředí s využitím různých metod detekce a identifikace. Výsledky experimentů stanovení kampylobaktera byly porovnány s literaturou a legislativou. Klíčová slova: Campylobacter spp., kampylobakterióza, potraviny, prostředí ABSTRACT Campylobacteriosis is the most common foodborne disease in the Czech Republic with constantly increasing number of registered cases. This master thesis is focused on demonstration of thermotolerant Campylobacter in different kinds of food and environment. It gives a comprehensive description of Campylobacter types, their impact on human health and discusses basic rules to prevent the risk of disease. The aim of this work is to determine the presence of Campylobacter in selected types of food and environment using various methods of detection and identification. The experimental results of Campylobacter determination were compared with literature and legislation. Key words: Campylobacter spp., campylobacteriosis, food, environment

OBSAH 1 ÚVOD... 8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 2.1 Campylobacter spp.... 9 2.1.1 Charakteristika rodu Campylobacter spp.... 9 2.1.2 Taxonomické zařazení rodu Campylobacter spp... 9 2.1.3 Morfologie... 10 2.1.4 Biochemické vlastnosti... 10 2.2 Výskyt termotolerantních kampylobakterů v potravinách... 11 2.2.1 Potraviny živočišného původu... 12 2.2.1.1 Drůbeží maso... 13 2.2.1.2 Maso ostatních savců... 15 2.2.1.3 Syrové mléko... 17 2.2.2 Potraviny rostlinného původu... 17 2.2.2.1 Zelenina... 17 2.3 Výskyt termotolerantních kampylobakterů v prostředí... 18 2.4 Výskyt termotolerantních kampylobakterů u hospodářských zvířat... 18 2.5 Výskyt termotolerantních kampylobakterů u ostatních zvířat... 19 2.6 Kampylobakterióza... 19 2.7 Způsoby přenosu... 22 2.8 Hygienické zásady a prevence... 22 2.9 Detekce a identifikace bakterií rodu Campylobacter spp... 23 2.9.1 Metody detekce bakterií rodu Campylobacter spp... 24 2.9.1.1 Kultivace bakterií rodu Campylobacter spp... 24 2.9.1.2 Rychlé metody detekce... 26 2.9.2 Metody identifikace a charakterizace rodu Campylobacter spp... 27 2.9.2.1 Fenotypové metody... 27 2.9.2.2 Sérologické testy... 29 2.9.2.3 Molekulárně biologické metody... 30 3 CÍL PRÁCE... 32 4 MATERIÁL A METODIKA... 33 4.1 Vyšetřovaný materiál... 33 4.1.1 Vzorky potravin... 33

4.1.2 Vzorky zvířat... 35 4.1.3 Vzorky prostředí... 35 4.2 Přístroje a pomůcky:... 36 4.3 Reagencie... 37 4.4 Kultivační média a selektivní suplementy... 38 4.5 Kultivační metody... 38 4.5.1 Potraviny... 38 4.5.1.1 Potraviny odebrané navážkou... 39 4.5.1.2 Potraviny odebrané stěrem... 39 4.5.2 Prostředí... 39 4.5.2.1 Zpracování písku... 40 4.5.2.2 Zpracování vody... 40 4.6 Ověření bakterií rodu Campylobacter spp... 41 4.6.1 Test na stanovení oxidázy... 41 4.6.2 Test na stanovení aerobního růstu... 41 4.6.3 Potvrzení pomocí PCR a následné elektroforézy... 41 4.6.3.1 Izolace DNA... 41 4.6.3.2 Přidání reakční směsy (Master mix)... 42 4.6.3.3 Polymerázová řetězová reakce... 42 4.6.3.4 Elektroforéza... 42 5 VÝSLEDKY A DISKUSE... 43 5.1 Výskyt Campylobacter spp. izolovaný z potravin... 43 5.2 Výskyt Campylobacter spp. izolovaný z prostředí... 45 6 ZÁVĚR... 49 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 51 8 SEZNAM TABULEK... 61

1 ÚVOD Onemocnění alimentárního původu jsou velmi rozšířená v rozvojových i vyspělých zemích. Příčinou může být celé spektrum bakteriálních i virových infekčních agens. V České republice způsobují střevní onemocnění bakteriální původci jako je Campylobacter spp., Salmonella spp. nebo Escherichia coli, méně pak Shigella spp. nebo Yersinia enterocolitica. Nejčastěji hlášenou nákazou, a to nejen v České republice, se v posledních letech stala kampylobakterióza, která má navíc stále vzrůstající tendenci. Původcem jsou termotolerantní bakterie rodu Campylobacter. Zástupci této skupiny bakterií patří celosvětově k významným původcům gastroenteritid. Mezi termotolerantní druhy rodu Campylobacter patří Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari a C. upsaliensis. Hlavním etiologickým agens vedoucím ke vzniku humánních infekcí je C. jejuni, v menší míře pak C. coli [1]. Ostatní druhy mají z epidemiologického hlediska jako původci alimentárních infekcí jen malý význam. Zástupce termotolerantních kampylobakterů je možné izolovat ze střevního traktu celé řady různých druhů hospodářských i volně žijících zvířat [2]. Tato zvířata se pak mohou podílet na přenosu termotolerantních kampylobakterů na člověka. Do potravního řetězce se tyto patogeny nejčastěji dostávají kontaminací potravin, především syrového drůbežího masa, nebo kontaminací vody. Lidé se pak nakazí konzumací těchto potravin po nedostatečné tepelné úpravě nebo z důvodu sekundární kontaminace či nedodržení hygienických pravidel při přípravě pokrmů. V současnosti se rutinní laboratorní diagnostika Campylobacter spp. stále spoléhá na kultivační techniky na selektivních půdách a na biochemické testy. Kampylobaktery jsou však růstově náročné mikroorganizmy, které potřebují mikroaerofilní atmosféru, jejich průkaz je časově náročný a navíc existuje jistá variabilita v biochemických vlastnostech mezi druhy, čímž může být druhová identifikace nepřesná. Je tedy potřeba hledat nové, lepší a přesnější metody k jejich detekci a typizaci. Jako vhodná alternativa z hlediska přesnosti i rychlosti se jeví genotypové metody založené na PCR reakci, které navíc mohou přispět k dalšímu studiu kampylobakterů. 8

