Rodina proteinů 14-3-3: Dvojsečná zbraň v nádorové biologii

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Rodina proteinů 14-3-3: Dvojsečná zbraň v nádorové biologii Bakalářská práce Brno 2011 Jana Nováková

Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala Mgr. Pavlu Bouchalovi PhD. za odborné vedení, rady a korekce, poskytnuté materiály, cenný čas a za laskavý přístup. Také Mgr. Ivě Struhárové za neocenitelnou pomoc při provádění experimentu a jeho vyhodnocování, stejně tak jako za vstřícnost. Děkuji Mgr. Jakubu Tremlovi za vytvoření elektronické formy schémat působení proteinů 14-3-3 v G 1 /S a G 2 /M kontrolních uzlech buněčného cyklu. Zároveň bych tímto ráda vyjádřila vděčnost své rodině a přátelům za blízkost a podporu během studia. Můj největší dík patří mému Bohu, Ježíši Kristu. Práce byla řešena v rámci grantového projektu Grantové agentury České republiky č. P304/10/0868 a s podporou Evropského fondu pro regionální rozvoj (RECAMO; CZ 1.05/2.1.00/03.0101). Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci Rodina proteinů 14-3-3: Dvojsečná zbraň ve vývoji nádorů vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Pavla Bouchala PhD. za použití uvedených zdrojů a literatury. V Brně, 10. 05. 2011 Jana Nováková 2

Informovaný souhlas pacientů Pacienti Masarykova onkologického ústavu (MOÚ) dávají informovaný souhlas s podstoupením operačního výkonu. MOÚ užívá řadu informovaných souhlasů podle účelu a povahy výkonu. Součástí souhlasů jsou také prohlášení, že pacient souhlasí s tím, že: v rámci běžných diagnostických postupů byl odebrán z jeho těla biologický materiál, který může být použit pro výzkumné účely a aby údaje z jeho zdravotnické dokumentace (demografické údaje, údaje o zdravotním stavu, údaje o poskytnuté zdravotní péči) mohly být využívány zdravotnickými pracovníky MOÚ pro vědecké studie v oboru lékařské vědy či v příbuzném oboru s tím, že mimo zdravotnické pracovníky MOÚ budou tyto údaje sdělovány výlučně v anonymizované podobě, tj. nikdo z těchto údajů nepozná, že se týkají pacientovy osoby. 3

OBSAH 1. SEZNAM ZKRATEK... 6 2. ÚVOD... 8 3. TEORETICKÁ ČÁST... 9 3.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA PROTEINŮ 14-3-3... 9 3.1.1 Objevení a název... 9 3.1.2 Výskyt... 9 3.1.3 Struktura... 10 3.1.4 Vazebné vlastnosti... 11 3.1.5 Význam a funkce... 14 3.2 REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU... 16 3.2.1 Přechod z G 2 fáze do mitózy... 17 3.2.2 Přechod z G 1 do S fáze... 19 3.2.3 FOXO... 20 3.3. APOPTÓZA... 21 3.3.1 Rodina Bcl-2... 21 3.4 POTENCIÁLNÍ ONKOGENY... 23 3.4.1 Ras-Raf-MAPK... 23 3.4.2 Bcr-Abl... 23 3.4.3 Cbl... 24 3.4.4 IGF-IR-IRS-1-PI-3K... 24 3.4.5 TERT... 24 3.4.6 Histonové deacetylázy (HDACs)... 25 3.4.7 Integriny... 25 3.5 14-3-3Σ (STRATIFIN)... 26 3.5.1 Struktura... 26 3.5.2 Regulace exprese 14-3-3σ... 27 3.5.3 14-3-3σ a vznik nádorů... 29 3.5.4 Metastázování a invazivita nádorů... 30 3.5.5 Terapeutika... 31 3.6 PRINCIP POUŽITÝCH METOD... 32 3.6.1 SDS Gelová polyakrylamidová elektroforéza (SDS PAGE)... 32 3.6.2 Western Blotting... 32 3.6.3 itraq-2dlc-ms/ms... 33 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 35 4.1 MATERIÁL A METODY... 36 4

4.1.1 Přístroje a materiál... 36 4.1.2 Použité chemikálie... 36 4.1.4 Metody... 38 4.2 VÝSLEDKY... 40 5. DISKUSE... 43 6. SOUHRN... 45 7. SUMMARY... 46 8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 47 5

