VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO

VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO Fakulta veterinární hygieny a ekologie Ústav hygieny a technologie masa Praktické návody pro výuku cvičení z Hygieny produkce masa pro posluchače Fakulty veterinárního lékařství doc. MVDr. Hana Buchtová, Ph.D. Ing. Gabriela Bořilová, Ph.D. Ing. František Ježek, Ph.D. MVDr. Irena Svobodová, Ph.D. Tato multimediální příručka je spolufinancována z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky Brno 2012

Úvod Tato multimediální výuková pomůcka je určena posluchačům 5. ročníku Fakulty veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně jako podpora výuky praktických cvičení z předmětu Hygiena produkce masa II. Pomůcka obsahuje základní principy a pracovní návody ke cvičením zařazeným do výuky v letním semestru. Jako dostupný studijní materiál je určena pro teoretickou přípravu studentů k praktické výuce v rámci samostudia a pro zápočtový test a rovněž jako jeden z možných zdrojů informací pro závěrečnou státní zkoušku z předmětu Hygiena potravin, která je zařazena v průběhu výuky v 6. ročníku jejich studia. Obsahově jsou jednotlivá cvičení sestavena a zpracována v dostatečném rozsahu poskytujícím studentům nezbytný přehled a orientaci v dané problematice. 2

Seznam témat praktických cvičení POMOCNÉ ZKOUŠKY... 4 VETERINÁRNÍ VYŠETŘENÍ ZVĚŘINY... 20 MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ MASA A ORGÁNŮ... 27 VYŠETŘENÍ NA REZIDUA INHIBIČNÍCH LÁTEK... 37 VYŠETŘENÍ MASA NA PŘÍTOMNOST LAREV TRICHINELLA SPP.... 48 DRUHOVÁ IDENTIFIKACE MASA POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH METOD (PCR)... 56 LABORATORNÍ VYŠETŘENÍ CHEMICKÉHO SLOŽENÍ MASA... 63 TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI MASA... 80 CHEMICKÉ VYŠETŘENÍ MASNÝCH VÝROBKŮ (ŠUNKA)... 83 MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ MASNÝCH VÝROBKŮ... 91 VETERINÁRNÍ VYŠETŘENÍ MOŘSKÝCH RYB... 98 VETERINÁRNÍ VYŠETŘENÍ SLADKOVODNÍCH RYB... 115 TECHNOLOGIE PORÁŽENÍ JATEČNÝCH ZVÍŘAT... 132 VETERINÁRNÍ VYŠETŘENÍ JATEČNÉ DRŮBEŽE... 137 SENZORICKÉ HODNOCENÍ MASNÝCH VÝROBKŮ... 142 3

POMOCNÉ ZKOUŠKY Úvod do problematiky Pomocné zkoušky představují jednoduchá vyšetření, která je možno provést přímo v provozu nebo v provozní laboratoři. Hlavním důvodem pro jejich provedení je získání doplňujících informací o stavu suroviny, nutných pro konečné rozhodnutí o zdravotní nezávadnosti. Pomocné zkoušky zahrnují: 1. zkoušku varem, pečením (grilováním) nebo škvařením 2. zkoušku na průkaz žlučových barviv 3. stanovení množství volné vody 4. stanovení ph 5. stanovení barvy/světlosti masa Doporučená literatura Vyhláška č. 289/2007 Sb., o veterinárních a hygienických požadavcích na živočišné produkty, které nejsou upraveny přímo použitelnými předpisy Evropských společenství, v platném znění V Příloze 3 jsou uvedeny odběry vzorků při veterinární prohlídce 4

1. Zkouška varem, pečením, grilováním, škvařením Zkouška se provádí především pro odhalení/zvýraznění pachových odchylek masa. Abnormální pach je nejvýraznější před vychladnutím masa. Po zchlazení masa jsou pachové odchylky méně zřetelné. Zkouška se provádí za 24 hodin po poražení. Základní indikace pro provedení zkoušky podezření na pachovou odchylku (zejména samčí pach) použití nového krmiva, nových krmných technologií opožděné vykolení podezření na sníženou trvanlivost suroviny (např. dovoz) porážka nemocných zvířat (abscesy, gangréna, hnilobný rozklad) metabolické poruchy podání léčiv krátce před poražením absorpce jiných pachů při nevhodném skladování Princip Při zvýšené teplotě jsou pachové odchylky výraznější. Aromatické látky jsou vázány na tukovou tkáň. Princip zkoušky spočívá ve zvýšení teploty vyšetřovaného vzorku na takovou hodnotu, při níž spolu s vodní parou těkají i aromatické látky. Přístroje, pomocná zařízení, chemikálie, spotřební materiál Vzorky vzorkem pro testování je svalovina s vyšším podílem tuku 5