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Campylobacter spp. Kampylobakter patří mezi významné patogeny způsobující zoonózy na celém světě. Odhaduje se, že každým rokem je v západní Evropě infikováno tímto mikroorganizmem 1 % populace [3]. Název Campylobacter vznikl z řeckého kampulus tj. zkroucený, zahnutý a baktron tj. prut, tyč [4]. Jde o skupinu bakterií, která byla dříve známá pod pojmem mikroaerofilní vibria. Původně byly známy jako původci potratů u hovězího a vepřového dobytka. Jejich patogenita dlouho nebyla prokázána. Poté, co byla zvládnuta jejich kultivace, byly prokázány také u lidí a byly přeřazeny do samostatného rodu. Kampylobaktery obecně vyvolávají střevní infekce u lidí, aborty u domácích zvířat a uplatňují se jako patogeny u lidí se sníženou imunitou [5]. 2.1.1 Charakteristika rodu Campylobacter spp. Bakterie rodu Campylobacter jsou mikroaerofilní a chemoorganotrofní spirálovité nebo zakřivené gramnegativní tyčinky, které netvoří spory a díky přítomnosti bičíku je většina druhů pohyblivá. Optimální růstová teplota je 37 C, ale termofilní druhy jsou schopné růst i při teplotě 42 C. Obsah guaninu a cytosinu v molekule DNA se pohybuje v rozmezí od 29 do 47 mol. % [6]. 2.1.2 Taxonomické zařazení rodu Campylobacter spp. Čeleď Campylobacteraceae vznikla v roce 1994 na základě podobné genetické a molekulární struktury. Tato čeleď obsahuje rod Campylobacter, Arcobacter a Sulfurospirillum [7]. Celý rod Campylobacter zahrnuje 16 druhů, z toho čtyři jsou řazeny mezi termotolerantní druhy (Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari a C. upsaliensis), které jsou schopny růstu při 42 C. Ze zástupců termotolerantních kampylobakterů je nejrozšířenějším druhem C. jejuni [8, 9]. 9

Tabulka 1: Kompletní zařazení bakterií C. jejuni a C. coli [10]. Doména (Domain): Bacteria Kmen (Phyllum): Proteobacteria Třída (Classis): Epsilon proteobacteria Řád (Ordo): Campylobacteriales Čeleď (Familia): Campylobacteraceae Rod (Genus): Campylobacter Druh (Species): Campylobacter coli Campylobacter jejuni Poddruh (Subspecies): Campylobacter jejuni subsp. doylei Campylobacter jejuni subsp. jejuni 2.1.3 Morfologie Zástupci rodu Campylobacter jsou nesporulující, gramnegativní bakterie, jejichž buňky jsou pleomorfní (délka 0,5-8 µm, šířka, 2-0,5 µm) [11]. Tyčinkovité buňky mají charakteristický štíhlý spirálovitý tvar, mohou tvořit jednu nebo dvě smyčky, v případě dvou smyček mají tvar písmene S. Se vzrůstajícím věkem však dochází k přeměně tyčinek na koloidní tvar. K této změně dochází pravděpodobně v důsledku degradace peptidoglykanové vrstvy působením enzymů [11, 12]. Pohyblivost je v rámci rodu odlišná, ale většina těchto bakterií jsou pohyblivé a vykonávají charakteristický vývrtkový pohyb díky přítomnosti polárního bičíku umístěného na jednom nebo na obou pólech buňky. Výjimku tvoří například nepohyblivý C. gracilis [13]. 2.1.4 Biochemické vlastnosti Na mikroorganizmy působí neustále celá řada faktorů, které je ovlivňují a mají dopad na jejich přežívání. Zejména patří mezi tyto faktory teplota, hodnota ph, vliv atmosféry, koncentrace soli, hodnota vodní aktivity a další. Bakterie rodu Campylobacter ve vnějším prostředí dlouho nepřežívají, vadí jim zejména přítomnost kyslíku a suché prostředí, v potravinách se až na výjimky nepomnožují [9]. Obecně lze kampylobaktery považovat za méně biochemicky aktivní. Jsou to chemoorganotrofní mikroorganizmy, tzn., že jako zdroj živin a energie využívají organické látky. Energii mohou získat odbouráváním aminokyselin (např. glutaminu) 10

nebo trikarboxylových kyselin, nejsou schopny ji získat pomocí fermentace ani oxidace sacharidů. Až na pár výjimek (např. C. gracilis) vykazují oxidázovou aktivitu a převážná většina má schopnost redukce dusičnanů (nikoliv však dusitanů). Pro celý rod je charakteristické, že nehydrolyzují močovinu, tyrosin, kasein, škrob ani želatinu, vykazují negativní testy na produkci acetoinu i na methylčerveň a netvoří pigmenty [6, 14]. C. jejuni a některé kmeny C. curvus jsou schopny hydrolyzovat hippurát. Tohoto testu se v diagnostice používá k diferenciaci klinicky nejvýznamnějších druhů C. jejuni a C. coli [6]. Bakterie rodu Campylobacter jsou citlivé k většině dezinfekčních látek včetně chlorových preparátů. Sterilační ani pasterační teploty nepřežívají [9]. Chlazení působí zastavení růstu, ale zlepší přežívání buněk v porovnání s pokojovou teplotou. Mražením je počet kampylobakterů v potravinách redukován, ale ne eliminován a bakterie mohou za příznivých podmínek přežívat i několik měsíců [13]. 2.2 Výskyt termotolerantních kampylobakterů v potravinách Potraviny, které jsou připravovány ke konzumaci, mohou být při neodborném zacházení znečištěny různými druhy mikroorganizmů a látek biologického původu, které můžou vést k onemocnění, nebo až ke smrti. Onemocnění z potravin způsobené mikroorganizmy (alimentární infekce a alimentární intoxikace) jsou vážným celosvětovým problémem a opatření na jejich prevenci se klade mezi hlavní priority v systémech bezpečnosti potravin. Ze souhrnné zprávy Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA) ze dne 14.12.2006 vyplývá, že v roce 2005 mezi alimentární infekce bakteriálního původu výrazně převažují salmonelózy a kampylobakteriózy, kdy počet hlášených případů kampylobakteriózy byl vyšší než počet hlášených případů salmonelózy. V Evropě je kampylobakterióza nejběžnějším infekčním onemocněním přenosným ze zvířat na lidi prostřednictvím potravin [15]. Srovnání kampylobakteriózy se salmonelózou je uveden v tabulce č. 2. 11

Tabulka 2: Srovnání charakteristik onemocnění způsobené Campylobacter spp. a Salmonella různými sérovary [16]. Faktor Campylobacter Salmonella Sezónní výskyt konec jara (květen), podzim (listopad) léto (srpen) Symptomy onemocnění Krvavý průjem,výjimečné Průjem, zvracení, horečka, zvracení, občasná horečka bolení hlavy Infekční dávka >500 buněk >100 000 buněk Trvání příznaků 2-14 dnů 1-7 dnů Inkubační doba 2-11 dnů 12-36 hod Teplotní rozsah pro růst ( C) 30-45 4-45 Minimální ph 5.0 4.0 Minimální vodní aktivita a w 0.98 0.94 Růst při pokojové teplotě NE ANO Růst ve vzduchu NE ANO Růst v potravinách NE ANO Pro svou epidemiologickou důležitost byl Campylobacter spp. předmětem mnoha odborných sledování na světě. V Srbsku pracovala skupina odborníků ve spojitosti s objevením a rozšířením této bakterie v tělech ovcí a jehňat. Cílem studie bylo stanovení výskytu Campylobacter spp. v játrech a v mase klinicky zdravého jatečného jehněčího a také přítomnost Campylobacter jejuni a coli v těchto vzorcích. Výsledky srbské studie, skutečně ukazují, že Campylobacter spp. byl nalezen v játrech a ve vnitřních částech klinicky zdravého jatečného jehněčího. Byla také zjištěna přítomnost Campylobacter coli ve vnitřních částech masa. Tento značný obsah vede k závěru, že podmínky v jatečném procesu, technologii výroby a otevřeném skladování vedou k možnosti nárůstu patogenu v mase [17]. 2.2.1 Potraviny živočišného původu Patogeny jsou v přírodě všudypřítomné a v důsledku toho se nacházejí v syrových potravinách rostlinného i živočišného původu, přičemž určité druhy potravin jsou jejich hlavními zdroji např. syrové drůbeží maso [3]. 12