1. SEZNAM ZKRATEK Abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 ADAM22 a disintegrin and metalloprotease domain 22 AKT proteinová rodina protein kinas b APS ammonium persulphate ASK apoptosis signal-regulating kinase BAD Bcl-2-associated death promoter BAK Bcl-2 homologous antagonist/killer BAX Bcl-2 associated X protein Bcl-2 B-cell lymphoma 2 Bcl-X L B-cell lymphoma-extra large Bcl-X S B-cell lymphoma-extra small Bcr breakpoint cluster region Bfl-1/A1 B cell lymphoma-2 related gene expressed in fetal liver-1/a1 BID BH3 domain interacting death agonist BRCA1 breast cancer growth suppressor protein 1 BSA bovine serum albumin Cbl casitas B-lineage lymphoma CDC2 cell division control protien 2 CDC25 cell division cycle 25 Chk1 checkpoint kinase 1 CDK cyclin-dependent kinase CRD cysteine rich domain CSB complete sample buffer C-TAK1 Cdc twenty-five C associated protein kinase DEAE diethylaminoethanole DNMT DNA methyltransferase ECL enhanced chemiluminiscence EFP estrogen-induced zinc finger protein FOXO the forkhead box O G x fáze gap phase 6

GPIbα glycoprotein Ib α HDACs histone deacetylases HPLC high performance liquid chromatography IGF-1R insulin-like growth factor 1 receptor IRS-1 insulin receptor substrate 1 itraq-2dlc- MS/MS isobaric tags for relative and absolute quantification and twodimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry M fáze mitosis phase MAPK mitogen-activated protein kinase Mcl-1 induced myeloid leukemia cell differentiation protein MEK = MAPKK mitogen-activated protein kinase kinase MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOÚ Masarykův onkologický ústav NHS N-hydroxysuccinimide P130Cas protein 130 Crk-associated substrate p27 KIP1 protein 27 PBS phosphate buffered saline PI-3K phosphatidylinositol 3 kinase Raf rapidly accelerated fibrosacroma RAMPx rabbit anti mouse peroxidase Ras rat sarcinoma S fáze synthesis phase SDS sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N, N, N, N - tetramethylethylendiamin TERT telomerase reverse transcriptase TRP tetratricopeptide repead helices 7

2. ÚVOD Rodina proteinů 14-3-3 je velmi rozmanitá, přitažlivá a rozhodně ne nudná. Je zapojena v mnoha buněčných pochodech u živočichů i rostlin. Tato bakalářská práce však bude věnována okruhu jejich působení, o němž se ve společnosti mluví lehčeji, netýká-li se přímo nás nebo někoho blízkého, nikdy však ne lehce. Jde o rakovinu. Jak již název práce napovídá, proteiny 14-3-3 zde budou nastíněny jako dvojsečná zbraň v nádorové biologii. Nebo možná jako herci. Herci s mnoha rolemi a mnoha tvářemi. Rádi se převlékají z jedné role, z jedné funkce v buňce, do druhé a nasazují si při tom masky. Jednou milé a dobré, když buňce s poškozenou DNA nedovolí pokračovat v buněčném cyklu, jindy zlé a škaredé, pokud té samé buňce umožní neuposlechnout příkaz o tom, že má raději sama sebe zabít, než aby později zničila celý organismus. K důkladnému pochopení charakteru divadelních postav je často potřeba podívat se i za jeviště do míst, která se samotným představením na první pohled příliš nesouvisí. Zaměříme se tedy i na strukturu a vazebné vlastnosti 14-3-3, protože právě z nich vyplývá způsob, jakým 14-3-3 interagují s klientními proteiny. Hlavním hrdinou dramatu je 14-3-3σ, známý také jako stratifin. Ani kladný, ani záporný. I u něho se projevuje rozpolcený charakter vlastní celé rodině. Točit se kolem něj budeme rovněž v experimentální části práce. Všem čtenářům přeji, aby si na následujících stranách užili dobrodružství s rodinou 14-3-3 a aby je uchvátila tak, jako si získala mě. 8

3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA PROTEINŮ 14-3-3 3.1.1 Objevení a název Proteiny 14-3-3 jsou hojně se vyskytující polypeptidy kyselé povahy, o velikosti monomeru 28-32 kda [1, 2] a velkém množství isoelektrických bodů [8]. Poprvé je identifikovali Moore a Perez v roce 1967 [3, 10, 12, 15], řidčeji se můžeme setkat i s letopočtem 1968 [11, 13]. Stalo se tak během analýzy proteinového složení hovězí mozkové tkáně, se zaměřením na bílkoviny rozpustné ve vodě. Při práci využívali podomácku vyrobenou aparaturu pro DEAE-celulózovou chromatografii a s její pomocí získané frakce dále vyhodnocovali elektroforézou na škrobovém gelu [8, 10, 12, 15]. A právě díky těmto dvěma separačním metodám dostaly 14-3-3 své neobvyklé jméno. Z chromatografické kolony totiž vystoupily ve 14. frakci a v následujícím kroku se staly součástí podílu nazvaného 3.3 [12]. Rodina 14-3-3 má různý počet členů v závislosti na zkoumaném organismu, u savců jich však najdeme sedm. Své pojmenování isoformy dostaly podle pořadí, v jakém eluovaly z HPLC [13]. Rozeznáváme tedy 14-3-3 β, γ, ε, ζ, σ, τ a 14-3-3 η [1, 2, 4, 5, 6]. Fosforylovaná forma 14-3-3β se značí jako α a pokud se setkáme se 14-3-3δ, jde o fosforylovanou 14-3-3ζ [15]. Každá z isoforem je kódována svým vlastním, charakteristickým genem [2, 4]. 3.1.2 Výskyt Rodina proteinů 14-3-3 vykazuje vysokou homologii a nachází se ve všech eukaryotických organismech od kvasinek přes octomilky a africké žáby rodu Xenopus [4] až k savcům [2] včetně člověka [4]. Přičemž u kvasinek, Drosophila a Caenohabditis elegans se vyskytují dvě isoformy, u rostlin třináct (podle některých zdrojů patnáct [10, 14]) a u savců sedm [2]. A právě těmito sedmi členy rodiny 14-3-3 se budeme dále zabývat. Je důležité, že každý ze sedmi podtypů má jiné rozšíření a lokalizaci. 9