vzorky se odebírají za 24 hodin po poražení základní množství vzorku je 250-300 g u velkých jatečných zvířat (skot, malí přežvýkavci, lichokopytníci, prasata), vzorek se odebírá z břišní stěny u kryptorchidních kanců je možno odebírat také vzorek z laloku u malých jatečných zvířat (drůbež, králíci) se odebírají celá těla, části svalové, tukové tkáně nebo vzorky jiných tkání Přístroje zařízení pro tepelnou úpravu (vařič, trouba, gril) Spotřební materiál a běžné laboratorní vybavení nádoba na vaření (hrnec s poklicí), pečení, grilování (plech, rošt), škvaření (pánev) nůž prkýnko pachově neutrální tuk Pracovní postup Zkouška varem 1. Uveďte vodu v hrnci do varu. 2. Do vroucí vody vložte vyšetřovaný vzorek a pod poklicí povařte zhruba 10 minut. 3. Posuďte vůni unikajících par Zkouška pečením (grilováním) 1. Rozpalte troubu nebo gril. 2. Vložte vyšetřovaný vzorek na plech nebo rošt a pečte (grilujte) ve vlastním tuku nebo pachově neutrálním tuku 10 minut. 3. Posuďte vůni unikajících par. 6

Zkouška škvařením 1. Rozkrájejte vzorek na kousky o hraně 1-2 cm. 2. Vložte vzorek do hrnce a škvařte až do uvolnění tuku. 3. Posuďte vůni unikajících par. Většina pachových odchylek je doprovázena také změnou chutě. Pro posouzení chutě vzorku je nutné prodloužit tepelnou úpravu o dalších 10-20 minut. Vyhodnocení Výsledkem vyšetření je detekce nebo absence abnormální vůně vyšetřovaného vzorku. Dle charakteru odchylky a její příčiny se omezuje poživatelnost jatečných kusů nebo jednotlivých šarží zvířat následovně: u nemocných zvířat, metabolických poruch, opožděného vykolení, nebo v případech, kdy jde o maso kazící se vyloučení z lidské spotřeby silný samčí pach vyloučení z lidské spotřeby slabý samčí pach poživatelné po úpravě nové krmivo, krmné technologie vyloučení z lidské spotřeby nebo poživatelné po úpravě, záleží na tom, zda je pachová odchylka patrná i po zpracování masa 2. Zkouška na průkaz žlučových barviv Zkouška se provádí v případech žlutého zabarvení tkání, zejména tkáně tukové. Žluté zabarvení tuku může být vyvoláno ukládáním karotenoidních pigmentů z krmiva. Oproti tomu přítomnost žlučových barviv představuje vždy patologický stav. 7

Základní indikace pro provedení zkoušky žluté zabarvení tuků, tkání, viditelných sliznic vyloučení žloutenky Princip Princip zkoušky spočívá v rozdílné rozpustnosti žlučových barviv a karotenů v alkoholu a éteru. Žlučová barviva jsou rozpustná ve vodných roztocích a alkoholu, zatímco karoteny jsou rozpustné v éteru. Přístroje, pomocná zařízení, chemikálie, spotřební materiál Vzorky vzorkem je tuková tkáň, nejčastěji plstní tuk či lůj v množství 250-300 g (velká jatečná zvířata) vzorek se odebírá za 24 hodin po poražení u malých jatečných zvířat (drůbež, králíci) lze odebírat tukovou tkáň nebo celá těla Přístroje laboratorní navážky Chemikálie 50 % etanol éter Spotřební materiál a běžné laboratorní vybavení nůž odměrný válec nebo pipety 8

