Metody testování humorální imunity
Co je to humorální imunita? Humorální = látková Buněčné produkty Nespecifická imunita příklady:» Lysozym v slinách, slzách» Sérové proteiny (proteiny akutní fáze)» Komplementový systém» ECP Specifická imunita» Protilátky
Opakování - Komplementový systém (1/2) Soubor zhruba 30 sérových proteinů Hlavní složky C1-C9 Ústřední složkou fragment C3 Samovolné štěpení C3b (reaktivní skupina), C3a C3b možnost vazby na různé povrchy C3a - chemotaxe
Protilátky a jejich využití Užití principu vazby protilátky s antigenem Komerční výroba protilátek antigen + protilátka Imunokomplex antigen-protilátka
Krev je odrazem našich nemocí Funkce krve Transportní Homeostatická Obranná, imunitní Srážlivá krev Sérum Nesrážlivá krev antikoagulans (např. EDTA) Krevní plazma
Jaké humorální složky se testují? (1/2) Protilátky Kvantitativní testy hladiny protilátek Funkční testy afinita k danému antigenu» Exoantigen» Autoantigen Cirkulující imunokomplexy
Jaké humorální složky se testují? (2/2) Komplement Složky Inhibitory Proteiny akutní fáze CRP ECP
Imunologické vyšetřovací metody 1. Aglutinace 2. Precipitace 3. Praktické využítí precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie 4. Enzymatická imunoanalýza (ELISA) 5. Nepřímá imunofluorescence 6. Elektroforéza 7. Western blot
1. Aglutinace (shlukování) Shlukování korpuskulárních částic nesoucích na svém povrchu antigen (aglutinogen) reagující s protilátkou (aglutininem) ve vyšetřovaném vzorku Princip Reakce: Antigen (aglutinogen) + protilátka (aglutinin) shluk (aglutinát)
Limitace nespecifičnost Zkřížená reaktivita Aglutinace v praxi Aglutinogen (antigen) Viry Bakterie Erytrocyty Latex Aglutinin Specifické protilátky Užití Průkaz protilátek» Viry, bakterie» Revmatoidní faktor
2. Precipitace (srážení) Aglutinace (shlukování) je reakce protilátky a korpuskulárního antigenu (krvinky, bakterie, latexové částice) x Precipitace (srážení) je reakce protilátky a koloidního antigenu
3. Praktické využítí precipitace: Turbidimetrie, nefelometrie Reakce antigen+protilátka = imunokomplex Princip Měření množství imunokomplexů (zákal) Koncentrace antigenu Úměrná» Rychlosti tvorby zákalu» Hustotě zákalu Kalibrační křivka Měření světla rozptýleného na imunokomplexech Měření úbytku světla, které prošlo roztokem obsahujícím imunokomplexy
Kalibrační křivka ax + by + c = 0 Př. 3x + 5y + 6 = 0
Laboratorní využití nefelometrie a turbidimetrie Imunoglobuliny Složky komplementu C3 C4 Proteiny akutní fáze CRP ECP Hladiny léků
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Enzymem značená protilátka váže analyt. Po odmytí nenavázané protilátky přeměňuje enzym dodaný substrát na barevný produkt měřitelný spektrofotometrem. Analyt Antigen Protilátka Kalibrační křivka
Jak detekovat antigen ELISou? Přímá ELISA Vazba značené protilátky přímo na antigen Nepřímá ELISA Vazba protilátky např. ze séra na antigen Detekce nepřímo pomocí sekundární značené protilátky Sandwichová ELISA Antigen je pomocí protilátky navázané na destičku připoután k pevné fázi detekce:» Přímo» Nepřímo
ELISA v praxi Měření Protilátkové třídy Protilátková odpověď» Autoantigen» Alergen» EBV» HIV» Onemocnění - Borelióza - Toxoplazmóza - Hepatitidy Přítomnost antigenu» Hormony př. tyroxin» Léků digoxin» Proteinů - CEA
5. Nepřímá fluorescenční analýza Fluorescence je emise záření fluorescenční látkou, která byla předtím excitována
Imunologická fluorescenční analýza Vazba protilátek ze séra na známý substrát detekce autoprotilátek Nepřímá detekce Substrát např.: Tkáňové řezy např. opičí Prvok - Crithidia luciliae Lidské granulocyty Tkáňové kultury HEp-2 buňky
Mikroskopická fluorescenční analýza Obr.1 Opičí jícen - IgA protilátky proti endomyziu Obr.2 Crithidia luciliae -protilátky proti dsdna A B C < cytoplazmatic staining Obr.3 Lidské granulocyty - různá specifita protilátek proti granulocytům Obr.4 Hep-2 buňky- protilátky proti a) jaderným strukturám b) mitochodriím c) aktinu
6. Elektroforéza Elektroforéza je pohyb nabitých částic v elektrickém poli SDS page elektroforéza Denaturace proteinů za přítomnosti» Merkaptoetanolu zrušení S-S můstků» SDS vazba na denaturovaný protein záporný náboj je úměrný velikosti proteinu Možnost použití gelu rozdělení proteinů dle velkosti SDS +
SDS page elektroforéza Ultrastruktura gelu
7. Western blot
7. Western blot Navazuje na elektroforézu Přenesení proteinů z gelu na membránu za pomocí elektrického pole Značení detekovaného proteinu protilátkou Přímá detekce antigenu Nepřímá detekce přidání séra pacienta Zviditelnění vazby (reakce enzym-substrát) Fluorescence Luminiscence detekce pomocí filmu negativ Nerozpustné barvivo
Western blot v klinické diagnostice Testování reakce jednotlivých sérových protilátek se specifickým antigenem Konfirmační testování pro ELISA Testování protilátek př.: Chlamydie Borelie HIV
Děkuji za pozornost