MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2012 ŽANETA MARTINCOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Enterokoky a jejich význam Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Žaneta Martincová
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Enterokoky a jejich význam vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis
PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych upřímně poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Ing. Liborovi Kalhotkovi, Ph.D., za cenné rady, připomínky, ochotu a čas, který mi věnoval při samotném vzniku této práce.
ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá významem a výskytem bakterií rodu Enterococcus. V této práci jsem shrnula dosavadní poznatky o bakteriích toho rodu. Zrekapitulovala jsem všechny doposud popsané enterokoky a více jsem se zaměřila na jejich popis, význam a výskyt. Větší pozornost jsem věnovala druhům E. faecalis a E. faecium, kteří byli v roce 1984 popsáni a přeřazeni mikrobiology Schleiferem a Kilpper-Bälzem ze svého původního rodu Streptococcus. Oba dva tyto druhy byly izolovány z feces (výkalů) člověka a teplokrevných živočichů. Zjistila jsem, že tyto druhy jsou velmi častou příčinou fekálního znečištění vody, anebo nozokominálních infekcí u lidí, kde způsobují různé druhy infekcí a onemocnění jako např. enteritidy, infekce močových cest, destrukce chlopně aj. Obecně se enterokoky vyskytují téměř všude, ať už je to v potravinách, na rostlinách či v půdě. Klíčová slova: bakterie, Enterococcus, význam, výskyt ABSTRACT This bachelor thesis deals with significance and occurrence of Enterococcus bacteria. In this thesis I have summed up existing knowledge of this genusofbacteria. I have recapitulated all described Enterococci up to date and I have concentrated especially on their description, significance and occurrence. More attention was given to the E. Faecalis and E. faeciumgenuses, which were described and reclassified by microbiologists SchleiferandKilpper-Bälz from their original genus Streptococcus. Both these genuses were isolated from feces (excrements) of a human or endothermic animal. I have found out that these genuses are quite often the cause of the faecal contamination of water or nosocomial infections on human beings, where they cause many kinds of infections and deseases such as enteritis, urinary tract infection, valve destruction, etc. In general Enterococcus bacteria can be find anywhere in food, on plants or in soil. Key words: bacteria, Enterococcus, meaning, occurrence
Obsah 1 Úvod... 9 2 Cíl práce... 10 3 Taxonomie rodu Enterococcus... 11 3.1 Historie taxonomie... 11 3.2 Současná taxonomie... 11 3.3 Skupiny enterokoků dle taxonomického rozdělení... 13 4 Obecná charakteristika rodu Enterococcus... 14 4.1 Bakteriologické znaky... 15 4.2 Fyziologické vlastnosti... 16 4.3 Metabolismus... 17 4.4 Buněčná stěna... 18 4.5 Pohybové ústrojí... 18 4.6 Antigenní vlastnosti... 19 4.7 Chromozomy... 19 4.8 Plasmidy... 19 4.9 Transpozony... 20 4.10 Tvorba biofirmu... 20 5 Fylogenetické členění rodu Enterococcus... 20 6 Charakteristika jednotlivých druhů rodu Enterococcus... 21 6.1 Enterococcus aquimarinus... 21 6.2 Enterococcus asini... 21 6.3 Enterococcus avium... 21 6.4 Enterococcus caccae... 22 6.5 Enterococcus camelliae... 22 6.6 Enterococcus canintestini... 22
6.7 Enterococcus canis... 23 6.8 Enterococcus casseliflavus... 23 6.9 Enterococcus cecorum... 23 6.10 Enterococcus columbae... 24 6.11 Enterococcus devriesei... 24 6.12 Enterococcus dispar... 24 6.13 Enterococcus durans... 25 6.14 Enterococcus faecalis... 25 6.15 Enterococcus faecium... 26 6.16 Enterococcus gallinarum... 27 6.17 Enterococcus gilvus... 28 6.18 Enterococcus haemoperoxidus... 28 6.19 Enterococcus hermanniensis... 28 6.20 Enterococcus hirae... 29 6.21 Enterococcus italicus... 29 6.22 Enterococcus malodoratus... 29 6.23 Enterococcus moraviensis... 30 6.24 Enterococcus mundtii... 30 6.25 Enterococcus pallens... 30 6.26 Enterococcus phoeniculicola... 30 6.27 Enterococcus pseudoavium... 31 6.28 Enterococcus raffinosus... 31 6.29 Enterococcus ratti... 31 6.30 Enterococcus saccharolyticus... 31 6.31 Enterococcus silesiacus... 32 6.32 Enterococcus sulfureus... 32 6.33 Enterococcus termitis... 32
6.34 Enterococcus villorum... 32 7 Výskyt rodu Enterococcus... 33 7.1 Výskyt enterokoků v rostlinách... 33 7.2 Výskyt enterokoků v živočiších... 34 7.3 Výskyt enterokoků ve vodě... 34 7.4 Výskyt enterokoků v půdě... 35 7.5 Výskyt enterokoků v potravinách... 35 7.5.1 Výskyt enterokoků v mléce a mlékárenských výrobcích... 36 7.5.2 Výskyt enterokoků v mase... 37 7.5.3 Výskyt enterokoků u vodních živočichů... 37 7.5.4 Výskyt enterokoků v pivu... 37 7.5.5 Výskyt enterokoků v obilninách... 37 8 Význam rodu Enterococcus... 38 8.1 Význam enterokoků v potravinářském průmyslu... 38 8.1.1 Význam enterokoků v mléčných výrobcích... 38 8.1.2 Význam enterokoků v masných výrobcích... 39 8.2 Význam enterokoků v pitné vodě... 40 8.3 Význam enterokoků pro organismus lidí a živočichů... 40 8.4 Indikátorový význam termorezistentních bakterií... 42 9 Stanovení bakterií rodu Enterococcus... 42 9.1 Stanovení enterokoků plotnovou metodou... 43 9.2 Biochemické stanovení... 43 10 Rezistence bakterií rodu Enterococcus... 44 11 Charakterizace opatření v boji proti nežádoucím enterokokům... 45 12 Závěr... 47 Přehled použité literatury:... 49
1 ÚVOD Bakterie rodu Enterococcus jsou zástupci velké domény Bacteria, kmen Firmicutes. Tento rod vznikl přesunem druhů Streptococcus faecalis a Streptococcus faecium v roce 1968. Enterokoky jsou ubikvitárně rozšířené, což znamená, že je můžeme najít téměř všude. Vyskytují se v půdě, ve vodě, v potravinách, na povrchu rostlin či živočichů. Neměl by být opomíjen ani jejich přirozený výskyt a to v intestinálním traktu člověka, nebo živočichů. Díky tomu jsou často používány jako indikátory fekálního znečištění. Dále jsou enterokoky rozšířeny ve fekálně kontaminovaném prostředí např. ve stájích, v půdě, nebo v povrchových vodách. Toto jsou také místa, odkud bývají enterokoky nejčastěji izolovány. Jejich využití a význam je taktéž široký. Můžeme je využívat jako startovací kultury v masném či mléčném průmyslu, nebo jako probiotika. U některých mléčných a masných výrobku se podílejí na jejich aroma a chuti, naopak u některých potravin mohou způsobit i jejich zkázu. Enterokoky jsou odolné k desinfekčním prostředkům (např. k chlóru), díky tomu se mohou používat k indikaci nedostatečné dávky desinfekčního prostředku. Dále jsou zástupci rodu Enterococcus významným humánním infekčním činitelem. Pro člověka jsou nebezpečné hlavně vysoce rezistentní druhy, tzv. fekální enterokoky. Mezi tyto druhy patří hlavně Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium. Druhy E. faecium a E. faecalis patří mezi nejčastější a nejvíce popsané druhy enterokoků. V těle člověka a hlavně u jedinců s oslabenou imunitou způsobují endogenní, exogenní a často nozokominální infekce. 9