stojan na zkumavky pinzeta prkýnko zkumavky se zátkami Pracovní postup 1. Vložte vzorek tuku o hmotnosti 1-2 g do zkumavky. 2. Přidejte 5 ml 50 % etanolu, zazátkujte, promíchejte. 3. Nechejte stát 60-120 minut. 4. Vložte další vzorek tuku o hmotnosti 1-2 g do zkumavky. 5. Přidejte 6 ml éteru, zazátkujte, promíchejte a uvolněte zátku. 6. Nechejte stát 60-120 minut. 7. Posuďte zabarvení zkumavek s etanolem a éterem. Vyhodnocení Barva obsahů obou zkumavek se posoudí oproti bílému pozadí. Žluté zabarvení zkumavky s alkoholem značí přítomnost žlučových barviv, žluté zabarvení zkumavky s éterem značí přítomnost karotenů. V případě, že jsou obě zkumavky žluté, došlo současnému výskytu žloutenky i odchylek barvy způsobené pigmenty z krmiva. Posouzení zdravotní nezávadnosti při výskytu žloutenky vyloučení z lidské spotřeby přítomnost karotenů poživatelné 9

3. Stanovení množství volné vody Voda se ve svalovině vyskytuje ve formě vody vázané a vody volné. Volná voda je ta část masové šťávy, která volně vykapává z masa. Vyjádření volná voda není přesné, jelikož se vždy jedná o masovou šťávu, ve které jsou rozpuštěny další látky, např. bílkoviny, soli atd. V různých partiích těla je rozdílný obsah vody, což souvisí se zastoupením ostatních tkání, zejména tkáně tukové a pojivové. Při některých patologických stavech se zvyšuje provlhlost kosterní svaloviny a s ní i obsah volné vody na úkor vody vázané. Množství volné vody lze ve svalovině stanovit dvojím způsobem: kompresní metodou stanovením ztráty masové šťávy odkapáním Základní indikace pro provedení zkoušky průkaz hydremického masa porážení vyhublých zvířat podezření na jakostní odchylky masa Princip Cílem zkoušky je prokázat množství uvolněné masové šťávy a posoudit, zda je množství zvýšené či snížené oproti normálnímu stavu. Přístroje, pomocná zařízení, chemikálie, spotřební materiál Vzorky množství volné vody se stanovuje u libové svaloviny odebrané křížovým pravidlem základní množství vzorku je 250-300 g u velkých jatečných zvířat 10

pro kompresní zkoušku se vzorek odebírá za 24 hodin po poražení pro stanovením ztráty masové šťávy odkapáním se vzorek odebírá do jedné hodiny po poražení u malých jatečných zvířat (drůbež, králíci) se odebírají celá těla Přístroje chladnička navážky s přesností na dvě desetinná místa Spotřební materiál a běžné laboratorní vybavení filtrační papír nůž polyetylénové (PE) sáčky pinzeta prkýnko skleněné desky o velikosti 15x15 cm stopky šablony závaží o hmotnosti 1 kg Pracovní postup Kompresní metoda 1. Navažte 0,3 g vzorku svalové tkáně bez povázek a tuku. 2. Vložte vzorek na filtrační papír mezi dvě skleněné desky. 3. Zatižte závažím o hmotnosti 1 kg na dobu 5 minut. 4. Podle šablony změřte velikost skvrn. 5. Menší skvrna (f) je vytvořena vzorkem masa, větší skvrna (F) uvolněnou masovou šťávou a vzorkem masa. 6. Vzájemně porovnejte vzniklé skvrny a stanovte Q koeficient. 11

Schéma 1 Velikosti skvrn šablony pro stanovení Q koeficientu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 12

Stanovení ztráty masové šťávy odkapáním 1. Zvažte 150g vzorku masa s přesností na dvě desetinná místa, údaj zapište. 2. Vložte vzorek do PE sáčku. 3. Vzorek ponechte v chladničce při teplotě 4-7 C 24 hodin. 4. Po uplynutí požadované doby vyjměte vzorek ze sáčku. 5. Válejte vzorkem po filtračním papíru, až bude osušený. 6. Zjistěte hmotnost vzorku zvážením s přesností na dvě desetinná místa. 7. Z rozdílu hmotností vypočítejte procentuální množství uvolněné masové šťávy. Výpočet Kompresní metoda Vzorec pro výpočet Q koeficientu je následující: Q = = Stanovení ztráty masové šťávy odkapáním Ztráta odkapáním (ZO) se vypočítá dle vzorce: ZO = x 100 [%] a hmotnost vzorku před vložením do sáčku b hmotnost vzorku osušeného po 24 hod. 13