Podle většiny autorů jsou primárním zdrojem lidských kampylobakterióz potraviny živočišného původu, liší se však názory na to, která potravina je tím nejčastějším. Podle Sterna [18] je tím nejběžnějším zdrojem nepasterizované mléko, ale například podle Steinhauserové [19] a podle Butzlera [20] je na prvním místě drůbež a její produkty. Campylobacter spp. byl izolován kromě drůbežího, hovězího a vepřového masa a masných výrobků také z ústřic, slávek, hřebenatek a krabů. Maso a masné výrobky jsou obvykle kontaminovány v průběhu porážky a následného zpracování masa. K infekci dochází po manipulaci nebo konzumaci syrových kontaminovaných potravin nebo nedostatečně tepelně opracovaných potravin [6]. 2.2.1.1 Drůbeží maso Velmi častým nositelem Campylobacter spp. jsou ptáci a drůbež, což je dáváno do souvislosti s jejich zvýšenou tělesnou teplotou, která je pro tyto bakterie příznivá (Campylobacter je schopen růstu v teplotním rozmezí 30-46 C, optimální růstovou teplotou je 42 C). Proto se za nejrizikovější potravinu z hlediska možnosti onemocnění kampylobakteriózou považuje zejména drůbeží maso [17]. Drůbež přichází do kontaktu s Campylobacter spp. až po vylíhnutí. Do stáří 4 až 5 týdnů je střevo drůbeže kolonizováno jen velmi omezeně, ale u starších kuřat se ve střevním traktu nachází Campylobacter spp. již u 30-50 % kusů. Drůbež při kolonizaci Campylobacter spp. nejeví žádné klinické příznaky onemocnění [19]. Na jatka vstupuje drůbež s vysokým počtem Campylobacter spp. ve střevech (10 5-10 9 KTJ/g), ale i na kůži a peří. Stres drůbeže během transportu na jatka způsobuje zvýšené kálení a tím i znečištění kůže a peří, což vede ke zvýšenému záchytu Campylobacter spp. na povrchu poražené drůbeže [21]. Mechanizmy kontaminace spočívají v ulpění v tekuté vrstvě na kůži brojlerů, ze které migrují do kůže. Kontaminace je zvýrazněna procesem škubání, kdy jsou péřové folikuly obnaženy a dochází k průniku kontaminantů. Míra kontaminace závisí na koncentraci mikroorganizmů ve vodě. Teploty pařící lázně vedou ke snižování počtu Campylobacter spp., ale nezničí je zcela. Kuchání drůbeže je technologický krok, při kterém se velký počet mikroorganizmů dostává do prostředí. Obsah střev znečišťuje i technologickou linku [19]. 13

K přenosu kampylobaktera na kusy poražené drůbeže dochází také při chlazení (v případě, že je drůbež chlazena vodou, která může být kontaminována prostřednictvím dříve chlazených kusů). Při rozmrazování zmrazené drůbeže za nevyhovujících hygienických podmínek může dojít ke kontaminaci vody, pracovních ploch a nástrojů [22]. Množství Campylobacter spp. v čerstvé drůbeži a produktech kolísá mezi 10 2-10 5 KTJ na kus drůbeže a mezi 10 1-10 6 KTJ na 100 g masa [23]. Vědecký Panel pro biologická rizika Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (BIOHAZ EFSA) vydal opatření, která by mohla být použita ke snížení výskytu bakterií z rodu Campylobacter u kuřat před a po porážce - tvrdí se v něm, že opatření před porážkou může snížit riziko až o 50 % (s očekávanými procentními odlišnostmi u jednotlivých členských států EU). Tyto postupy se zaměřují hlavně na prevenci vstupu bakterie do přístřeší, ve kterém jsou kuřata chována, a také na snížení počtu těchto bakterií ve střevech kuřat odesílaných na porážku. Mezi další opatření, která vedou ke snížení rizika výskytu choroboplodných zárodků kampylobakterů v řetězci výroby masa patří také: ozařování masa, kde je pravděpodobné, že se zničí všechny bakterie kampylobakterů, které mohou být v mase přítomny, zmrazování mrtvých těl po dobu 2 až 3 týdnů, což by snížilo riziko o více než 90 %, dále zmrazování mrtvých těl na krátkou dobu (2-3 dny) nebo ošetření neživého kuřecího těla horkou vodou (při 80 C po dobu 20 sekund). Při použití chemikálií, jako je kyselina mléčná, je odhad snížení rizika o 50 až 90 % [24]. Ačkoliv všechny komerční druhy drůbeže jsou nositely kampylobakterů, největší riziko jak už bylo uvedeno hrozí z kuřat, protože jejich konzumace je velmi rozšířená. Průměrná spotřeba drůbežího masa v EU je poměrně stabilní a pohybuje se kolem hodnoty 22,7 kg/osobu (viz graf 1). 14

Graf 1: Vývoj spotřeby drůbežího masa na jednoho obyvatele (kg), podle AVEC annual report 2008 [25]. V České republice je spotřeba drůbeže nad úrovni průměru států EU a vykazuje dlouhodobý růstový trend. Obecně lze říci, že spotřeba drůbežího masa byla iniciována řadou příznivých faktorů, mezi nejvýznamnější patří především jeho příznivé nutriční vlastnosti a relativně nízká maloobchodní cena, podpořena změnou životního stylu populace. Význam drůbeže jako hlavního původce onemocnění lze demonstrovat na dioxinové krizi v Belgii v červnu 1999, kdy díky medializaci případu významně poklesla spotřeba drůbežího masa a souvztažně byl v následujících měsících zaznamenán přechodný (40 %) pokles výskytu kampylobakteriózy. Dalším příkladem zřejmé korelace mezi výskytem kampylobakterové enteritidy a konzumaci drůbeže jsou nedávné obavy z nákazy ptačí chřipkou. Přes veškerá protiopatření měly tyto obavy v letech 2006 až 2007 negativní dopad rovněž na drůbežářský průmysl, přičemž vedlejším důsledkem bylo mimo jiné snížení počtu hlášených onemocnění kampylobakteriózou [25]. 2.2.1.2 Maso ostatních savců Prasata jsou dalším velmi častým rezervoárem Campylobacter spp. Ve většině případů Campylobacter spp. hraje ve střevě roli komenzálního mikroorganizmu. Vyskytují se ale názory, že tento stav může být výsledkem imunitní odpovědi na dřívější infekci Campylobacter spp. 15