2 CÍL PRÁCE Cílem této práce, bylo shrnout obecné informace o bakteriích rodu Enterococcus. Podrobněji se zaměřit na druhy významné v potravinářském průmyslu a obecně popsat jejich výskyt a význam a to nejen v potravinářském průmyslu. Dále pak se zaměřit na jejich význam pro lidský organismus a charakterizovat opatření v boji proti těmto nežádoucím bakteriím. 10
3 TAXONOMIE RODU ENTEROCOCCUS 3.1 Historie taxonomie V roce 1899 francouzský vědec Thiercelin poprvé popsal morfologické a některé biologické vlastnosti nového grampozitivního rodu. Tento rod označil jako entérocoque z důvodu jeho střevního původu. V roce 1903 Thiercelin a Jouhaud navrhl rodové jméno Enterococcus (Kalina, 1970). Název tohoto rodu je odvozen z řeckých slov enteron-střevo a coccos-kulaté jádro (Klaban, 1999). Na základě schopnosti těchto mikroorganismů tvořit krátké, nebo dlouhé řetězce je v roce 1906 Andrewes a Horder přejmenoval na Streptococcus faecalis. V pozdějších klasifikacích byly enterokoky spolu s dalšími mléčnými a ostatními streptokoky zahrnuty do rodu Streptococcus. Toto nesprávné označení se používalo až do roku 1984 (Kalina, 1970). V roce 1933 publikovala Lancefieldová sérologické rozdělení rodu Enterococcus a dle tohoto rozdělení byly enterokoky klasifikovány jako streptokoky skupiny D (Hartman a kol., 1966). Sherman poprvé v roce 1937 oddělil antigenní strukturu enterokoků od streptokoků (Kalina, 1970). Navrhl odlišení enterokoků od pravých mléčných streptokoků pomocí následujících kriterií: růst v médiu s 6,5% obsahem NaCl, což znamená, že jsou odolné i vůči nízkým hodnotám aktivity vody, rostou v médiu se 40% obsahem žluče, při ph 9,6, při 10 C i při 45 C a přežívají záhřev na teplotu 60 C po dobu 30 minut (Görner a Valík, 2004). Přesun druhů Streptococcus faecalis a Streptococcus faecium do rodu Enterococcus poprvé navrhl v roce 1968 Kalina (Kalina, 1970). Tento přesun však nebyl přijat. Díky tomu byl rod Enterococcus validně popsán až v roce 1984. V tomto roce byl rod Enterococcus uznán jako samostatný rod, protože byla uveřejněna práce Schleifera a Kilpper-Bälze. Ti navrhli přesun druhů S. faecalis a S. faecium do rodu Enterococcus na základě výsledků DNA-DNA a DNA-rRNA hybridizace (De Vos a kol., 2009). Další studie 16S rdna potvrdila nejen toto rozdělení, ale také, že enterokoky se liší od rodu Lactococcus a některých dalších grampozitivních koků (De Vos a kol., 2009). 3.2 Současná taxonomie V dnešní době je validně popsáno 34 druhů enterokoků. Jejich přehled uvádím v tabulce č. 1 (De Vos a kol., 2009). 11
Tabulka 1: Validně popsané druhy enterokoků (De Vos a kol., 2009) Druh Autoři reference Enterococcus aquimarinus Švec a kol., 2005 Enterococcus asini De Vaux a kol., 1998 Enterococcus avium Collins a kol., 1984 Enterococcus caccae Carvalho a kol., 2006 Enterococcus camelliae Sukontasing a kol., 2007 Enterococcus canintestini Naser a kol., 2005 Enterococcus canis De Graef a kol., 2003 Enterococcus casseliflavus Collins a kol., 1984 Enterococcus cecorum Williams a kol., 1989 Enterococcus columbae Devriese a kol., 1993 Enterococcus devriesei Švec a kol., 2005 Enterococcus dispar Collins a kol., 1991 Enterococcus durans Collins a kol., 1984 Enterococcus faecalis Schleifer and Kilpper-Bälz, 1984 Enterococcus faecium Schleifer and Kilpper-Bälz, 1984 Enterococcus gallinarum Collins a kol., 1984 Enterococcus gilvus Tyrrell a kol., 2002 Enterococcus haemoperoxidus Švec a kol., 2001 Enterococcus hermanniensis Koort a kol., 2004 Enterococcus hirae Farrow and Collins, 1985 Enterococcus italicus Fortina a kol., 2004 Enterococcus malodoratus Collins a kol., 1984 Enterococcus moraviensis Švec a kol., 2001 Enterococcus mundtii Collins a kol., 1986 Enterococcus pallens Tyrrell a kol., 2002 Enterococcus phoeniculicola Law-Brown and Mayers, 2003 Enterococcus pseudoavium Collins a kol., 1989 Enterococcus raffinosus Collins a kol., 1989 Enterococcus ratti Teixeira a kol., 2001 Enterococcus saccharolyticus Rodrigues and Collins, 1991 Enterococcus silesiacus Švec a kol., 2006 Enterococcus sulfureus Martinez-Murcia and Collins, 1991 Enterococcus termitis Švec a kol., 2006 Enterococcus villorum Vancanneyt a kol., 2001 12
3.3 Skupiny enterokoků dle taxonomického rozdělení Jedním z nejdůležitějších jevů je existence skupin druhů v rámci rodu Enterococcus. Bylo zjištěno, že některé druhy vytvářejí oddělené linie, ale většina může být zařazena do skupin. Členové těchto skupin mají podobné fenotypové vlastnosti a rozpoznávání jednotlivých druhů může být problematické (De Vos a kol., 2009). Podobnost genové sekvence 16S rrna mezi druhy se v některých skupinách pohybuje kolem 99,8 %. I přes tyto podobné vlastnosti se druhy dobře rozpoznávají na základě stanovení podobnosti DNA-DNA, nebo pomocí molekulárních identifikačních technik (De Vos a kol., 2009). Skupin máme celkem šest. Skupina Enterococcus faecium obsahuje druhy E. faecium, E. durans, E. canis, E. hirae, E. mundtii, E. ratti a E. villorum. Tyto druhy většinou vykazují stejné fyziologické vlastnosti a stejný růst. Rozlišení druhů v této skupině na základě biochemických testů je většinou nespolehlivé. Nejobtížnější je odlišit druhy E. durans, E. hirae a E. villorum. Jednoznačně je můžeme odlišit například pomocí profilu buněčných proteinů, nebo pomocí analýzy SDS-PAGE, tdna-pcr. (De Vos a kol, 2009). Druhou skupinou je skupina Enterococcus avium, která je tvořena E. avium, E. devriesei, E. gilvus, E. malodoratus, E. pseudoavium a E. raffinosus. Pro tyto druhy je typická tvorba malých kolonií. Rostou při teplotách v rozmezí od 10 C do 45 C, i v přítomnosti 6,5 % NaCl. Členové této skupiny jsou zpravidla adonitol a L-sorbóza pozitivní. D-antigen může být negativní (De Vos a kol., 2009). Další skupinou je Enterococcus faecalis. Do této skupiny řadíme druhy E. faecalis, E. caccae, E. haemoperoxidus, E. moraviensis, E. silesiacus a E. termitis. Tyto druhy mají různé fylogenetické vlastnosti, ale fenotypově jsou si dost podobné. Na agaru Slanetz-Bartley tvoří podobné tmavě červené kolonie s kovovým leskem. Rostou při 10 C, i v přítomnosti 6,5 % NaCl. Výroba D-antigenu je pozitivní. Tyto druhy od sebe můžeme odlišit díky některým biochemickým testům (De Vos a kol., 2009). Další skupinou, do které patří pouze dva druhy je skupina Enterococcus gallinarum. Řadíme sem E. gallinarum a E. casseliflavus. Pohyblivost a nízká vnitřní odolnost vůči vancomycinu je pro tuto skupinu charakteristická. Zřídka kdy mohou být izolovány i nepohyblivé kmeny (De Vos a kol., 2009). Do skupiny Enterococcus cecorum patří E. cecorum a E. columbae. Tyto druhy jsou si fylogeneticky vzdáleně příbuzné, ale jejich fenotypová podobnost je pozoruhodná. 13