Vyhodnocení Podle stanovených hodnot Q koeficientu, případně ZO se posoudí množství volné vody a potvrdí nebo vyvrátí odchylky v jakosti masa Tabulka 1 Hodnoty Q koeficientu určené dle změření velikostí skvrn F f 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 1,00 2 0,83 1,00 3 0,69 0,84 1,00 4 0,59 0,72 0,85 1,00 5 0,51 0,62 0,73 0,86 1,00 6 0,45 0,54 0,64 0,75 0,87 1,00 7 0,39 0,47 0,56 0,66 0,77 0,88 1,00 8 0,35 0,42 0,50 0,58 0,68 0,78 0,89 1,00 9 0,31 0,37 0,44 0,52 0,61 0,69 0,79 0,89 1,00 10 0,28 0,34 0,40 0,47 0,54 0,62 0,71 0,80 0,90 1,00 11 0,25 0,30 0,36 0,42 0,49 0,56 0,64 0,72 0,81 0,90 1,00 12 0,23 0,27 0,33 0,38 0,44 0,51 0,58 0,66 0,74 0,82 0,91 1,00 13 0,21 0,25 0,30 0,35 0,40 0,46 0,53 0,60 0,67 0,75 0,83 0,91 1,00 14 0,19 0,23 0,27 0,32 0,37 0,43 0,48 0,55 0,61 0,68 0,76 0,83 0,92 1,00 15 0,17 0,21 0,25 0,29 0,34 0,39 0,44 0,50 0,56 0,63 0,69 0,76 0,84 0,92 1,00 14

Tabulka 2 Směrné hodnoty pro odchylky Q koeficientu množství vylisované šťávy maso vepřové maso hovězí značně zvýšené Q 1 < 0,40 Q 24 < 0,35 hodnoty nestanoveny Q 1 < 0,50 Q 1 < 0,5 mírně zvýšené Q Q 24 < 0,40 24 < 0,35 (AD) Q 24 < 0,40 (LD) Q 1 < 0,64 Q 1 < 0,60 mírně snížené Q Q 24 < 0,64 24 < 0,55 (AD) Q 24 < 0,60 (LD) značně snížené Q 1 < 0,72 Q 24 < 0,72 hodnoty nestanoveny AD musculus adductor, LD - musculus longissimus Posouzení zdravotní nezávadnosti při potvrzení vyššího obsahu volné vody u vyhublých zvířat vyloučení z lidské spotřeby průkaz jakostních odchylek masa (PSE, DFD) poživatelné po úpravě hydrémie maso se ponechá 24 hodin v chladírně, během této doby dochází ke zpětné resorpci tekutin pokud už hydrémie není patrná poživatelné po úpravě hydrémie i po 24 h vyloučení z lidské spotřeby 15

4. Stanovení ph Hodnota ph udává míru kyselosti či zásaditosti tkáně. H + ionty jsou kyselé, zatímco OH - ionty jsou zásadité. Jejich vzájemný poměr se v průběhu zrání masa značně mění, což souvisí s rozkladem glykogenu a vzrůstající koncentrací kyseliny mléčné. Při některých patologických stavech však hodnoty ph neúměrně rychle rostou nebo naopak klesají. Hovězí maso je krátce po poražení slabě kyselé nebo slabě alkalické, hodnoty ph kolísají mezi 6,5 až 7,2. Do 48 hodin po poražení dochází k okyselení masa až na hodnoty 5,6, poté zůstávají hodnoty víceméně stabilní. U vepřového masa jsou hodnoty ph obdobné. Krátce po poražení se pohybují v rozmezí od 6,8-7,2, za 24 hodin po poražení klesají na hodnoty okolo 5,8. Pokud ph masa v průběhu dalšího skladování vzroste na 6,8, svědčí to o nastupujícím kažení, které je patrné také senzoricky. Měření ph lze provést různými způsoby. Nejjednodušší je měření pomocí ph papírků, ovšem toto stanovení je pouze orientační. V praxi se používá elektrometrického měření pomocí přenosných ph metrů, které lze používat přímo v provozu nebo v laboratoři. Posledním způsobem je stanovení ph indukovanou glykolýzou. Všechna měření je nutno provádět ve dvou časových intervalech, za hodinu po poražení a v době, kdy ph poklesne na minimální hodnotu - ph ult. Základní indikace pro provedení zkoušky horečnatá onemocnění nucená porážka vyčerpání opožděné vykolení podezření na sníženou trvanlivost masa podezření na jakostní odchylky masa sledování průběhu enzymatických změn v mase 16