Někteří autoři Park et al. [26] a Gill et al. [27] udávají výskyt Campylobacter spp. ve střevní traktu až 50 %, jiní Kwiatek et al. [28] a Lammerding et al. [29] se pohybují ve svých výsledcích v rozmezí 20-40 % pozitivních nálezů. Podle Steinhauserové [19] je výskyt Campylobacter spp. u poražených prasat značně rozdílný, především podle úrovně chovu. Jednotlivé druhy Campylobacter spp. mohou vyvolávat různé formy onemocnění. Nejčastěji se jedná o záněty střev, nebo poruchy plodnosti u řady domácích zvířat především mláďat [16]. Campylobacter spp. může způsobovat proliferativní enteritidu prasat, jehož původcem je Campylobacter hyoilei, který je geneticky blízký C. jejuni [30]. Transport a předporážkové ustájení prasat způsobuje prostřednictvím výkalů rozšíření Campylobacter spp. především na povrch těla případně do dutiny ústní. Následné omračování a vykrvování nehraje ve výskytu Campylobacter spp. podstatnou roli, zatímco výsledný efekt při paření závisí na teplotě pařící vody. Mezi další procesy z hlediska možnosti kontaminace patří odštětinování a vykolování, kdy při odštětinování dochází nejen k odstranění štětin a pokožky, ale současně také velmi často ke kontaminaci povrchu těla. Velké množství buněk Campylobacter spp. (10 3-10 6 v 1 g) je izolováno zejména z odstraněných štětin a zbytků pokožky v odštětinovacím stroji a nižší počty (10 2-10 3 v 1 ml) se vyskytují i vodě v odštětinovači. Následné technologické operace - sprchování a chlazení půlek jsou vhodné pro snížení nebo dokonce odstranění Campylobacter spp. z povrchu kusů, kdy při chlazení není rozhodující nízká teplota, ale proudění vzduchu [19]. Campylobacter spp. se vyskytuje také ve střevním traktu skotu, i když ne tak často, jako je tomu u prasat a zejména u ptáků [19]. Klinicky zdravý skot může Campylobacter spp. vylučovat svými výkaly. Uvádí se, že výskyt pozitivních nálezů je vyšší v letních měsících, a to zejména v případech pastevního skotu. Údaje o četnosti výskytu Campylobacter spp. se značně liší, ale dá se říci, že asi u 10-20 % skotu je možné ve střevním obsahu Campylobacter spp. nalézt [29]. U skotu je výskyt Campylobacter spp. značně spojen se stářím zvířat. V těle mláďat je výskyt C. jejuni mnohem větší než u dospělého skotu staršího více než 1 rok. Maximum výskytu v těle mláďat nastane 61-120 den po narození a následně klesá s věkem zvířete. Campylobacter spp. se podílí na některých průjmových onemocnění mladých 16

telat i když závěry některých autorů nejsou jednoznačné [31]. Při porážení skotu nelze vyloučit kontaminaci svaloviny a prostředí. Možnosti kontaminace svaloviny jsou především při stahování kůží a následně vykolování. Další technologické operace, především chlazení mají negativní vliv na přežívání Campylobacter spp. podobně jako je tomu u prasat [19]. 2.2.1.3 Syrové mléko Mléko je pro svou vysokou živnou hodnotu jednou z nejrizikovějších potravin, ve které velice často dochází k mikrobiální kontaminaci [32]. Syrové mléko je považováno za častý zdroj mikroorganizmů. Výskyt Campylobacter spp. v chovech dojnic může být příčinou mastitid a s tím i spojenou produkcí kontaminovaného mléka. Mastitidy vyvolané Campylobacter spp. jsou popisovány celkem vzácně [33, 34]. Mnohem častější příčinou je kontaminace mléka fekálním materiálem, způsobená zpravidla nedostatečnou hygienou při dojení. Pití syrového kontaminovaného mléka bylo již mnohokrát příčinou epidemií a sporadických případů onemocnění kampylobakteriózou. Tato skutečnost nabývá na významu v současné době, kdy je i v České republice povolen prodej syrového, nepasterovaného mléka od prvovýrobců. Popsány jsou také sporadické případy i epidemie způsobené konzumací pasterovaného mléka, kdy při došetření se vždy jednalo o sekundární kontaminaci tepelně ošetřeného mléka [19]. 2.2.2 Potraviny rostlinného původu Veškeré potraviny, s výjimkou několika druhů sterilních potravin, jsou osídleny mnoha mikroorganizmy. Mikroorganizmy vyskytující se v půdě a vodě jsou schopny přilnout na povrch rostlin, kde mohou dobře přežívat a dále se přenášet až do finálních výrobků. Při skladování mohou takové mikroorganizmy způsobovat kažení zeleniny a ovoce [35]. 2.2.2.1 Zelenina Vedle tradičních rizikových faktorů, jako je konzumace drůbežího masa a kontakt se zvířaty, patří mezi méně zjevné rizikové faktory Campylobacter spp. konzumace syrové zeleniny (rajčata, okurky). Bakterie rodu Campylobacter spp. lze izolovat ze zeleniny, kde hlavním rizikem je hnojení statkovými hnojivy [35]. 17

2.3 Výskyt termotolerantních kampylobakterů v prostředí Zástupci termotolerantních kampylobakterů, C. jejuni, C. coli a C. lari, se vyskytují nejen u různých druhů zvířat, ale také bývají izolovány z prostředí, kde se Campylobacter spp. vyskytuje zejména ve vodě [36, 37]. Bates and Phillips [38] uvádí, že Campylobacter spp. může kontaminovat všechny typy vod, a to jak povrchové a odpadní vody, tak také vodu mořskou. Povrchová voda je hlavní zásobárnou druhů Campylobacter spp. a to nejen jako potenciální zdroj infekce u lidí, ale také jako zdroj infekce jak pro drůbež tak i skot [31]. Indikátorem výskytu Campylobacter spp. ve vodách bývají často koliformní mikroorganizmy. Nález koliformních mikroorganizmů především v letních měsících však nemusí znamenat i přítomnost kampylobakterů vzhledem k jejich citlivosti na UV záření a vyšší teplotu vody [38]. Vstup kampylobakterů do povrchových vod je dán: 1) vylučováním organizmů do vody prostřednictvím vodního ptactva a racků, 2) odtokem vody ze zemědělské půdy, zejména v období silných dešťů a záplav, 3) odpadními vodami nebo odpadními kaly čistíren vod, kdy mezi nejzatíženější zdroje patří odpadní vody pocházející z porážek zejména drůbeže a dále pak prasat. Z těchto odpadních vod může být izolována celá řada kampylobakterů zvláště pak C. jejuni a C. coli [31]. V souvislosti s výskytem kampylobakterů ve znečištěných pobřežních vodách je možný i jejich výskyt v mořských produktech, jako jsou nejrůznější korýši a měkkýši [39]. Je tedy zřejmé, že nebezpečí vzniku kampylobakteriózy hrozí rovněž následkem konzumace neupravené nebo kontaminované pitné vody a různých mořských produktů [40]. Vody ošetřené chlorováním zdroj kampylobakterů nepředstavují [41]. 2.4 Výskyt termotolerantních kampylobakterů u hospodářských zvířat Úroveň výskytu Campylobacter spp. u hospodářských zvířat je závislá především na hygienických podmínkách chovu [42]. Z hlediska hygieny potravin hraje významnou roli v přenosu termotolerantních kampylobakterů na člověka především drůbež. Převažujícím druhem u drůbeže je Campylobacter jejuni [43]. Za významný zdroj kampylobakterů se považují kromě drůbeže také prasata a vepřové maso. U prasat je ve srovnání s drůbeží zaznamenáván častější výskyt druhu C. coli. Campylobacter spp. se vyskytuje rovněž ve střevním traktu skotu, kdy ale hovězí maso 18