Špatně rostou na selektivních médiích. Jejich růst je zvýšen kultivací v atmosféře, která obsahuje CO 2. Zvláštností u těchto dvou druhů je výroba alkalické fosfatázy (De Vos a kol., 2009). Skupina Enterococcus italicus zahrnuje druhy E. italicus a E. camelliae. Tyto nedávno popsané druhy mají ve srovnání s ostatními enterokoky nízkou biochemickou aktivitu. Zbytek druhů rodu Enterococcus patří do samostatné fylogenetické větve. Jsou to druhy E. aquimarinus, E. asini, E. canintestini, E. dispar, E. hermanniensis, E. pallens, E. phoeniculicola, E. saccharolyticus a E. sulfureus (De Vos a kol., 2009). 4 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA RODU ENTEROCOCCUS Rod Enterococcus nebyl do 70. let 20. století považován za škodlivý. Ale v pozdějších letech byly bakterie tohoto rodu stále častěji prokazovány za původce nebezpečných onemocnění a to jak lidí, tak zvířat. Mezi tato onemocnění patří zejména enteritidy, infekce močových cest, meningitidy, sepse a choroby žlučníku (Hampl, 1968). Nejčastěji bývají izolovány z močových cest, ranných infekcí, endokarditid a bacteremií. V dnešní době se enterokoky staly velmi významnými původci nozokominálních a jiných infekcí (De Vos a kol., 2009). Občas způsobují hnisavé infekce (Sedláček, 2006). Jsou nebezpečné hlavně kvůli jejich stále rostoucí rezistenci vůči antibiotikům. E. faecium a E. faecalis byly navrženy jako indikátory fekálního znečištění, ale vyskytují se i na rostlinách, které nepřišli do styku s fekáliemi, proto jsou méně specifické než Escherichia coli (Šilhánková, 2002). Enterokoky jsou používány jako indikátory bezpečnosti potravin (Marth, Steele, 2001). Mohou také způsobit i zkázu potravin (Hampl, 1968). Často se bakterie rodu Enterococcus v laboratorní řeči souhrnně nazývají enterokoky, streptokoky sérologické skupiny D anebo fekální streptokoky (Görner a Valík, 2004). 14
4.1 Bakteriologické znaky Enterokoky patří do skupiny grampozitivních bakterií, které jsou běžně izolovány z lidských klinických vzorků, některých druhů potravin a z životního prostředí (Švec a kol., 2001). Tvoří koky i krátké tyčinky sférického, nebo ovoidního tvaru (Sedláček, 2006). Vyskytují se v různých seskupeních, buď ve dvojicích, ve shlucích, nebo v krátkých řetízcích a jsou často prodloužené ve směru řetízku (De Vos a kol., 2009). Z morfologické stránky připomínají pneumokoky (Klaban, 1999). Zástupci bakteriálního rodu Enterococcus se vyskytují jako saprofyté a komenzálové trávicího ústrojí člověka a zvířat. Saprofyté jsou organismy využívající ke svému životu rozkládající se části jiného organismu, nebo jeho výměšků aniž by mu tím způsobil poškození. Komenzálové jsou organismy žijící v blízkém vztahu k jinému organismu, aniž by mu působily škodu (Komprda, 2003). Jsou odolnější k nepříznivým podmínkám (např. k uzení) než střevní tyčinky (Šilhánková, 2002). Optimální teplota růstu se pohybuje v rozmezí od 35 C do 37 C. Hodně druhů, ale ne všechny mohou růst při 42 C a dokonce i při 45 C. Naopak při 10 C zaznamenáváme pomalý růst. Jsou velmi odolní vůči vysychání (De Vos a kol., 2009). Jsou poměrně rezistentní, přežívají záhřev na teplotu 60 C po dobu 30 minut (Lukášová a kol., 1997). Jsou schopni růstu v 6,5 % NaCl a při ph 9,6. Díky těmto vlastnostem lze odlišit enterokoky od streptokoků (výjimky jsou Lactococcus Lactis a Lactoccus cremoris) (Schleifer, 1984). Od ostatních kataláza negativních grampozitivních koků můžeme enterokoky odlišit díky jejich schopnosti hydrolyzovat eskulin v přítomnosti 40 % žlučových solí, nebo díky jejich produkci pyrrolidonylarylamidasy (Varman, 2012). Dále jsou enterokoky odolné vůči nízké aktivitě vody (Lukášová a kol., 1997). Rostou také v přítomnosti 40% žluče (Sedláček, 2006). Netvoří endospory (Sedláček, 2006). Kmeny některých druhů se mohou pohybovat pomocí bičíků (De Vos a kol., 2009). Některé druhy tvoří žlutý pigment (De Vos a kol., 2009). Enterokoky dobře kultivujeme na umělých živných půdách (Hampl, 1968). Využívají široké rozmezí sacharidů. Hlavním produktem jejich fermentace je L (+)- kyselina mléčná. Ale plyn nevytváří. Vyjímkou jsou E. avium a E. malodoratus, kteří produkují sirovodík. Kataláza je negativní, enterokoky jsou často alfahemolitické (viridující) na krevním agaru (Sedláček, 2006). 15
Lancefieldová publikovala ve 30. letech 20. století sérologické rozdělení enterokoků. Dle tohoto zjištění patří rod Enterococcus do sérologické skupiny D (Marth, Steele, 2001). Enterokoky mají obecně složité nutriční požadavky (De Vos a kol., 2009). Zkvašují glukózu za tvorby kyseliny, nebo kyseliny a plynu (Hampl, 1968). Enterokoky fermentují sacharidy podobně jako bakterie mléčného kvašení. Konečná hodnota ph v glukózovém roztoku se pohybuje v rozmezí od 4,6 do 4,2, příležitostně mohou být tyto hodnoty i nižší. Neredukují dusičnan na dusitan, nerozkádají celulózu pektin a ani tuky. Významný rozklad vykazuje pouze druh E. faecalis, což je proteolytický druh (Görner a Valík, 2004). Hemolytická aktivita je variabilní a z velké části závisí na druhu. Obsah G + C v DNA se u enterokoků pohybuje v rozmezí od 35,1 do 44,9 mol % (De Vos a kol., 2009). Obrázek 1: Elektronová mikrofotografie ultra tenké části dělícího páru enterokoků (dostupné na: http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/structure.html) 4.2 Fyziologické vlastnosti Enterokoky řadíme podle nároků na kyslík mezi fakultativně anaerobní mikroorganismy, což znamená, že mají schopnost aerobního i anaerobního metabolismu (Sedláček, 2006). Mohou růst za přítomnosti i za nepřítomnosti kyslíku. V přítomnosti 16