Princip Cílem vyšetření je ve dvou předem definovaných časových intervalech provést měření ph a určit, zda došlo ke změně v průběhu biochemických postmortálních procesů. Přístroje, pomocná zařízení, chemikálie, spotřební materiál Vzorky ph se stanovuje u libové svaloviny odebrané křížovým pravidlem základní množství vzorku je 250-300 g u velkých jatečných zvířat u malých jatečných zvířat (drůbež, králíci) se odebírají celá těla měřit lze také přímo na jatečném kusu, nejlépe svalovinu hřbetní, případně kýtu Přístroje ph metr se sadou standardů Spotřební materiál a běžné laboratorní vybavení nůž prkýnko Pracovní postup 1. Udělejte nožem čerstvý zářez do vzorku svaloviny. 2. Vložte měrnou elektrodu. 3. Zaznamenejte hodnotu ph. 4. Měření 2x zopakujte a z naměřených výsledků vypočítejte aritmetický průměr. 17

Vyhodnocení Těla jatečných zvířat, u nichž dochází k abnormalitám v průběhu postmortálních procesů, se posuzují následovně: horečnatá onemocnění, vyčerpání vyloučení z lidské spotřeby průkaz jakostních odchylek masa (PSE, DFD) poživatelné po úpravě 5. Stanovení barvy/světlosti masa K popisu barvy lze užít tří parametrů, které ji definují odstín, sytost a jas. Odstín je přirovnání barvy k některé ze známých spektrálních barev, sytost vyjadřuje relativní podíl intenzity světla v dané oblasti spektra proti celkové intenzitě a jas vyjadřuje celkové množství světla odraženého vzorkem. Měření barevnosti je prováděno přístrojově pomocí spektrofotometrů. Měrná hlavice přístroje se umístí do kontaktu s měřeným povrchem. Světelný zdroj ozáří vyměřené měrné pole a fotodetektor poté vyhodnotí množství odraženého světla. Množství odraženého světla se dá vyjádřit jako procentuální odraz oproti bílému pozadí, které představuje 100 %. Základní indikace pro provedení zkoušky dystrofické procesy ve svalovině podezření na jakostní odchylky masa nedostatečné vykrvení Princip Cílem této zkoušky je prokázat nebo potvrdit barevnou odchylku svaloviny na základě přístrojového měření. 18

Přístroje, pomocná zařízení, chemikálie, spotřební materiál Vzorky barva se stanovuje u libové svaloviny odebrané křížovým pravidlem základní množství vzorku je 250-300 g u velkých jatečných zvířat u malých jatečných zvířat (drůbež, králíci) se odebírají celá těla měřit lze také přímo na jatečném kusu, nejlépe svalovinu hřbetní, případně kýtu Přístroje remisní spektrofotometr Spotřební materiál a běžné laboratorní vybavení nůž Pracovní postup Při vlastním měření světlosti masa se postupuje podle návodu výrobce použitého spektrofotometru. Pro měření v provozu se používají přenosné spektrofotometry. Při laboratorním měření se využívá spektrofotometrů s remisním nástavcem. Remise se měří při 525 nm u vzorků libové svaloviny, která se těsně před měřením seřízne kolmo na svalová vlákna. Měří se vždy na čerstvém řezu svaloviny zpravidla za 24 hodin po poražení. Výsledná hodnota se stanoví jako průměr ze dvou měření. Vyhodnocení Vyhodnocení vyšetření závisí na použitém přístroji na jednotkách měření. Posouzení zdravotní nezávadnosti nedostatečné vykrvení vyloučení z lidské spotřeby průkaz jakostních odchylek masa (PSE, DFD) poživatelné po úpravě 19

VETERINÁRNÍ VYŠETŘENÍ ZVĚŘINY Úvod do problematiky Prvotní ošetření zvěře (dohledávka, povinné označení, vyvržení) provádí lovec. Další povinnosti zacházení s uloveným kusem vychází z evropské i národní legislativy. Tok zvěřiny je trojí: a) Osobní spotřeba lovce lovec má povinnost zvěř označit (lístek o původu zvěře, plomba) a u vnímavých zvířat (divoká prasata) zajistit povinné vyšetření na trichinelózu. b) Přímá dodávka konečnému spotřebiteli děje se formou přímého prodeje na místě ulovení nebo prodejem v místní maloobchodní prodejně. V obou případech lze takto obchodovat pouze s kusy, které byly posouzeny proškolenou osobou a u kterých proškolená osoba nenalezla žádné změny. U vnímavých kusů je opět nutno zajistit povinné vyšetření na trichinelózu. c) Dodávka do podniku zpracovávajícího zvěřinu sem směřují ulovené kusy bez orgánů, u kterých nebyly proškolenou osobou nalezeny změny; kusy včetně orgánů, u kterých byly proškolenou osobou nalezeny změny a kusy, včetně orgánů, které nebyly proškolenou osobou posouzeny. V závodech na zpracování zvěřiny je prováděno veterinární vyšetření těl ulovené volně žijící zvěře úředním veterinárním lékařem a výsledné rozhodnutí o zdravotní nezávadnosti. 20