14-3-3ζ se ve vysoké koncentraci nachází v šedé hmotě mozkové. Isoformy β, γ a η nalezneme především v Purkyňových buňkách mozečku, ε v hypofýze a τ v gliových buňkách bílé hmoty [15]. Jednotlivé isoformy jsou vysoce konzervativní a jsou přítomny nejen v mozku, ale i v různých lidských tkáních [7]. Například 14-3-3 τ a σ jsou ve zvýšeném množství exprimovány v epiteliálních buňkách a T lymfocytech [12, 13]. Rozdíly v distribuci a množství odrážejí funkční rozdílnost jednotlivých podtypů [15]. 3.1.3 Struktura Trojrozměrná struktura proteinů 14-3-3 byla odhalena rentgenovou strukturní analýzou u krystalů isoforem ζ a τ. S ohledem na vysokou homologii v rámci celé rodiny lze výsledky zobecnit na celou skupinu [8, 12]. Sekvenční homologie je vysoká jak v rámci jednotlivých isoforem, tak i mezi 14-3-3 vyskytujícími se u různých živočišných druhů [15]. Proteiny 14-3-3 se pořadím aminokyselin a tím pádem i strukturou odlišují od většiny ostatních bílkovin. Jedinou významnější podobnost lze najít v oblasti TRP (tetratricopeptide repeat helices), která se nachází u širokého spektra proteinů. Skládá se ze sady 3-16 motivů, které dohromady zformují nosné struktury schopné zprostředkovávat spojení mezi dvěma proteiny i sdružování multiproteinových komplexů [12]. Struktura monomeru Každý monomer se skládá z devíti antiparalelně uspořádaných α helixů [3], seskupených do N-koncové a C-koncové domény [12], takže v konečném důsledku vytvářejí formaci, která připomíná písmeno L [8] nebo třeba šálek na čaj [14]. Vnitřní část struktury se skládá ze čtyř helixů: α 3 a α 5, které obsahují polární, nabité aminokyseliny α 7 a α 9 s vysokým obsahem nepolárních, hydrofobních aminokyselin [8]. Velmi zajímavý je fakt, že struktura vnitřní části, tvořící vazebnou kapsu, je v rámci celé proteinové rodiny víceméně konzervativní. Naproti tomu vnější povrch monomeru vykazuje vysokou variabilitu [3]. 10

Struktura dimeru Monomery proteinů 14-3-3 mají schopnost se samy sdružovat do homo nebo heterodimerů s tím, že někteří členové rodiny především σ a γ upřednostňují homodimerizaci, zatímco jiní hlavně ε preferují tvorbu heterodimerů [1]. Dimerizace nastává mezi N-koncovými doménami [12]; tedy mezi helixem α 1 prvního a řetězci α 3 a α 4 druhého monomeru. A právě vysoká podobnost v pořadí aminokyselin u α 1 a α 3 umožňuje výše zmíněnou heterodimerizaci [8]. Ale nezávisle na tom, jestli se dimer skládá ze dvou stejných nebo různých podjednotek, má vždy podobný tvar. Při pohledu zepředu připomíná řecké písmeno ω. Jeho vnitřní část je tvořena helixy α 1, α 3 a α 4 a šroubovice α 5 až α 9 jsou uskupeny do vnější struktury, která ohraničuje jako zeď dvě vnitřní vazebná místa pro ligandy z řad peptidů nebo proteinů [12]. Jsou uspořádána opačným směrem, jakoby naproti sobě [3, 12]. Tento fakt je velmi důležitý pro pochopení funkcí proteinů 14-3-3. Díky dvěma vazebným místům mohou současně interagovat s: dvěma klientními proteiny a upravovat tak jejich aktivitu a účinky. Je pravděpodobné, že tento způsob existuje jen pro určité, specifické páry. Příkladem může být třeba souběžné vázání Raf-1 s Brc nebo A20. (Fyziologický dopad zatím nebyl objasněn.) pouze jediným proteinem, ovšem za vzniku daleko pevnější vazby, pokud ligand obsahuje vazebné motivy s nízkou schopností interakce. Za tuto skupinu můžeme jmenovat například Cbl. Nebo, pokud protein obsahuje dvě vazebná místa s vysokou afinitou ke 14-3-3, např. Raf-1, má spojení za následek změnu jeho konformace a tím pádem i funkce [3]. Jak nepřímo vyplývá z výše uvedeného, ke vzniku interakce musí být přítomen motiv o specifické struktuře nejen na 14-3-3, ale i na proteinu, který se s ním váže. Jelikož se jedná o velmi důležitou problematiku, bude jí věnována následující podkapitola. 3.1.4 Vazebné vlastnosti Homo i heterodimery proteinů 14-3-3 interagují s řadou buněčných proteinů, jejichž počet se podle střízlivých odhadů pohybuje kolem dvou set [6], jiné zdroje mluví až o sedmi stech [4]. Jiné označení pro ně zní klientní proteiny. V antickém světě se klientem rozuměla osoba závislá na svém ochránci, zatímco v současném jazyce je jako klient 11