kyslíku se většinou rozmnožují rychleji. Aerobní metabolismus přeměňuje rychleji substrát v energii, proto je výhodnější a poskytuje i více energie než metabolismus anaerobní. Podle zdroje energie patří mezi chemoorganotrofní mikroorganismy, což znamená, že využívají organický oxidovatelný substrát, jsou to heterotrofní mikroorganismy, u kterých jsou zdrojem uhlíku organické látky (např. organické kyseliny, lipidy, sacharidy, alkoholy) (Šimonovičová a kol., 2008). 4.3 Metabolismus Enterokoky mají fermentativní typ metabolismu (Sedláček, 2006). Jsou homofermentativní. Enterokoky jsou schopné fermentovat mnoho sacharidů jako např. N-acetylglukosamin, amygdalin, arbutin, celobiósa, D-fruktósa, galaktósa, laktósa, maltósa, D-mannosa, ribósa a další (De Vos a kol., 2009). Hlavní metabolickou dráhou při výrobě energie je Embden-Meyerhof-Parnasova dráha. Za aerobních podmínek je glukóza metabolizována na kyselinu octovou, acetoin a CO 2. Pyruvát se stechiometricky přeměňuje na laktát, pomocí E. faecalis při ph v rozmezí od 5,0 do 6,0. V neutrálním, nebo v zásaditém ph je pyruvát převeden na kyselinu mravenčí, etanol a acetát v poměru 2:1:1. Při nedostatku živin, je pyruvát přeměněn na etanol a octan. Hippurát je hydrolyzován na glycin a kyselinu benzoovou (De Vos a kol., 2009). Enterokoky mohou získat energii degradací některých aminokyselin, jako jsou arginin, tyrosin, serin, fenylalanin aj (De Vos a kol., 2009). E. faecalis metabolizuje malát prostřednictvím specifického enzymu NAD. U E. faecalis je glukonát fosforylován na 6-phosphoglukonát, poté následuje jeho disimilace na laktát a CO 2. V prostředí, které je dosyceno oxidem glycerolu, produkuje E. faecalis zejména kyselinu octovou a CO 2 se stopovým množstvím acetylmethylcarbinolu. E. faecium může oxidovat glycerol na kyselinu octovou, CO 2 a malé množství peroxidu vodíku (De Vos a kol., 2009). 17
4.4 Buněčná stěna Buněčná stěna enterokoků se barví grampozitivně. Jako grampozitivní bakterie označujeme ty bakterie, jejichž mrtvé buňky po obarvení Gramovým barvícím roztokem a moření jodovým roztokem toto barvivo neztrácejí, takže zůstanou zabarvené krystalovou violetí (Sedláček, 2006). To, že neztrácejí toto barvivo, je způsobeno působením rozpouštědel a to hlavně acetonu, nebo ethanolu (Šilhánková, 2002). Gramovo barvení se používá při určování rodu bakterií, nebo při diagnostice bakterií. Grampozitivní bakterie mají mnoho společných fyziologických vlastností. Mezi tyto vlastnosti patří např. citlivost k některým antibiotikům, jedovatým barvivům, nebo aniontovým povrchově aktivním látkám. Všechny tyto vlastnosti jsou dány rozdíly složení buněčných stěn grampozitivních a gramnegativních bakterií. (Šilhánková, 2002). Hlavní složkou buněčné stěny enterokoků je silná vrstva peptidogklykanu, která přiléhá na cytoplasmatickou membránu. Přes tuto vrstvu pronikají na povrch lineární řetězce teichoových kyselin (Hudecová, Majtán, 2002). Mezi hlavní složky jejich buněčné stěny kromě teichoové kyseliny dále patří: peptidoglykan a polysacharidy. Kromě těchto složek obsahují také povrchové a zanořené proteiny. Teichoová kyselina je vázána kovalentní vazbou a představuje až 50 % sušiny buněčné stěny. Polysacharidy buněčné stěny grampozitivních bakterií jsou složeny z glukósy, mannósy, galaktósy a některých dalších monosacharidů (Šilhánková, 2002). Buněčná stěna je tvořená z peptidoglykanů. Typ lysin D-asparagin je popsán u rodu E. avium, E. casseliflavus, E. dispar, E. durans, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium a E. raffiosus kromě E. faecalis který má buněčnou stěnu tvořenou typem lysin-alanin (De Vos a kol., 2009). 4.5 Pohybové ústrojí Některé druhy rodu Enterococcus mohou být pohyblivé (De Vos a kol., 2009). Pohybují se za pomoci malých nevýrazných bičíků (Sedláček, 2006). Mezi tyto druhy patří např. E. casseliflavus a E. gallinarum (Schleifer, 1984). 18
4.6 Antigenní vlastnosti Enterokoky jsou dle Lancefieldové řazeny do sérologické skupiny D. Tento antigen je považován za typický znak rodu Enterococcus, ale ne všechny druhy ho mají. Jeho výskyt nebyl popsán u několika nových druhů (De Vos a kol., 2009). Na druhou stranu se může antigen D vyskytovat u několika druhů streptokoků, např. u Streptococcus bovis, Streptococcus suis, Streptococcus alactolyticus a u některých leukonostoků a pediokoků. Antigen D se u enterokoků nachází mezi buněčnou stěnou a buněčnou membránou. Tento antigen je tvořen polymerem kyseliny teichoové, která je na glycerol-fosfátovou kostru polymeru navázaná esterovou vazbou. Lipidová složka je tvořena l-kojibiosyl diglyceridem (De Vos a kol., 2009). 4.7 Chromozomy Chromozomy enterokoků představují jednu kruhovou DNA o různé velikosti. Pro E. faecalis se pohybuje v rozmezí od 3000 do 3250 kb, pro E. faecium 2550-2995 kb, pro E. avium 3445 kb a pro E. durans 3070 kb. Úplná sekvence genomu je k dispozici u kmene E. faecalis V583 a u kmene E. faecium. Genom E. faecalis se skládá z jednoho chromozomu a ze třech plastidů. Velikost chromozomu je 3 218 013 bp. Bylo detekováno celkem 3 182 genů kódujících proteiny o střední velikosti 889 bp. Mezi nimi bylo 1760 genů známých jako proteinové geny. Celkem bylo nalezeno 519 bílkovin, které jsou zachovány v malém množství u G + C grampozitivních bakterií. Jsou zde, aby se zapojily do transkripčního překladu a syntézy bílkovin (De Vos a kol., 2009). 4.8 Plasmidy Plasmidy jsou mobilní elementy odpovědné za vysokou rychlost, se kterou enterokoky získávají a dále distribuují geny. Dále zajišťují jejich antibiotickou nebo UV rezistenci. Byly popsány 3 druhy plasmidů: RCR (rolling circle replicating) plasmidy, Inc18 plasmidy a feromonové plasmidy (pheromone-responding). Inc18 plasmidy mohou být replikovány u mnoha jiných grampozitivních bakterií, jejich velikost se pohybuje v rozmezí od 25 kb do 30 kb. Feromonové plasmidy jsou typické pro E. faecalis (De Vos a kol., 2009). 19
4.9 Transpozony Kromě plasmidů, bylo u enterokoků izolováno široké rozmezí transpozonů.. Existuje několik druhů transpozonů. Obecně jsou uznávány transpozony typu Tn3, kompozitní transpozony, složené a konjugativní transpozony. Mezi typické členy Tn3 skupiny patří Tn917 a Tn1546. Tn917 nese geny pro rezistenci vůči makrolidům, linkosamidům a streptograminu. Tn1546 nese geny pro rezistenci k vancomycinu. Konjugativní transpozony nesou rezistenci proti nejméně jednomu antibiotiku a odhalují široký rozsah hostitelů. Tyto transpozony se začlení do DNA hostitelské buňky pomocí konjugace (De Vos a kol., 2009). 4.10 Tvorba biofirmu Klinické izoláty některých enterokoků mají schopnost vytvářet biofilm na inertním povrchu, za současné produkce slizu. Tato vlastnost se běžně vyskytuje u E. faecalis. Také izoláty E. faecium byly schopné vytvořit biofilm, ale v menší míře. Tvorba biofirmu je stále častěji spojována z infekcí v organismu, protože se častěji vyskytuje u kmenů izolovaných z infekcí, než u izolátů od zdravých jedinců. Tvorba biofilmu je výrazně ovlivněna přítomností dalšího zdroje sacharidů v médiu, nebo deprivací železa, což ukazuje na úlohu slizu pro přežití v náročných podmínkách (Baldassarri a kol., 2001). 5 FYLOGENETICKÉ ČLENĚNÍ RODU ENTEROCOCCUS Podle fylogenetické analýzy 16S rrna v souladu s upraveným plánem jsou rody Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus a Vagococcus zařazeni do nové čeledi Enterococcaceae, na základě velké podobnosti tohoto genu, v rámci řádu Lactobacillales (De Vos a kol., 2009). Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Enterococcaceae 20