představuje podstatně menší riziko výskytu C. jejuni a C. coli [44]. Podrobnější popis výskytu kampylobakterů u hospodářských zvířat je popsán v kapitole Výskyt termotolerantních kampylobakterů v potravinách, podkapitola 2.2.1 Potraviny živočišného původu. 2.5 Výskyt termotolerantních kampylobakterů u ostatních zvířat Častým zdrojem kampylobakterů mohou být také hlodavci, žijící volně v přírodě, ale například také mouchy žijící na drůbežích farmách a v chovech prasat. Opakované epidemiologické nálezy také ukazují na souvislosti mezi onemocněním člověka a výskytem Campylobacter spp. u domácích zvířat, především psů a koček. Psi a kočky představují riziko vzniku kampylobakteriózy zejména u dětí, které s nimi mnohdy přicházejí do velmi úzkého kontaktu [45]. Baker et al. [46] uvádí, že u psů je možné izolovat ve větší míře C. upsaliensis. 2.6 Kampylobakterióza Termotoleratní bakterie rodu Campylobacter jsou jedny z nejčastěji hlášených příčin bakteriálních enteritid nejen v Evropě ale i v dalších rozvinutých zemích, kde toto onemocnění má stále narůstající tendenci [6]. V roce 2009 bylo ve Skotsku, Anglii a Walesu hlášeno více jak 64 000 případů. Každým rokem jejich počet stoupá o 14-30 %. S ohledem na to, že velká část případů není hlášena lze odhadnout, že ročně dochází asi ke 450 000 onemocněním. Zhruba 10 % hlášených případů bývá hospitalizováno [47]. V České republice patřila kampylobakterióza na přelomu 80. a 90. let k téměř neznámým onemocněním. Četnost výskytu kampylobakterióz zaznamenala zásadní zvrat až po roce 1995, kdy se trend nemocnosti prudce zvýšil, a již řadu let má toto onemocnění stabilně vzrůstající tendenci. Počty hlášených infekcí kampylobakteriózy a salmonelózy se dlouhodobě přibližovaly (dynamiku výskytu obou onemocnění v České republice v letech 1999-2008 znázorňuje graf 2). 19

Graf 2: Dynamika výskytu kampylobakteriózy a salmonelózy v ČR v letech 1999-2008 podle EPIDAT k 20.3. 2009 [25]. Podle údajů Národního referenčního centra pro analýzu epidemiologických dat z roku 2007 překonal výskyt kampylobakterióz počtem hlášených onemocnění výskyt salmonelóz a zaujal tak přední místo ve výskytu alimentárních onemocnění. Tento stav odpovídá situaci v Evropské unii, kde kampylobakterióza spolu se salmonelózou představuje jedno z nejčastějších onemocnění tohoto typu [25]. Původcem kampylobakteriózy jsou termotolerantní patogenní druhy Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis. Nejvýznamnějším humánním patogenem je Campylobacter jejuni. Procento onemocnění zapříčiněných tímto mikrobem kolísá ve světové populaci mezi 4 až 35 % pacientů s klinicky manifestními průjmy [48]. Přírodním rezervoárem tohoto druhu je drůbež, skot, prasata, psi a kočky, ale také hlodavci a volně žijící ptáci. K onemocnění lidí dochází po požití nedokonale tepelně opracovaných surovin [49]. Obecně platí, že infekční dávka C. jejuni je nízká a existuje mnoho faktorů, které ji ovlivňují (např. imunitní kompetence hostitele). U experimentálních lidských infekcí stačilo k vyvolání nemoci jen 500 bakterií [50]. Hlavní symptomy kampylobakteriózy jsou silná bolest v dutině břišní a následný průjem. Projevem této nemoci jsou velice vodnaté, krvavé, páchnoucí a dysenterické průjmy (obsah 10 6-10 9 buněk.g -1 ). Dalšími příznaky kampylobakteriózy jsou horečka, bolest hlavy, nevolnost, zvracení, závrať a svalová bolest [51]. 20

Samotná kampylobakterióza není životu příliš nebezpečná, mnohem závažnější jsou její komplikace. Asi nejvíce diskutovanou komplikací je vznik Guillain-Barré syndromu, popř. Reiterova syndromu. Jedná se o akutní paralytické onemocnění, při kterém dochází k demyelinizaci periferních neuronů. Tento syndrom se projevuje jako sled nákaz způsobených Campylobacter jejuni [52, 53]. Základním postupem v léčbě, stejně jako u jiných průjmových onemocnění, zůstává stále rehydratace. Podávání antibiotik (erytromycin, tetracyklin, chinoliny) je indikováno jen v těžších případech [53]. Kampylobakterové enteritidy se mohou vyskytovat u všech věkových kategorií. U dětí a seniorů hrozí v některých případech nebezpečí dehydratace. U starších lidí nebo lidí s oslabenou imunitou v důsledku onemocnění, jako je například diabetes, cirhóza, rakovina a AIDS, existuje větší riziko rozvoje těžké infekce [1]. Přehled druhů, které již byly popsány jako příčina onemocnění u člověka, je uveden v tabulce 3. Tabulka 3: Druhy Campylobacter spp. způsobující onemocnění člověka [54]. Druh Známé formy onemocnění C. jejuni subsp. jejuni gastroenteritidy, septikemie, meningitidy, potraty, záněty kloubů, Guillain-Barré syndrom C. jejuni subsp.doylei gastroenteritidy, gastritidy, septikemie C. coli gastroenteritidy, septikemie, C. lari gastroenteritidy, septikemie C. upsaliensis gastroenteritidy, septikemie, abscesy C. fetus subsp. fetus septikemie, gastroenteritidy, aborty, meningitidy C. fetus subsp.veneralis septikemie C. hyointestinalis gastroenteritidy C. concius gastroenteritidy, záněty dutiny ústní C. sputorum biovar sputorum gastroenteritidy, abscesy C. curvus gastroenteritidy, záněty dutiny ústní C.rectus záněty dutiny ústní 21