označován spíše někdo, kdo využívá služby jistého odborníka [9]. A přesně tyto dva významy vystihují vztah proteinů 14-3-3 a jejich ligandů. V důsledku vazby na protein rodiny 14-3-3 u klientního proteinu může dojít k aktivaci nebo represi jeho enzymové aktivity či funkce, zamezení jeho degradace či zabránění pohybu proteinu z cytoplazmy do jádra nebo naopak [4]. Vazebné motivy klientních proteinů Jak bylo objasněno výše, struktura vazebného místa je vysoce konzervativní, dokonce i mezi jednotlivými členy rodiny 14-3-3. A proto musí ligandy obsahovat taktéž vysoce konzervativní vazebné motivy. Většina z nich je závislá na předchozí fosforylaci, avšak malé množství proteinů se může vázat na 14-3-3 pomocí specifických sekvencí, které fosforylaci nevyžadují [4]. Motivy spojené s fosforylací K jejich odhalení došlo pomocí kinázy Raf [12]. Ukázalo se, že předchozí fosforylace proteinu je nepostradatelná pro jeho navázání na 14-3-3. Muslin et al. poskytli důkaz o dvou vazebných motivech: RSXpSXP (modus 1) je podporovaný v pozici -1 aromatickými nebo kladně nabitými aminokyselinami RXXXpSXP (modus 2), u něhož nacházíme aromatické aminokyseliny v pozici -2, aminokyselinové zbytky s kladným nábojem v poloze -1 a Leu, Glu, Ala nebo Met v poloze +1 [15] V obou případech ps znamená fosfoserin [1], X značí aminokyselinu. Nově došlo k objevení C-koncového vazebného motivu SWTX (modus 3), známého u šesti vazebných proteinů; X znamená jakoukoli aminokyselinu kromě prolinu [14]. Mezi ligandy rodiny 14-3-3, které jsou závislé na fosforylaci, patří například [11]: o kinázy (Raf-1, kináza MEK, kináza P13) o receptory (receptor pro glukokortikoidy) o enzymy (tyrosin a tryptofan hydroxyláza, N-acetyltransferáza) o strukturní a cytoskeletální proteiny (vimentin a keratiny) o proteiny zapojené v regulaci buněčného cyklu (CDC25, p53, p27 a WEE1) o transkripční faktory (proteiny vážící se na TATA-box) 12

o proteiny navozující apoptózu (BAD) Motivy nezávislé na fosforylaci Ačkoli většina, minimálně více než polovina [14], proteinů využívá pro spojení se 14-3-3 fosforylované sekvence, není tomu tak ve všech případech. Proteiny 14-3-3 jsou schopné interakce i s nefosforylovanými ligandy a je více než pravděpodobné, že obě dvě skupiny využívají totéž vazebné místo na 14-3-3. Napovídá tomu i fakt, že interakce s nefosforylovanými klientními proteiny neproběhne v přítomnosti fosforylovaných ligandů. Tato třída klientních proteinů využívá dva vazebné motivy [3]: RSESEE, který je podobný již zmiňovanému modu 1, tedy RSXpSXP RSX 1-3 E motiv objevený s využitím bakteriofágních proteinů Z proteinů, které se váží s 14-3-3 nezávisle na fosforylaci, lze jmenovat například [10, 3]: o Exoenzym S o R18 o Raf-1, která obsahuje třetí, na fosforylaci nezávislé místo pro vazbu 14-3-3, velmi bohaté na Cys. Bývá proto označováno jako CRD (cysteine-rich domain) o GPIbα nacházející se v krevních destičkách o 5-fosfatáza Na první pohled by se mohlo zdát, že ligandy se sekvencí, jenž nevyžaduje fosforylaci, jsou znevýhodněné oproti silnější a početnější skupině. Není to však pravidlem, neboť vazba, kterou vytvoří, je velmi stabilní a vysokoafinitní, srovnatelná s vysokoafinitní u fosforylovaných proteinů, které ji však ne vždy musí vytvořit [3], jak bude vysvětleno dále. Síla interakce Nezávisle na potřebě fosforylace se zdá, že různá vazebná místa se na 14-3-3 váží s různou silou či razancí a pokud je jich na proteinu víc, jejich účinek se násobí. Ligand se dvěma motivy se váže třicetkrát silněji než ten s jedním. U většiny proteinů najdeme jedno hlavní místo, které plní roli strážce nebo vrátného. Pokud chybí nebo není fosforylované, afinita druhotných vazebných míst k 14-3-3 je příliš slabá na to, aby přerostla ve stabilní interakci. Na druhou stranu, když je dominantní místo fosforylované a spojí se s jedním z vazebných míst v molekule dimeru 13