6 CHARAKTERISTIKA JEDNOTLIVÝCH DRUHŮ RODU ENTEROCOCCUS 6.1 Enterococcus aquimarinus Enterococcus aquimarinus byl izolován z mořské vody. Díky tomu získal také svůj název aqua voda, marinus z moře (De Vos a kol., 2009). Jeho buňky jsou protáhlé, často kopinaté. Vyskytují se jednotlivě, nebo v malých skupinkách, převážně ale v párech (Švec a kol., 2005). Tento kmen má široké rozmezí teplot, při kterých roste. Roste při 25 C 42 C. Roste v přítomnosti 6,5 % NaCl. Přidávání 5 % CO 2 nezpůsobuje posílení růstu. Buňky jsou nepohyblivé. Dávají pozitivní výsledky u testů na pyrrolidonyl arylamydázu a alfaa beta- galaktosidázu (Švec a kol., 2005). Na agaru Slanetz-Bartley vykazuje slabý růst. Obsah G + C v DNA je 38,7 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.2 Enterococcus asini Tyto koky byly izolovány během vyšetřování bakteriální flóry slepého střeva u oslů. Druh Enterococcus asini je grampozitivní. Buňky mají oválný tvar, tvoří páry, nebo krátké řetězce. Nevytváří spory a nejsou pohyblivé. Optimální růst je při teplotě 38 C až 40 C. V roztoku 6,5 % NaCl se nevytváří. Slabý růst byl zaznamenán při teplotách 10 C a 45 C (De Vaux a kol., 1998). Jeho nejbližší příbuzný je Enterococcus avium a Enterococcus faecium. Sekvenční podobnost s těmito druhy je 97,4 %. Tyto druhy lze od sebe odlišit na základě fenotypových vlastností (De Vaux a kol., 1998). Obsah G + C v DNA je 39,4 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.3 Enterococcus avium Enterococcus avium byl izolován od ptáků, od lidí, nebo z potravy (De Vos a kol., 2009). Může být izolován i z kuřecích výkalů (Collins a kol., 1984). Tento druh se liší od E. faecalis a E. faecium zejména svým charakteristickým původem ze střev drůbeže a s výskytem i v lidských a zvířecích výkalech (Görner a Valík, 2004). Tvar těchto buněk je vejčitý, protáhlý, tvoří řetězce. Tento druh spolu s E. malodoratus jsou jediné známé druhy rodu Enterococcus, které produkují H 2 S. 21
E. avium dobře roste při 45 C a přežívá i záhřev na 60 C (Collins a kol., 1984). Jeho buňky jsou α-hemolytické. Obsah G + C v DNA 39,0-40,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.4 Enterococcus caccae Enterococcus caccae byl izolován z lidské stolice v USA v roce 2000. Díky tomu získal své druhové jméno, které je odvozeno od původců jeho izolace (kakke - feces). Buňky E. Caccae neobsahují pigment (Maria da Glória S. Carvalho a kol., 2006). Rostou při 45 C, i v přítomnosti 6,5 % NaCl. Při 37 C tvoří na krevním agaru s ovčí krví malé kolonie do průměru 0,5 mm (De Vos a kol., 2009). Nevytváří plyn. Jsou alfa hemolytické (Maria da Glória S. Carvalho a kol., 2006). Obsah G + C v DNA je 32,5 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.5 Enterococcus camelliae Tento druh byl izolován v Thajsku z fermentovaných čajových lístků rostliny Camellia sinensis, od toho je také odvozeno jeho druhové jméno (De Vos a kol., 2009). Buňky E. camelliae jsou pohyblivé a nevytváří spory. Mají kulovitý, nebo ováný tvar bez tvorby pigmentu. Rostou při teplotách 15 45 C a 2 6 % obsahu NaCl (Sukontasing a kol., 2007). Dále při ph v rozmezí 5-9 (De Vos a kol., 2009). Úzce souvisí s druhem Enterococcus italicus, protože mají velmi podobnou DNA (Sukontasing a kol., 2007). Obsah G + C V DNA je 37,8 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.6 Enterococcus canintestini Enterococcus canintestini byl izolován ze vzorku stolice zdravých psů (De Vos a kol., 2009). Je tvořen nepohyblivými buňkami, které jsou seskupeny převážně do malých skupin. Ne krevním agaru tvoří kruhové, hladké kolonie, které mají mléčnou barvu. Na agaru Slanetz-Bartley tvoří kolonie červené (Naser a kol., 2005). Buňky rodu E. canintestini rostou pomalu při 25 C. Lépe rostou při 30 C a jejich optimální růst je při 37 42 C. Rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl (Naser a kol., 2005). Obsah G + C je 36,0 až 37,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 22
6.7 Enterococcus canis Tento druh byl izolován z análních výtěrů psů, kteří měli chronickou otitidu. Jeho buňky jsou mírně prodloužené koky, které se vyskytují v párech, nebo v malých skupinkách (De Graef a kol., 2003). Buňky optimálně rostou při 37 C, pomaleji při 42 C a jsou schopny růstu i v 6,5 % NaCl. Nerostou při 25 C (De Graef a kol., 2003). Na agaru Slanetz-Bartley se vytvoří po 48 hodinách bez redukce tetrazolia drobné kolonie. Obsah G + C je v rozmezí 41,7-43,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.8 Enterococcus casseliflavus Tento druh byl izolován z rostlin, siláže či z půdy (Collins a kol., 1984). V roce 1993 byl popsán také jejich výskyt v povrchových vodách (Švec a kol., 2001). Buňky tohoto rodu jsou pohyblivé, obvykle se vyskytují ve dvojicích (Collins a kol., 1984). Přežívají záhřev na 60 C po dobu 30 minut (De Vos a kol., 2009). Na krevním, nebo živném agaru tento druh vytváří jasně žluté kolonie, odtud dostal také svůj název (casseliflavus žlutě zbarvený) (Collins a kol., 1984). Na druhou stranu byl hlášen i výskyt nepohyblivých a nepigmentovaných kmenů, které byly izolovány z lidského klinického materiálu. Obsah G + C v DNA je 40,5-44,9 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.9 Enterococcus cecorum Vyskytují se v párech, nebo v krátkých řetízcích, nebo v malých skupinkách. V rámci řetězců jsou buňky uspořádány v párech (Devriese a kol., 1983). Buňky E. cecorum nerostou při 10 C. Růst je pomalejší a méně častý za přístupu vzduchu. Buňky nerostou v přítomnosti 6,5 % NaCl. Dobře rostou při 45 C. Při ph 9,6 je růst pomalejší než růst při ph 7,0 (Devriese a kol., 1983). Buňky nepřežívají teplotu 60 C po dobu 30 minut (De Vos a kol., 2009). Tento druh při svém růstu preferuje zvýšený obsah CO 2 v atmosféře. Obsah G + C v DNA je 37,0-38,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 23