Proškolená osoba osoba, která úspěšně absolvovala odborné školení na posuzování těl ulovené volně žijící zvěře, provádí vizuální posouzení ulovených kusů, výsledek značí razítkem do dokumentace (lístek o původu zvěře, protokol). Na razítku je uvedeno: BEZE ZMĚN nebo SE ZMĚNAMI a kód proškolené osoby, pod kterým je evidována. Pokud je výsledek posouzení příznivý (beze změn), může lovec uplatnit svoje lovecké právo (trofej, nárok na vnitřnosti ulovených kusů jazyk, srdce, plíce, játra, slezina, ledviny). Posouzení proškolenou osobou zahrnuje: posouzení výživného stavu, povrchu těla, zejména se zřetelem na výskyt výrazných změn na kůži a osrstění způsobených ektoparazity, zánětlivých změn na kůži a poranění pokousáním, a dále, jde-li o: a) velkou volně žijící zvěř, vyšetří se tělní otvory a jejich okolí, výstelka tělních dutin, vnitřní orgány, svalovina a na hlavě zejména sliznice dutiny ústní a jazyk, b) zajíce a divoké králíky, vyšetří se oči, tělní otvory a jejich okolí, břišní krajina a vnější pohlavní orgány, nebo c) zvěř pernatou, vyšetří se oči a tělní otvory. Podle každoročního plánu metodiky kontroly zdraví vydané SVS se na celém území vyšetřují 3 ulovení zajíci na 100 km 2 na přítomnost specifických protilátek proti tularémii rychlou sklíčkovou aglutinací. Dále se vyšetřují všichni ulovení zajíci, u kterých bylo vysloveno podezření na tularémii. Podobná je situace u brucelózy vyšetřují se všichni ulovení zajíci, u kterých bylo vysloveno podezření z nákazy. Tularémie zoonotické onemocnění vyvolané gramnegativní bakterií Francisella tularensis. Nákaza s typickou přírodní ohniskovostí, která u zajíců probíhá většinou jako sepse a vede k úhynům postižených zvířat. Při chronickém průběhu dochází k výrazné malátnosti jedinců a ztrátě plachosti. Patognomickým příznakem je výrazné zvětšení sleziny, dále bývají postiženy mízní uzliny, játra a plíce. K přenosu na člověka dochází většinou přímým kontaktem s postiženým kusem nejčastější je forma kožní (záněty, vředy), méně časté jsou další formy onemocnění plicní, střevní a oční. 21

Brucelóza zoonotické onemocnění vyvolané gramnegativní bakterií rodu Brucella spp. Onemocnění se u zajíců projevuje záněty na pohlavních orgánech, objevují se otoky, zarudnutí, abscesy v pochvě, zmetání u samic, u samců je typickým příznakem zánět varlat a nadvarlat. U lidí se jedná o multisystémové onemocnění (postihuje více orgánových soustav) charakterizované horečkou, chronickým průběhem a postižením různých orgánů. Hlavním úkolem cvičení je provedení posouzení těla uloveného zajíce a zaujmutí stanoviska beze změn se změnami a provedení rychlé sklíčkové aglutinace na průkaz protilátek proti tularémii a brucelóze. Princip V přítomnosti specifických protilátek (pozitivní kus) proti uvedeným nákazám dochází při smíchání kapky vyšetřované krve s antigenem k aglutinaci. Aglutinace je pozorovatelná po mírném zahřátí vzorku jako velmi jemné vločky, zbytek tekutiny se projasní. Přítomnost protilátek znamená jak právě probíhající onemocnění, tak i postinfekční imunitu. Přístroje, pomocná zařízení, chemikálie, spotřební materiál Vzorky zajíc krev zajíce odebraná ze srdce Pomocná zařízení lihový nebo plynový kahan 22