14-3-3, druhotná místa jsou rovněž schopná interakce a dodávají celému komplexu mnohem vyšší stabilitu. 3.1.5 Význam a funkce V době svého objevu byly 14-3-3 považovány za sice hojně rozšířené (tvoří 1% všech ve vodě rozpustných bílkovin v centrální nervové soustavě [3]), avšak funkčně nikterak důležité proteiny. Na své znovuobjevení si musela tato jedinečná rodina zhruba dvě desetiletí [15] počkat. První funkcí, připsanou těmto proteinům, byla aktivace tyrozinových a tryptofanových hydroláz, což jsou enzymy podílející se na syntéze serotoninu, katecholaminu, dopaminu a dalších neurotransmiterů. Následně se ukázalo, že regulují (konkrétně inhibují) aktivitu protein kinázy C a jsou schopny interakce s Brc. Od tohoto objevu byl již jen krůček ke zjištění, že tvoří komplexy s nepřeberným množstvím kináz, fosfatáz a dalších proteinů [12], které kontrolují například [2, 4, 12, 13]: průběh buněčného cyklu (CDC25) vnitrobuněčnou signalizaci (Raf-1) odpověď na stres a apoptózu (BAD, což je protein vázající se na Bcl-2) regulaci transkripce buněčný metabolismus integritu cytoskeletu Mimo to hrají díky svému přirozenému výskytu v savčím mozku roli při vzniku neurodegenerativních onemocnění jako je Creutzfeldt-Jakobova nemoc nebo Alzheimerova a Parkinsonova nemoc [12]. To staví 14-3-3 do role velice důležitých buněčných regulátorů a mnohé způsoby jejich působení jistě ještě čekají na své odhalení. Následující kapitoly však budou pojednávat o úloze 14-3-3 v oblasti vývoje nádorů. Na základě mnohých výzkumů má největší vliv při tomto procesu jejich zapojení v regulaci buněčného cyklu a apoptózy. Následně se více zaměříme na negativní stranu charakteru 14-3-3 shrneme si jejich roli ve tvorbě nádorů, kdy se mohou chovat jako 14

možné onkogeny. Tento potenciál je dán schopností regulovat rozmanité produkty vzniklé transkripcí onkogenů stejně jako produkty genů, jenž vznik nádorů potlačují [14, 15]. V předposlední kapitole teoretické části se zastavíme u zcela výjimečného člena rodiny 14-3-3, a to u isoformy σ. Ze strukturních odlišností pochopíme důvody jeho jedinečné reaktivity, shrneme způsoby, jakými může být regulován a nakonec bude rozvinuta i jeho úloha v tumorigenezi, metastázování nádorů a ve spojitosti s nádorovými terapeutiky. 15

3.2 REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU V následujících dvou kapitolách rozebereme úlohu 14-3-3 v průběhu života buňky i při její smrti: buněčný cyklus a apoptózu. Čtenář při tom bude mít možnost porozumět dvojsečnému charakteru 14-3-3 ve vývoji a vzniku nádorů. Buněčný cyklus je uspořádaný sled událostí v životě eukaryotické buňky, od jejího vzniku dělením rodičovské buňky až do jejího vlastního rozdělení na dvě nové buňky. Skládá se z fází M, G 1, S a G 2 [30]. Zdárný průběh buněčného cyklu je velmi důležitý pro udržení integrity genomu. Proto se hned několik kontrolních mechanismů stará o to, aby buňka do další fáze cyklu vstoupila až po zkontrolování dokončení fáze předchozí [4]. V buňce proto nalézáme tzv. řídící soustavu buněčného cyklu. Občas bývá přirovnávána k programátoru automatické pračky. Stejně jako on pracuje i řídící soustava samovolně, poháněna zabudovaným časovačem. A stejně jako prací cyklus je i ten buněčný ovlivněn vnějšími (u pračky např. dodávka vody) i vnitřními (čidla hlídající, kdy se buben naplní vodou) zásahy. Buněčný cyklus lze takto ovlivnit ve třech místech, nazývaných jako kontrolní nebo též rozhodovací uzly. Nacházejí se v G 1, G 2 a M fázi [30]. Rodina proteinů 14-3-3 je významně zapojena v G 2 a G 1 kontrolním uzlu buněčného cyklu [4]. Obr. č. 1: Řídící soustava buněčného cyklu na mechanickém modelu [30]. 16