6.10 Enterococcus columbae Tento druh grampozitivních koků byl izolován ze střevní flóry domestikovaných holubů (Devriese a kol., 1990). Díky tomu získal také své druhové jméno columbae holubice (De Vos a kol., 2009). Tento rod je nejvíce příbuzný rodu Enteroccocus cecorum. Buňky nerostou při 10 C a v médiu s obsahem 6,5 % NaCl (De Vaux, 1998). Tento druh preferuje zvýšený obsah CO 2 ve vzduchu. Růst na médiu Slanetz-Bartley je negativní. Naopak roste na agaru žlučových eskulin s obsahem 3-10 % CO 2 ve vzduchu, ale v normální atmosféře bez CO 2 neroste. Obsah G + C v DNA je 38,2 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.11 Enterococcus devriesei Enterococcus devriesei byl pojmenován na počest významného belgického taxonoma Dr. Luc A. Devriese (De Vos a kol., 2009). E. devriesei byl izolován ze skotu, vakuově baleného dřevěného uhlí a ze vzduchu v drůbežárnách (De Vos a kol., 2009). Buňky rodu E. devriesei dobře rostou při 10 35 C. Nerostou při teplotách vyšších než 42 C, nebo při teplotách menších než 2 C. Buňky rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl. Na krevním agaru tvoří bílé až světle šedé kolonie (Švec a kol., 2005). Na krevním agaru skotu vytváří α-hemolýzu. Dále vykazuje pozitivní růst na azidu obsahující selektivní média a na agaru žlučových eskulin. Obsah G + C v DNA je 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.12 Enterococcus dispar Enterococcus dispar původně popsal Collins a kol. v roce 1991 na základě dvou izolátů (Naser a kol., 2005). Jeden byl izolován ze synoviální tekutiny člověka, takže z klinického materiálu a druhý ze stolice psa (De Vos a kol., 2009). Buňky přežívají ohřev na 60 C po dobu 30 minut. Obsah G + C v DNA je 39,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 24
6.13 Enterococcus durans Tento druh byl izolován z mléka, mléčných výrobků a ze sušeného mléka. Buňky jsou protáhlé ve směru řetězce, vyskytuje se ve dvojicích nebo v krátkých řetězcích. Nerostou při teplotách nad 50 C (Collins a kol., 1984). Facklam a Collins v roce 1989 izolovali E. durans vykazující pozitivní výsledky na melibiosu z lidského klinického materiálu. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 38,0 do 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.14 Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis byl izolován z výkalů člověka, teplokrevných a studenokrevných živočichů (Schleifer a kol., 1984). Odtud je také odvozeno jeho druhové jméno feacesvýkaly. Dále se vyskytuje v hmyzu a na rostlinách. Výskyt E. faecalis je častý i v nesterilizovaných, zejména solených potravinách bez souvislosti s jejich fekální kontaminací. Buňky tohoto rodu jsou vejcovitého tvaru prodloužené ve směru jejich dělení. Jejich průměr se pohybuje v rozmezí od 0,5 až 1,0 µm. Jsou uspořádány v páru a v krátkých řetězcích. Z pravidla jsou nepohyblivé. Dle Lancefieldové odpovídají sérologické skupině D (Görner a Valík, 2004). Na polotuhých živných půdách tvoří kruhové, hladké, smetanové až bílé povrchové kolonie. Na médiu Slanetz-Bartley vytváří kolonie, které mají průměr od 1 do 2 mm. Jsou zpravidla kruhové, hladké a lesklé, hnědočervené až růžové barvy. Půda okolí kolonií je zabarvená (Görner a Valík, 2004). Většinou jsou nehemolytické, vzácně však tvoří β hemolýzu. Rostou při 10 45 C, ale přežívají i záhřev na teplotu 60 C po dobu 30 minut (Schleifer a kol., 1984). Což je významně podmíněné hodnotou ph prostředí a věkem buněk. Optimální teplota růstu je 37 C (Görner a Valík, 2004). Buňky rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl a při ph 9,6 (Schleifer a kol., 1984). Buňky E. faecalis fermentují glukózu za tvorby zvláště kyseliny mléčné. Pokud se živné médium při fermentaci neutralizuje, vytvoří se větší množství kyseliny mravenčí, octové a etanolu (Görner a Valík, 2004). Jako zdroj energie využívá E. faecalis pyruvát, citrát, malát, nebo serin. Využití těchto tří látek je spojeno s metabolismem. Dále mohou jako zdroj energie využívat také arginin (Schleifer a kol., 1984). 25
E. faecalis rychle redukuje 2,3,5-trifenyl-terazolium-chlorid na hnědočervený bifenyl formazan. Lakmusové mléko redukuje dříve, než vznikne sraženina. Dále pak peptonizuje kasein a želatinu a aminokyselinu tyrosin dekarboxyluje na biogenní amin tyramin. Přenosné plazmidy regulují odolnost E. faecalis vůči antibiotikům (Görner a Valík, 2004). Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 37 do 40 mol % (De Vos a kol., 2009). Obrázek 2: Enterococcus faecalis (dostupné na: http://www.symbinatur.com/mikrobiologicka-terapie-lecebna-cast-enterococcusfaecalis-lekar-online-72_51.html) 6.15 Enterococcus faecium Enterococcus faecium byl obdobně jako E. faecalis izolován z výkalů člověka, nebo z výkalů teplokrevných živočichů (Schleifer a kol., 1984). Jako první izolát se udává sušené mléko, nachází se i v mléku a v mléčných produktech. I vlastnosti E. faecalis a E. faecium jsou většinou podobné (Görner a Valík, 2004). Glukózové živné médium okyseluje na hodnotu ph od 4,4 do 4,0. Lakmusové mléko redukuje před jeho sražením, sraženinu vytváří za 5 až 7 dní, 2,3,5-trifenylterazolium-chlorid redukuje ne světle růžovou, nebo ji neredukuje. Na médiu Slanetz- Bartley tvoří světle růžové až bílé kolonie. Želatinu a kasein nepeptonizuje (Görner a Valík, 2004). 26
Některé kmeny tohoto rodu mohou na krevním agaru vytvářet α hemolýzu. Buňky jsou vejcovitého tvaru a vyskytují se hlavně ve dvojicích, nebo v krátkých řetězcích. Některé kmeny jsou pohyblivé (Schleifer a kol., 1984). Původně byl tento druh popsán jako rafinosa a sorbitol acidifikace negativní, ale kmeny které byly izolovány ze psů, nebo od lidí jsou sorbitol pozitivní (De Vos a kol., 2009). Rozmezí teplot, při kterých rostou kmeny E. faecium je 10 50 C. Přežívají ale i záhřev na 60 C po dobu 30 minut, rostou i v 6,5 % roztoku NaCl, nebo při ph 9,6 (Schleifer a kol., 1984). Obsah G + C se pohybuje v rozmezí od 37,0 do 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009). Obrázek 3: Enterococcus faecium (dostupné na: http://www.ciriscience.org/ph_119- Enterococcus_faecium_Copyright_Dennis_Kunkel_Microscopy). 6.16 Enterococcus gallinarum Druh Enterococcus gallinarum byl izolován ze střev domácích slepic a jiné domestikované drůbeže (Collins a kol., 1984). Díky tomu získal tento druh také svůj název. Gallinarum znamená z latinského překladu kuřata. Buňky E. gallinarum se většinou vyskytují v párech, nebo v krátkých řetízcích a jsou pohyblivé (Bridge a kol., 1982). Kolonie na krevním agaru jsou kruhové a hladké. Na médiu, které obsahuje koňskou krev, vykazuje tento druh β hemolýzu (Collins a kol., 1984). E. gallinarum tvoří nejspíše kyselinu ze škrobu (Görner a Valík, 2004). 27