2.7 Způsoby přenosu Lidé se bakteriemi rodu Campylobacter mohou infikovat přímým kontaktem se zvířaty nebo prostřednictvím kontaminovaného jídla nebo vody [53]. Vzhledem k nízké infekční dávce je možné i šíření onemocnění kontaktem s lidmi, kteří po prodělaném onemocnění vylučují kampylobaktery ve stolici [19]. Je známo, že Campylobacter jejuni, který je považován za nejčastější příčinu onemocnění, je přirozenou součástí střevního traktu řady domácích i volně žijících zvířat. Při porážení zvířat dochází ke kontaminaci povrchu těl zvířat a orgánů, které tak mohou představovat zdroj onemocnění pro člověka. Přenos přímým kontaktem z infikovaného zvířete na člověka má význam hlavně u malých dětí, které přicházejí do blízkého kontaktu s domácími zvířaty (psi a kočky). Tato domácí zvířata mohou být pouhými nositeli kampylobakterů bez žádných klinických příznaků. Riziko spočívá v přenosu fekálně - orální cestou. Druhou rizikovou skupinu tvoří zemědělci, zaměstnanci na porážkách drůbeže, veterináři, řezníci, popř. jiné osoby přicházející do kontaktu s nakaženými zvířaty [19,20]. Kampylobakterióza patří mezi onemocnění především s alimentární cestou přenosu a jako významný zdroj Campylobacter spp. pro člověka je uváděna zejména drůbež [43]. 2.8 Hygienické zásady a prevence Prevence kampylobakterióz vyžaduje monitorování a kontrolu všech článků potravinového řetězce. Nutností je podchycení výroby potravin dobrou výrobní praxí a zvláště systémem HACCP. Zavedení a dodržování stálých postupů založených na zásadách HACCP může výrazně napomoci k ochraně výrobků před mikrobiální kontaminací a ve svém důsledku snížit riziko výskytu bakteriálních alimentárních onemocnění. Dobré veterinárně hygienické postupy mohou omezit kontaminaci živočišných produktů, ale jen částečně. I přes specifická preventivní opatření není možné zcela vyloučit přítomnost Campylobacter spp. v syrových potravinách. Proto je neméně důležité zabezpečit patřičný hygienický standard provozoven (zejména provozoven společného stravování) a nepodceňovat nutnost vzdělávání a osvěty na všech úrovních [25]. Protože se drůbež považuje za hlavní zdroj lidských kampylobakterióz, prevence by měla být zaměřena na snížení koncentrace kampylobakterů ve všech fázích její produkce [19]. 22

V zahraničí vedla ozdravná opatření v drůbežářském průmyslu k dramatickému poklesu této infekce mezi lidmi. Nejvyšší hlášenou nemocnost kampylobakteriózou na světě měl v roce 2006 Nový Zéland. Po zavedení asanačních opatření a vyhlášení maximálně přípustného množství kampylobakterů ve volně prodávané chlazené drůbeži došlo k výraznému poklesu počtu lidí s kampylobakteriózou. Asanační postupy spočívaly ve zlepšení poměrů na drůbežích farmách, v prohloubení hygieny provozu a dezinfekce drůbežích jatek chlorovými přípravky, a ve zdravotní výchově spotřebitelů o správné manipulaci se zakoupenou drůbeží [47]. Prevence kampylobakterióz v domácnostech je stejná jako u jiných bakteriálních nákaz šířících se alimentární cestou. Při manipulaci s potravinami je důležité zejména zabránit křížové kontaminaci mezi syrovými produkty živočišného původu a potravinami určenými k přímé spotřebě, potraviny balit samostatně do vhodných nepropustných obalů a důsledně kontrolovat teplotu přípravy a uchovávání připravené stravy. Obecné zásady prevence alimentárních onemocnění shrnula WHO (Světová zdravotnická organizace) do tzv. pěti klíčů bezpečného stravování : 1. Udržujte čistotu 2. Oddělujte pokrmy syrové a uvařené 3. Pokrmy důkladně vařte 4. Uchovávejte pokrmy při bezpečných teplotách 5. Používejte nezávadnou vodu a suroviny Dodržování těchto zásad výrazně přispívá k eliminaci výskytu kampylobakterióz [25]. 2.9 Detekce a identifikace bakterií rodu Campylobacter spp. Přesná identifikace kampylobakterů je důležitá z hlediska epidemiologických souvislostí i ke studiu hodnocení rizik, na kterých může být založena zásahová strategie. Dnes je k dispozici velké množství různých metod a testů k odlišení druhů popř. poddruhů kampylobakterů, všechny tyto testy však mají své výhody i nevýhody [55]. Mezi nejčastější problémy izolace některých druhů Campylobacter spp. (C. upsaliensis a C.coli) patří jejich snížená schopnost nebo neschopnost růstu na univerzálních médiích doporučovaných pro izolaci Campylobacter spp. Hlavní příčinou je přídavek antibiotik jako selektivního činidla do izolačních půd. Přídavek antibiotik způsobuje pomalejší růst, kdy až po 72-96 hodinách se objevuje skromný nárust drobných kolonií 23

a některé kmeny na selektivních agarech nerostou vůbec [45]. I jiní autoři Burnens et al. [56] a Hald et al. [57] uvádějí, že asi 8 % kmenů není schopno růst na selektivních médiích. Z těchto důvodů byly zavedeny nové izolační postupy na základě filtračních technik pomocí membránových filtrů nebo upravených selektivních půd s takovými antibiotiky, která neinhibují růst např. C.upsaliensis. Další problém spočívá ve správné identifikaci izolovaných druhů. Nejčastější problémy při druhové identifikaci bývají v konfirmaci hydrolýzy hipurátu, který je pozitivní pouze u C. jejuni. Některé kmeny C. jejuni však vykazují negativní hydrolýzu hipurátu a tím v podstatě znemožňují správnou identifikaci. Významným problémem při druhové identifikaci Campylobacter spp. je také značný výskyt nalidixic acid rezistentních kmenů i kmenů rezistentních k cephalotinu. Problémem je variabilní schopnost tvorby sirovodíku C.coli na TSI agaru a slabá nebo negativní katalázová aktivita. Velkým přínosem pro správnou diagnostiku je zavedení molekulárních technik, které jsou při správném výběru metod schopny provádět rychlou a spolehlivou identifikaci [45]. 2.9.1 Metody detekce bakterií rodu Campylobacter spp. Morfologická struktura mikroorganizmů není dostatečně variabilní a nestačí na konečnou identifikaci. Pro podrobnější posouzení fenotypu je proto nutná kultivace, což je umělé pomnožení buněk (bakterií) na kultivačních půdách. Účelem kultivace je získání čisté kultury z vyšetřovaného vzorku pro další analýzy. Jako běžný postup identifikace termotolerantních kampylobakterů z humánních vzorků se považuje přímá kultivace na selektivních médiích a následné biochemické testy (často pouze jeden nebo dva). Pro úspěšnou kultivaci kampylobakterů je nutno splnit několik podmínek: správná volba pomnožovacích a pevných kultivačních půd, správné složení atmosféry a teploty [58,59]. 2.9.1.1 Kultivace bakterií rodu Campylobacter spp. Bakterie rodu Campylobacter jsou nutričně náročné a citlivé na přítomnost kyslíku v růstovém médiu. Pro kultivaci je tedy nutné použití selektivních médií. Ta musí nejen splňovat nutriční nároky, ale musí obsahovat také nezbytná zhášedla kyslíkových radikálů (např. krev, aktivní uhlí). Jako selektivní agens jsou využívány různé směsi antibiotik, které potlačují růst doprovodné střevní mikroflóry. Využívají se například 24