3.2.1 Přechod z G 2 fáze do mitózy U dělící se buňky se střídá mitotická fáze s interfází, růstovým obdobím. Po první části interfáze (G 1 ) následuje S-fáze, kdy se zdvojují chromozomy. Závěrečná část interfáze se označuje G 2. V průběhu M-fáze dochází k rozdělení jádra na dvě dceřiná se stejnou genetickou informací [30]. Stěžejním regulačním krokem pro přechod G 2 /M je u eukaryot aktivace komplexu CDC2-cyklin B, který spouští vstup do mitózy a stal se proto díky této své funkci rovněž známý pod názvem faktor podporující M-fázi. Hlavním místem zásahu regulačních faktorů je v komplexu právě protein kináza CDC2. Aktivuje se defosforylací [3, 24]. Obr. č.2: Schématické působení 14-3-3 v souvislosti s komplexem CDC2-cyklin B v G 2 /M kontrolním uzlu buněčného cyklu (nakresleno podle [4]). CDC25 Fosfatáza CDC25 je klíčový aktivátor kinázy CDC2. Není proto překvapením, že díky své důležitosti je silně regulována [3]. V následující části budou shrnuty hlavní regulátory, mezi nimiž mají výsadní postavení právě proteiny 14-3-3. Proteiny 14-3-3 Ovlivňují fosfatázu CDC25 dvěma způsoby. Jednak změnou funkce a jednak změnou lokalizace. Během interfáze, kdy je nežádoucí vstup do mitózy, je CDC25 deaktivována vazbou 14-3-3 po předchozí fosforylaci. Pokud je 14-3-3 neschopen vazby, dojde ke vstupu do mitózy i v případě poškození DNA. 17

Aby mohla CDC25 vykonávat svou funkci iniciátora mitózy, je potřebný vstup do jádra, kde se nachází CDC2. Interakce se 14-3-3 velmi dobře koreluje s jejím umístěním v cytoplazmě, ačkoli mechanismus tohoto děje nebyl doposud spolehlivě objasněn. Vlastní interakce CDC25-14-3-3 rovněž podléhá regulaci. Kinázy jako Chk1, Chk2 nebo C-TAK1 specificky fosforylují v reakci na buněčné signály fosfatázu CDC25 na Ser216 [3, 4, 25]. Chk1 Po poškození DNA je aktivována Chk1 [11], která, jak už bylo zmíněno výše, fosforyluje CDC25. K její aktivaci je však potřebná i vazba 14-3-3 [4], což znamená, že 14-3-3 jsou jí nejen regulovány, ale vystupují rovněž jako její regulátory. WEE1 Tato kináza inaktivuje komplex CDC2-cyklin B fosforylací CDC2. Rovněž patří mezi regulační cíle 14-3-3. Při společné expresi WEE1 a 14-3-3β roste účinnost WEE1 a tím i zabránění vstupu buňky do mitózy. Avšak isoforma τ má na WEE1 naprosto opačný účinek: pokud se na ni po předchozí fosforylaci naváže, deaktivuje WEE1 rozpadem v cytoplazmě. To umožňuje vstup do mitózy. Tyto poznatky nutně vedou k závěru, že jednotliví členové proteinové rodiny 14-3-3 mají při regulaci buněčného cyklu odlišné funkce [4, 24]. Protein 14-3-3σ (Stratifin) Po poškození DNA se zvýší produkce 14-3-3σ. Jistou úlohu sehrává i BRCA1 ve spolupráci s p53. Stratifin inaktivuje CDC2 a zabraňuje tím vstupu buňky do mitózy [4]. Děje se tak změnou její lokalizace, protože 14-3-3σ znemožní vstup do jádra a tím pádem i zahájení mitotické fáze [3]. Buňky, kterým chybí 14-3-3σ, po poškození DNA ztrácí schopnost zastavit se v G 2 /M kontrolním bodu a začnou se nekontrolovatelně dělit [4]. Pokud bychom tedy měli shrnout funkci 14-3-3 při přechodu z G 2 do M fáze buněčného cyklu, lze konstatovat, že po poškození DNA či jiných signálech zadržují buňku v G 2 fázi a brání jejímu dalšímu dělení. 18