Většina kmenů nepřežívá teplotu 60 C po dobu 30 minut, ale přežívá záhřev na teplotu 60 C po dobu 15 minut. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 39,0 do 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.17 Enterococcus gilvus Tento druh byl izolován z lidských klinických vzorků, přesněji ze žluče pacienta, který trpěl cholecystitidou (zánětem žlučníku) (Tyrrell a kol., 2002). Buňky E. gilvus tvoří světle žlutý pigment. Obsah G + C u tohoto druhu není dosud stanovena (De Vos a kol., 2009). 6.18 Enterococcus haemoperoxidus Enterococcus haemoperoxidus byl izolován z povrchové vody. Název je spojen ze tří slov, haema jako krev, per jako intenzivní a oxys jako kyselý. Je odvozený od schopnosti tohoto druhu při kultivaci na krevním agaru rozkládat peroxid vodíku na kyslík a vodu (De Vos a kol., 2009). To se projevuje jako pozitivní výsledek katalázového testu. Buňky pěstované na médiu bez krve mají katalázu negativní (Švec a kol., 2001). Buňky jsou oválného tvaru, vyskytují se v párech, krátkých řetězcích, nebo v malých skupinách. Nejsou pohyblivé. Na krevním agaru produkují buňky slabě nažloutlý pigment (Švec a kol., 2001). Růst silně inhibují teploty nad 42 C. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,3 do 35,5 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.19 Enterococcus hermanniensis Tento druh byl izolován ze vzorků psích mandlí. Dále byl izolován z marinovaného masa brojlerů, kteří byli baleni v ochranné atmosféře (Koort a kol., 2004). Název tohoto rodu je odvozen od lokality Hermanni, kterou najdeme v Helsinkách ve Finsku (De Vos a kol., 2009). Buňky tohoto rodu jsou kulovité koky rostoucí v páru. Rostou na médiu, které obsahuje hovězí krev, kde pak vytváří α hemolýzu. Optimální teplota pro růst buněk E. hermanniensis je 10 37 C. Buňky nerostou při teplotě 45 C. Všechny kmeny dobře rostou v přítomnosti 2 % nebo 4 % NaCl. Některé kmeny rostou i v přítomnosti 6,5 % 28
NaCl, ale žádný kmen neroste při 10 % koncentraci NaCl (Koort a kol., 2004). Obsah G + C v DNA je 36,6-37,1 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.20 Enterococcus hirae Enterococcus hirae byl izolován ze střev prasat a kuřat. Buňky jsou vejčité a vyskytují se většinou v párech, nebo v krátkých řetězcích. Buňky rostou při teplotě od 10 do 45 C. Rostou i v přítomnosti 6,5 % NaCl a při ph 9,6 (Farrow a kol., 1985). Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 37,0-38,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.21 Enterococcus italicus Druh Enterococcus italicus byl izolován ze syrového kravského mléka požívaného při výrobě Italských sýrů (Naser a kol., 2006). Poprvé byl v mléčných výrobcích izolován v Piemontu v Itálii. Díky tomu také získal své druhové jméno italicus (Fortina a kol., 2004). Růst buněk je optimální při teplotě 37 C. Naopak při 10 C téměř nerostou. Schopnost růstu buněk E. italicus při 45 C je u jednotlivých kmenů různá. Závisí na obsahu 5 % CO 2 v atmosféře (Fortina a kol., 2004). Obsah 5 % CO 2 totiž podporuje růst buněk. Kmeny rostou i při ph 9,6 a přítomnosti 5 % NaCl. Některé kmeny rostou i při koncentraci 6 % NaCl, ale nerostou při 6,5 % obsahu NaCl (De Vos a kol., 2009). Na krevním agaru tvoří α hemolýzu. Kmeny jsou schopny růstu v sušeném odstředěném mléku, kde způsobují srážení do 48 hodin. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 39,9 do 41,1 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.22 Enterococcus malodoratus Tento druh byl izolován ze sýru Gouda. Spolu s Enterococcus avium jsou dva jediné druhy rodu Enterococcus, které produkují H 2 S. Svůj druhový název získal podle zápachu, který buňky vytvářejí, z anglického malodorous - zapáchající. Buňky se vyskytují většinou v párech či v krátkých řetězcích. Některé kmeny mohou vytvářet slizy (Collins a kol., 1984). 29
Buňky tohoto rodu nerostou při 45 C a nepřežívají teplotu 60 C po dobu 30 minut. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 40,0 do 41,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.23 Enterococcus moraviensis Enterococcus moraviensis byl izolován z povrchových vod během rutinní analýzy kvality vody. Všechny kmeny byly izolovány z různých míst v regionu severní Moravy. Odtud vznikl druhový název E. moraviensis (Švec a kol., 2001). Růst je silně inhibován při 42 C. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,6 do 36,3 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.24 Enterococcus mundtii Enterococcus mundtii byl izolován od krav, z rukou dojnic, z rostlin i z půdy. Tento druh je pojmenován po americkém mikrobiologovi J. O. Mundtovi, který ho studoval (Collins a kol., 1986). Buňky jsou vejčitého tvaru. Vyskytují se většinou v párech, nebo v krátkých řetězcích a produkují žlutý pigment. Rostou při 10 45 C (Collins a kol., 1986). Rostou i v přítomnosti 6,5 % NaCl a při ph 9,6. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 38,0 do 39,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.25 Enterococcus pallens Enterococcus pallens byl izolován z klinických lidských vzorků. Přesněji byl izolován ze žluče pacienta, který trpěl peritonitidou (Tyrrell a kol., 2002). Tyto grampozitivní, nesporotvorné bakterie vytvářejí světle žlutý pigment. Obsah G + C dosud nebyl stanoven (De Vos a kol., 2009). 6.26 Enterococcus phoeniculicola Tento druh byl izolován z uropygiální žlázy dudkovce stromového (Phoeniculus purpureus). Od toho je také odvozeno jeho druhové jméno (De Vos a kol., 2009). 30
Studie prokázaly, že přítomnost bakterií Enterococcus phoeniculicola v sekretu této žlázy ovlivňuje jeho barvu i zápach (Law-Brown a kol., 2003). Buňky tohoto rodu nejsou schopny růstu v přítomnosti 6 % NaCl. Nerostou ani v přítomnosti 40 % žluči. Optimální teplota růstu je 30 37 C a ph 8. Na živném agaru buňky vytvářejí kruhové, šedavé, nebo nazelenalé kolonie. Obsah G + C nebyl dosud stanoven (De Vos a kol., 2009). 6.27 Enterococcus pseudoavium Enterococcus pseudoavium byl izolován ze vzorku od mastitidních krav (Collins a kol., 1989). Obsah G + C v DNA je 40,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.28 Enterococcus raffinosus Enterococcus raffinosus byl izolován ze vzorků klinického původu (Collins a kol., 1989). Jen vzácně je tento druh izolován z živočišných zdrojů. Buňky dokážou utilizovat rafinosu, díky tomu získal i své druhové jméno. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 39 do 40 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.29 Enterococcus ratti Enterococcus ratti byl izolován ze střev a z výkalů potkanů, kteří trpěli průjmem. Buňky rostou v rozmezí teplot 10 45 C. Rostou také v přítomnosti 6,5 % NaCl (Teixeira a kol., 2001). Nejsou pohyblivé a na agaru s beraní krví mohou být jak α hemolytické tak i nehemolytické (De Vos a kol., 2009). 6.30 Enterococcus saccharolyticus Tento druh byl izolován ze slaměné podestýlky a od krav. Tento druh je schopen utilizovat sacharózu (Rodrigues a kol., 1990). Buňky nepřežívají záhřev na teplotu 60 C po dobu 30 minut. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 37,6 do 38,3 mol % (De Vos a kol., 2009). 31