Chemikálie ethanol diagnostická souprava na tularémii (dodává Bioveta a.s.) diagnostická souprava na brucelózu (dodává Bioveta a.s.) Spotřební materiál buničitá vata jehly podložní sklíčka rukavice skleněné tyčinky stříkačky typu Luer o objemu 2 ml Pracovní postup Nasaďte si rukavice a proveďte posouzení těla uloveného zajíce podle následujících bodů: 1. Proveďte posouzení výživného stavu. 2. Proveďte posouzení povrchu těla srsti a změn na kůži. 3. Proveďte posouzení očí. 4. Proveďte posouzení tělních otvorů a jejich okolí. 5. Proveďte posouzení břicha. 6. Proveďte posouzení pohlavních orgánů. Proveďte odběr krve ze srdce zajíce. Použijte odebranou krev na provedení rychlé sklíčkové aglutinace pro diagnostiku tularémie a brucelózy. Zkoušky proveďte se vzorkem, s pozitivní a negativní kontrolou. Při diagnostice tularémie je součástí soupravy pouze pozitivní kontrola. 23

Diagnostika brucelózy metodou rychlé sklíčkové aglutinace Provedení zkoušky s negativním sérem 1. Na čisté podložní sklíčko (předem očistit lihem) naneste kapku negativního séra. 2. Vedle kapky séra naneste kapku antigenu. 3. Smíchejte obě kapky skleněnou tyčinkou a rozetřete na větší plochu. 4. Nahřejte podložní sklíčko nad plamenem kahanu (POZOR, nesmí vyschnout ani vařit!) 5. Při lehkém naklánění sklíčka pozorujte za 2 minuty výsledek reakce. Provedení zkoušky s pozitivním sérem 1. Na čisté podložní sklíčko (předem očistit lihem) naneste kapku pozitivního séra. 2. Vedle kapky séra naneste kapku antigenu. 3. Smíchejte obě kapky skleněnou tyčinkou a rozetřete na větší plochu. 4. Nahřejte podložní sklíčko nad plamenem kahanu. 5. Při lehkém naklánění sklíčka pozorujte za 2 minuty výsledek reakce. Provedení zkoušky se vzorkem 1. Na čisté podložní sklíčko (předem očistit lihem) naneste kapku odebrané krve přímo ze stříkačky sejmout jehlu! 2. Vedle kapky krve naneste kapku antigenu. 3. Smíchejte obě kapky skleněnou tyčinkou a rozetřete na větší plochu. 4. Nahřejte podložní sklíčko nad plamenem kahanu. 5. Při lehkém naklánění sklíčka pozorujte za 2 minuty výsledek reakce. 24

Diagnostika tularémie metodou rychlé sklíčkové aglutinace Provedení zkoušky s pozitivním sérem 1. Na čisté podložní sklíčko (předem očistit lihem) naneste kapku pozitivního séra. 2. Vedle kapky séra naneste kapku antigenu. 3. Smíchejte obě kapky skleněnou tyčinkou a rozetřete na větší plochu. 4. Nahřejte podložní sklíčko nad plamenem kahanu. 5. Při lehkém naklánění sklíčka pozorujte za 1-3 minuty výsledek reakce. Provedení zkoušky se vzorkem 1. Na čisté podložní sklíčko (předem očistit lihem) naneste kapku odebrané krve přímo ze stříkačky sejmout jehlu! 2. Vedle kapky krve naneste 5 kapek antigenu. 3. Smíchejte obě kapky skleněnou tyčinkou a rozetřete na větší plochu. 4. Nahřejte podložní sklíčko nad plamenem kahanu. 5. Při lehkém naklánění sklíčka pozorujte za 1-3 minuty výsledek reakce. Vyhodnocení Prohlídka proškolenou osobou Za změny se považují: zřetelné vyhubnutí, zranění - zvláště pokud jsou vícečetná či zhnisaná, nádory a vícečetné abscesy. Dále se za změněné považuje znečištění okolí anu výkaly, otevřené zlomeniny kostí způsobené před ulovením, záněty pupku, změny na očích, dutině ústní, výtoky a záněty nozder, otoky varlat či kloubů. Kusy, u kterých jsou nalezeny změny, jsou odeslány úřednímu veterinárnímu lékaři (doprovázené protokolem proškolené osoby o nálezu změn) ke konečnému rozhodnutí o poživatelnosti. 25