3.2.2 Přechod z G 1 do S fáze Tento kontrolní uzel se zdá být pro většinu buněk nejdůležitějším. Jestliže v něm buňka obdrží signál, obvykle dokončí cyklus a rozdělí se. Jestliže v tomto bodu naopak spouštěcí signál neobdrží, přenese se do nedělícího se stavu, nazývaného G 0 fáze. V té se nachází většina buněk lidského těla [30]. Pro přechod G 1 /S je rozhodující přítomnost a aktivita CDK komplexů, analogů mitotického komplexu CDC2-cyklin B. Pro svoji důležitost jsou i ony vysoce regulovány různými molekulami, mezi nimiž jsou opět důležité 14-3-3. V následujících podkapitolách budou uvedeny podrobnější informace o jednotlivých regulátorech CDK komplexů, které souvisejí se 14-3-3 [4]. Obr. č. 3: Schématické působení 14-3-3 v souvislosti s komplexem CDK-cyklin v G 1 /S kontrolním uzlu buněčného cyklu (nakresleno podle [4]). CDC25A Fosfatáza CDC25A zaujímá funkci ústředního regulátora v tomto kontrolním bodě buněčného cyklu. Defosforyluje CDK2 na Thr-14 a Thr-15 a tím jí umožňuje vykonat její úlohu. Proteiny 14-3-3 ji inaktivují rozpadem v cytoplazmě. 14-3-3σ Stratifin je v rámci své rodiny skutečně výjimečný, neboť jako jediný může interagovat přímo s kinázami CDK2 a 4. Výzkumy ukázaly, že 14-3-3σ zabránil inaktivací činnosti komplexu CDK-cyklin pokračování buněčného cyklu u buněk rakoviny prsu [4]. 19

p27 KIP1 Tento buněčný regulátor inaktivuje komplex CDK-cyklin a zapříčiňuje tím zastavení v G 1 fázi buněčného cyklu [4]. Plní tedy funkci nádorového supresoru a jeho hladina je snížena v mnoha typech lidských nádorů [2]. Jestli však p27 KIP1 bude skutečně působit jako inhibitor, závisí na jeho koncentraci, případné vazbě s dalšími komplexy a jeho lokalizaci. A právě umístění je regulováno fosforylačně-dependentní vazbou s proteiny rodiny 14-3-3. Je k němu, jako ve většině případů, potřebná předchozí fosforylace, o níž se stará kináza zvaná AKT. Svou práci může vykonat na dvou odlišných threoninových zbytcích: Po fosforylaci na Thr-198 se p27 KIP1 váže s 14-3-3ε, η a τ ( nikoli však s β a ζ) a je zadržen v cytoplazmě. To znamená, že AKT tímto způsobem podporuje aktivaci CDK a pokračování v buněčném cyklu. Pokud proběhne fosforylace na Thr-157, vytvoří se vazebné místo pro 14-3- 3β, ε, γ, τ, ζ (avšak nikoli pro σ) a dochází k přemístění p27 KIP1 v cytoplazmě a opět se tím otevírá cesta k pokračování v buněčném cyklu [4]. Jde tedy o v této skupině výjimečný případ, kdy 14-3-3 nezastavily, ale pomohly spustit průběh buněčného cyklu. 3.2.3 FOXO Transkripční faktory FOXO (the forkhead box O) neovlivňují přímo aktivitu CDK ani CDC2 komplexů. Jejich vliv na průběh buněčného cyklu je však natolik významný, že je nelze opomenout. Jde o klíčové regulátory funkcí inzulinu a ostatních faktorů, které aktivuje níže zmíněná dráha PI-3K-AKT. Jsou zapojené v mnoha biologických procesech, jako je délka života buňky, buněčná smrt a buněčný cyklus [2]. Konkrétně v buněčném cyklu zprostředkovávají zastavení v G 1 fázi aktivací genu pro p27 KIP1, která probíhá přes jednu z isoforem 14-3-3. Zároveň jsou zapletené do regulace přechodu z G 2 do M fáze buněčného cyklu. Zřejmě i v tomto případě jsou zapojené proteiny 14-3-3 [4]. Znamená to tedy, že transkripční faktory FOXO patří mezi nádorové supresory a rodina 14-3-3 jejich práci zdárně podporuje. 20

3.3. APOPTÓZA Apoptózou rozumíme konečné stádium geneticky řízeného děje, kdy geny, které jsou naprogramované k buněčné smrti, spustí na základě určitých podnětů kaskádu sebevražedných proteinů [30]. Fenomén programované buněčné smrti je běžným jevem u obratlovců i bezobratlých a poprvé byl pozorován v 50. letech 20. století. Sehrává důležitou úlohu v mnoha fyziologických pochodech, jako je například embryonální vývoj, homeostáza již diferenciovaných tkání nebo odstranění imunitních buněk, které reagují s vlastními strukturami a vyvolaly by tak vznik autoimunitního onemocnění. Selhání apoptózy je příčinou řady nemocí, mimo jiné i rakoviny [30]. Za normálních podmínek buňka osciluje v rovnováze mezi pro-apoptickými a antiapoptickými signály, které mohou být posunuty extracelulárními vlivy. Proteiny 14-3-3 hrají důležitou roli v několika apoptických drahách [16]. Nejvýznamnější z nich jsou spojeny s rodinou Bcl-2, kterou se budeme nadále zabývat. 3.3.1 Rodina Bcl-2 Členové této rodiny jsou významnými regulačními proteiny v oblasti apoptózy indukované mnoha rozdílnými stimuly [27]. Lze je rozdělit na: o Proteiny pro-apoptické (BAD, BID, BAX, Bak, Bcl-x s ) o Proteiny anti-apoptické (Bcl-2, Bcl-X L, Bfl-1/A1, Mcl-1) Nejrozsáhleji studovanými proteiny, u kterých se navíc jako u jediných prokázala vazba se 14-3-3, jsou BAD a BAX [16]. BAX Za normálních okolností se BAX vždy nachází v cytoplazmě v neaktivním stavu. Po poškození DNA, pokud v buňce z nějakého důvodu chybí 14-3-3σ, se BAX přemístí do mitochondrie a do oblasti centrosomů a nutí buňku k rychlé apoptóze. Pokud je však 14-3-3σ přítomen, situace vypadá naprosto jinak. Interaguje s BAX a zadrží jej v cytoplazmě [11]. To buňce umožní neuposlechnout apoptické signály a existuje dále i s poškozenou DNA. 21