6.31 Enterococcus silesiacus Enterococcus silesiacus byl izolován z povrchových vod. Všechny kmeny byly izolovány z různých míst v regionu Slezska. Odtud vznikl jeho druhový název E. silesiacus (De Vos a kol., 2009). Tyto grampozitivní koky se vyskytují ve dvojicích, krátkých řetězcích či v malých skupinách. Na agaru s obsahem ovčí krve tvoří lesklé, kulaté a hladké kolonie. Jsou nepohyblivé (Švec a kol., 2006). Na agaru Slanetz-Bartley vykazuje slabý růst a vytváří malé tmavě červené kolonie (De Vos a kol., 2009). Optimální teplota růstu je 10 C, naopak neroste při 45 C. Růst je slabý i v přítomnosti 6,5 % NaCl a při ph 9,6. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,6 do 36,7 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.32 Enterococcus sulfureus Tento druh byl izolován z rostlin, pomocí reverzní transkriptázy. Buňky tohoto rodu tvoří žlutý pigment. Díky tomu získal také své druhové jméno (sulphur jako žlutá síra) (Martinez-Murcia a kol., 1991). Buňky rostou při 40 C, ale při 45 C už nerostou. Obsah G + C v DNA je 38,0 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.33 Enterococcus termitis Tento druh byl izolován ze střev termitů (De Vos a kol., 2009). Díky tomu získal své druhové jméno termitis. Buňky jsou oválné koky vyskytující se ve dvojicích, krátkých řetězcích či v malých skupinách. Jsou nepohyblivé. Buňky rostou při ph 9,6 i za přítomnosti 6,5 % NaCl. E. termitis roste v rozmezí teplot 10 45 C. Na médiu s krví či bez krve je kataláza negativní (Švec a kol., 2006). Na agaru Slanetz-Bartley vykazuje pomalý růst a vytváří malé tmavě červené kolonie. Obsah G + C v DNA je 37,1 mol % (De Vos a kol., 2009). 6.34 Enterococcus villorum Enterococcus villorum byl izolován ze střev selat a prasat, která trpěla průjmovými onemocněními. Druhové jméno je odvozeno od slova villus, což je termín pro označení drsných vlasových klků, které se pro srážení struktur vytvoří v tenkém střevě (De Vos a kol., 2009). 32
Všechny kmeny jsou α-hemolytické (Vancanneyt a kol., 2001). Na agaru Slanetz- Bartley vytváří růžové kolonie. Obsah G + C v DNA se pohybuje v rozmezí od 35,1 do 35,3 mol % (De Vos a kol., 2009). 7 VÝSKYT RODU ENTEROCOCCUS Bakterie tohoto rodu jsou ubikvitárně rozšířené. Jsou obyvateli střevního systému člověka a zvířat (Klaban, 1999). Enterokoky mohou být izolovány z půdy, z rostlin, z hmyzu, z divokých zvířat anebo z vody (Švec a kol., 2001). Rod Enterococcus získal své pojmenování díky svému původnímu stanovišti: střeva lidí a zvířat. V novějším systematickém rozdělení těchto bakterií se uvádí taxony, které jsou považované za samostatné druhy a to jsou Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium. Jejich původním stanovištěm je střevo lidí a některých zvířat. Enterococcus avium a Enterococcus gallinarum jejichž původním stanovištěm jsou zejména střeva drůbeže (Görner a Valík, 2004). Enterokoky jsou také součástí střevní mikroflóry ptáků a jiných zvířat. Některé druhy jsou spojeny s rostlinami, nebo byly izolovány z vody (De Vos a kol., 2009). 7.1 Výskyt enterokoků v rostlinách Enterokoky jsou velmi odolné vůči nepříznivým podmínkám prostředí, proto jsou rozšířené i v přírodě. Často se vyskytují na rostlinách a ve velkém množství i v silážových krmivech (Görner a Valík, 2004). Z rostlin byly izolovány druhy E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. mundtii, E. casseliflavus a E. sulfureus. Tyto druhy jsou obecně častěji izolovány z květů, než z pupenů, nebo listů. Z tohoto můžeme odvodit, že se hmyz podílí na šíření enterokoků. Ačkoliv jsou tyto bakterie považovány pouze za dočasnou součást mikroflóry rostlin, v dobrých podmínkách se mohou šířit i na jejich povrchu (De Vos a kol., 2009) Valenzuela a kol., v roce 2011 prováděl výzkum výskytu bakterií rodu Enterococcus v divokých květinách na jihu Španělska. Zkoumali v nich výskyt rodu E. faecalis a E. faecium. Izolovalo se na čtyřicet šest vzorků z osmi různých druhů rostlin, ve kterých byly tyto dva rody identifikovány. E. fecalis se vyskytoval u 28 izolátů a E. faecium u 18 izolátů. Většina izolátů byla proteolytických (Valenzuela a kol., 2011). Dále pak 33
byly z rostlin izolovány tyto druhy rodu Enterococcus: E. camelliae, E. casseliflavus, E. mundtii a E. sulfureus (Valenzuela a kol., 2011). Z rostlin byly také izolovány bakterie rodu Enterococcus, které produkují bakteriociny (De Vos a kol., 2009). 7.2 Výskyt enterokoků v živočiších Enterokoky se pravidelně izolují ze stolice, nebo z exkrementů zvířat (Klaban, 1999). U zvířat se vyskytuje mnoho enterokoků jako např. E. faecium, E. cecorum, E. faecalis, E. hirae a E. durans. E. gallinarum a E. avium se u zvířat vyskytuje spíše vzácně (De Vos a kol., 2009). Enterokoky lze nalézt také v ústním sekretu horních dýchacích cest, na kůži, nebo v pochvě (Varman, 2012). Některé bakterie rodu Enterococcus jsou často izolovány ze zvířat. E. termitis byl nalezen ve střevech termitů. Nedávno popsané E. canis a E. hermanniensis byly izolovány z krčních mandlí psů. E. canintestini byl izolován ze psích výkalů, E. phoeniculicola byl objeven u dudka chocholatého a E. devriesei z hovězího masa (De Vos a kol., 2009). Enterococcus faecalis je součástí normální střevní mikroflóry drůbeže a člověka (Diderot, 1999). Jsou součástí mikroflóry v tlustém střevě, ale lze je prokázat i v tenkém střevě (Klaban, 1999). E. faecalis se nejčastěji vyskytuje v konečníku, anebo také v krčních mandlí psů a koček (De Vos a kol., 2009). Baele a kolektiv v roce 2002 nalezli jako společné obyvatele holubích střev E. columbae spolu s E. cecorum (De Vos a kol., 2009). Mundt v roce 1963 a Mallon a kolektiv v roce 2002 objevili enterokoky ve výkalech volně žijících savců, plazů a ptáků. E. casseliflavus byl shledán jako běžný obyvatel ve střevě hlemýždě zahradního (De Vos a kol., 2009). 7.3 Výskyt enterokoků ve vodě Bakterie rodu Enterococcus se vyskytují také v pitné vodě (Görner a Valík, 2004). Zde jejich přítomnost poukazuje na nedávné fekální znečištění. To je dáno tím, že enterokoky ve vodě odumírají rychleji, jako všechny indikátorové bakterie z čeledi Enterobactericeae (Burdychová a Sládková, 2007). E. faecalis, E. faecium, E. durans a E. hirae jsou považovány za enterokoky fekálního původu nicméně tyto enterokoky můžeme nalézt také v povrchových vodách 34