cefoperazon, vankomycin s kolistinem, rifampicin, bacitracin a jiné [6,19]. Kultivační média určená pro selektivní kultivaci termofilních Campylobacter spp. prošla v posledních letech značným vývojem, který je spojen s rostoucím epidemiologickým významem Campylobacter spp. Pro kultivaci Campylobacter spp. má význam používání pomnožovacích médií. Pomnožovací půdy se používají v případě, že se ve vzorku očekává jen malý počet kampylobakterů nebo přítomnost oslabených či poškozených buněk. Tento případ nastává velmi často u potravin a vody. Jako pomnožovací médium se často používá Boltonův nebo Prestonův bujón, který je vhodný pro izolaci Campylobacter spp. z potravin, vzorků pocházejících z prostředí a ze stolice nebo trusu, popř. bujón podle Parka a Sanderse, který je vhodný pro izolaci Campylobacter spp. z drůbeže. [18,19]. Další možností izolace bakterií rodu Campylobacter je použití selektivních půd, lišících se především přítomností či nepřítomností krve. Mezi půdy s přídavkem krve patří např. Butzlerovo selektivní médium nebo Skirrowovův krevní agar. Řada autorů Stelzer et al. [60], Skirow et al. [61], Weinrich et al. [62] doporučují přídavek krve, díky schopnosti krve neutralizovat vznikající peroxid vodíku, superoxidové ionty a jiné toxické kyslíkaté deriváty. Skupina kultivačních půd, která nevyžadují přídavek krve, je zastoupena agarem podle Karmaliho a CCDA agarem (dezoxycholátový agar s aktivním uhlím a cefoperazonem). CCDA agar je vhodný pro izolaci C. jejuni, C.coli, C. upsaliensis a C.lari, při teplotě 37 C, Karmali agar je vhodný pro izolaci C. jejuni a C.coli z potravin při 42 C. U těchto půd jsou výhodné vlastnosti krve nahrazovány například přídavkem heminu, aktivního uhlí nebo pyruvátu sodného [19]. Campylobacter spp. je považován za citlivý mikroorganizmus, který ke svému pomnožování potřebuje růstové faktory. Suplementy jsou přídavky do půd, které svým účinkem podporují růst žádoucí mikroflóry, usnadňují jejich diagnostiku a odstraňují konkurenční mikroflóru. Jejich složení je určeno vždy pro určitou skupinu vyšetřovaných vzorků. V případě Campylobacter spp. můžeme suplementy dělit na antibiotické a růstové. Důležitou součástí kultivace Campylobacter spp. je také i jejich kultivační prostředí. Většina autorů Acuff et al. [63] a Doyle et al. [64] doporučuje kultivovat Campylobacter spp. v atmosféře složené z 5-7 % O 2, 10 % CO 2 a 80 % N 2 nebo H 2. Tohoto složení může být dosaženo metodami biologickými, fyzikálními nebo chemickými. Praktické a pohodlné je vytváření atmosféry pomocí různých vyvíječů 25

(gas-pack). Tyto vyvíječe jsou přímo určeny pro kultivaci Campylobacter spp. a výrobce zaručuje standardní složení atmosféry [19]. Optimální teplotou Campylobacter spp. je kultivační teplota 42 C nebo teplota 37 C. Obě jsou vhodné pro působení suplementů. C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis a C. lari jsou termofilní, jsou schopny růst při 43-45 C, ale ne při 30 C. Teploty nad 43 C mohou omezit růst některých ostatních bakterií [19]. 2.9.1.2 Rychlé metody detekce Bakteriální infekce vyžadují rychlé a přesné metody detekce a identifikace infekčního agens. Alternativní způsoby detekce kampylobakterů v potravinách využívají zejména imunochemických metod [6]. Imunologické postupy, tj. zjišťování serotypu jednotlivých patogenních a toxigenních bakterií z potravin nebo klinického materiálu, mají značný význam z hygienického a epidemiologického hlediska. Prudký rozvoj imunologických metod v poslední době však umožnil použití imunochemických postupů také pro detekci nebo zjišťování počtu buněk určitého mikrobiálního druhu nebo rodu. Pro zjišťování toxinů byly vypracovány vysoce citlivé a specifické radioimunochemické postupy (RIA) i poněkud méně citlivá heterogenní kompetitivní enzymoimunochemická metoda (ELISA) [65]. Imunochemické metody představují alternativní techniky detekce kampylobakterů v různých typech vzorků. Výhodou těchto metod je jejich jednoduchost, nízké náklady a možnost testovat velký počet vzorků. Jsou založeny na interakci antigenu se specifickou protilátkou [6]. Další rychlou možností detekce jsou molekulárně biologické metody. Klasické mikrobiologické metody mají v některých případech omezení v nízké senzitivitě, omezené schopnosti identifikovat špatně kultivovatelné (subletálně poškozené) nebo nekultivovatelné mikroorganizmy nebo v nutnosti izolovat nejprve čistou kulturu mikroorganizmů. Tyto limity jsou překonatelné pomocí metod molekulární biologie, které jsou kultivačně nezávislé a vynikají rychlostí, specifitou a vysokou citlivostí. Molekulární techniky jsou založeny na detekci specifického úseku DNA nebo RNA studovaného mikroorganizmu. V mikrobiologii našly metody molekulární biologie uplatnění především při detekci virů, mykobakterií a některých dalších mikroorganizmů, u kterých není možná kultivace nebo je příliš zdlouhavá. V potravinářské mikrobiologii je poměrně často využívanou aplikací konfirmace 26

přítomnosti určitých mikroorganizmů v analyzované potravině. Základní využívanou molekulární metodou je polymerázová řetězová reakce (PCR) [66]. 2.9.2 Metody identifikace a charakterizace rodu Campylobacter spp. Identifikace a diferenciace kampylobakterů je poměrně obtížný krok vzhledem k tomu, že jsou tyto bakterie náročné na růstové podmínky a nefermentují sacharidy [6]. Metody identifikace organizmů jsou rozděleny do 2 kategorií (I.) analýza souhrnu fenotypových (zevních) znaků jedince (fenotypové metody) a (II.) analýza genomu organizmu (genotypové metody) [67]. 2.9.2.1 Fenotypové metody Většina identifikačních a rozlišujících fenotypových testů je založena na vyhodnocení morfologických znaků, nutričních požadavcích, rezistenci mikroorganizmu k různým druhům agens včetně antibiotik, teplotní toleranci a na poměrně malém počtu biochemických (enzymových) testů [68]. Pro izolaci termotolerantních druhů rodu Campylobacter spp. se v současné době používá závazný postup. Pro ČR je platná norma ČSN ISO 10272-1 nazvaná: Mikrobiologie potravin a krmiv - horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Campylobacter spp. Identifikace Campylobacter spp. je možná následně mikroskopií a řadou biochemických testů. Znázornění postupu zkoušky dle normy ČSN ISO 10272-1 je uvedeno v obr.1 [69]. 27