BAD BAD, stejně jako ostatní homology Bcl-2, je schopný dimerizovat s některými členy své vlastní proteinové rodiny. Má nespornou důležitost jako mediátor apoptózy hned ze dvou důvodů, kterými je vysoké rozšíření v lidských tkáních a koncentrace dynamicky regulovaná apoptickými stimuly [3]. BAD zapříčiňuje buněčnou smrt tím, že svou vazbou inaktivuje anti-apoptické proteiny Bcl-2 nebo Bcl-x. To se může změnit díky fosforylačně-dependentní vazbě 14-3-3. Ta způsobí konformační změny BAD, které vyústí v jeho oddělení od Bcl-2 a Bcl-x. Vliv BAD, jenž by vedl k apoptóze, je tím potlačen. Na jednu stranu to buňce poskytuje více času na opravy DNA, na druhou stranu se může začít nekontrolovatelně dělit a v případě nerozeznání imunitním systémem se změnit v nádor [11]. Lze si tedy povšimnout skutečně dvojí tváře proteinů 14-3-3: na jednu stranu figurují jako ochránci v kontrolních uzlech buněčného cyklu, kdy svými regulačními mechanismy nepustí do další fáze buňku s poškozenou DNA. Navíc působí synergisticky s proteinem p53 [4]. Na druhou stranu umožňují svým anti-apoptickým působením buňce nepodlehnout signálu, který ji nutí spáchat sebevraždu. To jim propůjčuje masku potenciálních onkogenů. Protože však nejde o jediný případ takovéhoto jejich chování, bude čtvrtá část shrnutí vlastností proteinů 14-3-3 věnována právě případům, kdy svým regulačním působením podporují tumorigenezi. 22

3.4 POTENCIÁLNÍ ONKOGENY Jak jsme si ukázali v kapitole 3.1.4, proteiny 14-3-3 mají schopnost vázat a regulovat veliké množství klientních proteinů. Mezi nimi také produkty onkogenů stejně jako produkty genů potlačujících vnik a rozvoj nádorů. Oprávněně proto zaznívají úvahy, že 14-3-3 se podílejí na karcinogenezi [2]. Na druhou stranu je nutno podotknout, že se zatím nezískaly žádné důkazy o přímé roli 14-3-3 ve vzniku rakoviny [11]. Výjimku tvoří pouze 14-3-3σ, který bude rozvinut v příští kapitole. 3.4.1 Ras-Raf-MAPK Raf-1 je kináza regulována extracelulárními signály. Lze se s ní rovněž setkat pod názvem MAP (mitogen-activated protein). MAPK signální kaskáda kontroluje buněčný růst, dělení a přežití. Je rozdělena do mnoha kroků o ještě větším množství substrátů [11]. 14-3-3 mohou regulovat Raf dvojím způsobem: V G 0 buňkách, které nedostávají žádný singál zvenčí, udržují Raf kinázu v neaktivním stavu tím, že stabilizují její konformaci (děje se tak vazbou přes konkrétní serinový zbytek). Pokud je však přijat vnější signál, podporují aktivaci Raf a stabilizují její aktivní konformaci (opět díky vazbě na serinový zbytek). Aktivovaná Raf se naváže na Ras a aktivuje MAPK signální dráhu [2, 3]. Na Raf lze dobře vysledovat protichůdné působení 14-3-3. Mohou totiž buněčný růst jak potlačit inhibicí Raf, tak i navodit tím, že umožní její aktivaci. Ačkoli mutace Raf nejsou přímo spojené s výskytem rakoviny, je funkce této kinázy potřebná pro růst rakovinných buněk indukovaný změnami v hladinách růstových faktorů a nebo mutacemi v genu Ras [2]. A protože se 14-3-3 na její aktivaci přímo podílí, mají zde funkci potenciálních onkogenů. 3.4.2 Bcr-Abl Jde o protein vytvořený z produktu genu BCR a Abl tyrosin kinázy. Přestože se jedná o jeden z prvních objevených klientních proteinů 14-3-3, přesný způsob regulace zůstává 23