Obrázek 1: Schéma postupu zkoušky termofilních Camp. spp dle normy: ČSN ISO 10272-1 [69]. Zkušební vzorek ( g nebo ml) + 9 g nebo 9 ml bujonu podle Boltona Pomnožení inkubace v mikroaerobní atmosféře při 37 C po dobu 4 h až 6 h a poté při 41, 5 C po dobu 44 h +/- 4 h Izolace agar mccd + inkubace v mikroaerobní atmosféře při 41,5 C po dobu 44 h +/- 4 h charakteristické kolonie konfirmace identifikace vyjádření výsledků Biochemické testy dříve sloužily jako hlavní nástroj identifikace a druhového určení. Campylobacter spp. však vykazuje velmi nízkou biochemickou aktivitu, výběr testů je proto omezen. Výsledek druhové identifikace často stojí na jediném testu, což za nízké spolehlivosti zkoušek nezaručuje správnost výsledku. Přesto jsou tyto metody pro svou tradici, jednoduchost a nízkou cenu využívány a v rutinní diagnostice jsou v současnosti postačující metodou [6]. 28

Tabulka 4: Fenotypové rozlišení druhů Campylobacter spp. [23]. Druh C. jejuni spp. jejuni C. jejuni spp. doylei C. coli C. lari C.upsaliensis kataláza pozitivní variabilní pozitivní pozitivní slabá reakce redukce nitrátů pozitivní negativní pozitivní pozitivní pozitivní ureáza negativní negativní negativní variabilní negativní produkce H 2 S negativní negativní negativní negativní negativní hydrolýza hipurátu pozitivní variabilní negativní negativní negativní hydrolýza indolylacetátu pozitivní pozitivní pozitivní negativní pozitivní růst při 25 C negativní negativní negativní negativní negativní růst při 42 C pozitivní negativní pozitivní pozitivní pozitivní kys.nalidioxová (30 µg) citlivost citlivost citlivost rezistence citlivost cephalotin (30 µg) rezistence citlivost rezistence rezistence citlivost V mikrobiologických laboratořích je stále hojně užívána kultivace. Narostlá diagnostická kultura signalizuje přítomnost potenciálně infekčních mikroorganizmů a poskytuje materiál pro fenotypovou analýzu. Typické kolonie bakterií rodu Campylobacter spp. na selektivních agarech po 48 hodinách jsou hladké, vypouklé, lesklé se zřetelným ohraničením nebo ploché, průsvitné, s nepravidelným okrajem; barva světle šedá nebo světle krémová a velikost kolonií je průměrně 1-2 mm, ale mohou mít až 4-5 mm. Růst může být splývavý bez výrazných kolonií [66]. Podrobnější popis kultivace je uveden v kapitole Detekce a identifikace bakterií rodu Campylobacter spp., podkapitola 2.8.1.1. Kultivace bakterií Campylobacter spp. 2.9.2.2 Sérologické testy Sérotypizace je jedna z běžných metod detailní fenotypové charakterizace bakterií. Je založená na reakci antigenu a protilátky za vzniku sraženiny, zákalu nebo aglutinace. Pro kmeny C. jejuni a C. coli bylo navrženo několik sérotypizačních schémat, ovšem neznámější jsou jen dvě z nich. Liorovo schéma je založené na protilátkách proti tepelně labilnímu antigenu a na jejich průkazu přímou sklíčkovou aglutinací a Pennerovo schéma, kde je pasivní hemaglutinace založena na interakci rozpustných 29

tepelně stabilních antigenů, imobilizovaných na povrch erytrocytů se specifickými antiséry. Tato metoda zatím nenašla uplatnění při rutinní identifikaci především kvůli časové a cenové náročnosti [6,19]. 2.9.2.3 Molekulárně biologické metody Metody identifikace jsou založené na fenotypových znacích mikroorganizmů a v podstatě nám poskytují jen částečné rozlišení izolovaných kmenů. V moderní mikrobiologii se hojně využívají postupy, které jsou schopny na základě rozboru genetických informací velmi podrobně popsat jednotlivé kmeny. Přitom se často stává, že kmeny identické fenotypicky jsou naprosto rozdílné při genotypické identifikaci a naopak. Metod založených na analýze DNA je celá řada. Nejpoužívanější je metoda PCR [19]. PCR neboli polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) je speciální identifikační metoda, která byla objevena v roce 1983 Karry Mullitem. Již v roce 1985 byla vydána první odborná publikace, ve které byla poprvé použita metoda PCR [70]. Základem pro rozvoj PCR byl objev termostabilní Taq DNA polymerázy izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Tato DNA polymeráza může být opakovaně vystavena vyšší teplotě (94-95 C) potřebné pro oddělení řetězců DNA a proto není nutné přidávat enzym v každém cyklu. Principem PCR je replikace in vitro - amplifikace. Rychlost a jednoduchost patří mezi přednosti této metody. V reakční směsi je obsažen: pufr a Mg 2+ tvořící vhodné iontové prostředí pro činnost Taq polymerázy, směs čtyř deoxynukleotidtrifosfátů, pár primerů od nichž začíná syntéza druhého komplementárního vlákna DNA a Taq DNA polymerázu [71]. Jak uvádí Šmarda et al. [72] při polymerázové řetězové reakci se pravidelně střídají tři kroky, během nichž probíhají tři odlišné děje s odlišnými nároky na teplotu: 1) denaturace dvouřetězcových molekul DNA při 94 C, 2) nasedání primerů na oddělené řetězce DNA při 50-65 C, 3) syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím DNA - polymerázy při 72 C. Tento třístupňový cyklus, mnohokrát se opakující po sobě následujícími kroky denaturace, hybridizace cílové DNA a prodlužování řetězce DNA zabezpečuje identifikaci cílové DNA. Může být opakován, jak často je potřeba. Nové DNA sekvence slouží jako předloha pro další cykly k vytvoření nových vláken. 30

V současnosti je provádění PCR plně automatické užitím termálních cyklovačů. Toto zařízení opakuje stejný program (94 C - 40 až 60 C - 72 C). Tímto způsobem lze za necelé dvě hodiny vytvořit až miliardu kopií dané DNA sekvence, což je dostatečné množství k detekci DNA. Následně musíme výsledný produkt PCR nějak vyhodnotit. K tomuto účelu slouží nejčastěji elektroforéza, která pracuje na principu pohybu záporně nabitých molekul DNA v elektrickém poli. Výsledkem takovéto separace je rozdělení molekul DNA podle jejich velikosti. Velikost molekuly DNA se stanoví srovnáním se standardy [73,74]. PCR má velmi široké použití, v mikrobiologii se využívá například k detekci patogenních mikroorganizmů a virů v potravinách, vodě a půdě [75]. 31