Rychlá sklíčková aglutinace (brucelóza, tularémie) Pozitivní výsledek: Tvorba vloček s vyjasněním tekutiny. Negativní výsledek: Bez tvorby vloček a vyjasnění směsi séra (krve) s antigenem. Pozitivní kusy jsou vyloučeny z lidské spotřeby. Doporučená literatura Nařízení Evropského Parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu, v platném znění definuje proškolenou osobu, její povinnosti, zacházení s ulovenou volně žijící zvěří Nařízení komise (ES) č. 2075/2005, kterým se stanoví zvláštní předpisy pro úřední kontroly trichinel v mase, v platném znění Nařízení Evropského Parlamentu a Rady (ES) č. 854/2004, kterým se stanoví zvláštní pravidla pro organizaci úředních kontrol produktů živočišného původu určených k lidské spotřebě, v platném znění uvádí vlastní provádění postmortem prohlídky ulovené volně žijící zvěře úředním veterinárním lékařem Zákon o myslivosti č. 449/2001 Sb., v platném znění udává povinné označení zvěře Veterinární legislativa definuje zacházení s ulovenou zvěří, praktické povinnosti proškolené osoby a požadavky na její proškolení Zákon č. 166/1999 Sb., O veterinární péči, v platném znění. Vyhláška č. 289/2007 Sb., o veterinárních a hygienických požadavcích na živočišné produkty, které nejsou upraveny přímo použitelnými předpisy Evropských společenství, v platném znění 26

MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ MASA A ORGÁNŮ Úvod do problematiky Mikrobiologické vyšetření svaloviny a orgánů jatečných zvířat se provádí v případech podezření na patologické stavy, které by mohly ohrozit zdravotní nezávadnost živočišných surovin. Odběr vzorků k vyšetření provádí úřední veterinární lékař v průběhu post-mortem prohlídky jatečných kusů. Základní mikrobiologické vyšetření zahrnuje testování na přítomnost bakterií rodu Salmonella spp., přítomnost anaerobních bakterií a dále se zjišťuje celková úroveň bakteriální kontaminace. V případech podezření na konkrétní bakteriální infekci, lze rozsah vyšetření upravit. Indikace k vyšetření vyloučení infekce masa patogenními nebo podmíněně patogenními mikroorganismy podezření na sníženou kvalitu masa patologické stavy, záněty, horečnatá onemocnění porodní a poporodní komplikace opožděné vykolení chybění některých částí těla zvířete export a import Stanovení celkové úrovně bakteriální kontaminace = primokultivace Vyšetření slouží jako orientační zjištění úrovně bakteriální kontaminace vyšetřovaných vzorků zjištěných kultivací na pevných základních půdách a diferenciačních půdách, kde podle morfologie, pigmentace a hemolýzy vylučujeme, eventuálně izolujeme podezřelé kolonie. Při primokultivaci se používá krevní agar a půdy pro stanovení Salmonella spp. 27

Stanovení anaerobních mikroorganismů Vyšetření slouží pro průkaz mikroorganismů rostoucích za nepřístupu kyslíku. Anaerobní mikroorganismy se v případě vyšetření vzorků masa a orgánů kultivují v glukózovém agaru rozplněném do zkumavek a přelitém parafínovou zátkou. Stanovení Salmonella spp. Při vyšetření vzorků na přítomnost salmonel se postupuje podle normy doporučené pro vyšetřování potravin. V případě vzorků masa a orgánů jatečných zvířat jde pouze o průkaz přítomnosti této bakterie, nikoli o stanovení jejího množství. Cíl Cílem vyšetření je prokázat nebo potvrdit přítomnost patogenních nebo potenciálně patogenních mikroorganismů a na základě výsledků mikrobiologických zkoušek rozhodnout o poživatelnosti vyšetřovaných kusů velkých jatečných zvířat, případně celé šarže (dodávky) malých jatečných zvířat. Přístroje, pomocná zařízení, chemikálie, spotřební materiál Vzorky Vzorky pro mikrobiologické vyšetření lze odebrat v průběhu nebo po provedení postmortem prohlídky, tedy bez vychlazení masa a orgánů. Základní vyšetřované vzorky odebírané v případě těl velkých jatečných zvířat jsou: kostka svalu o hraně nejméně 8 cm křížově z přední a zadní čtvrti 28

po jedné neporušené krajinové mízní uzlině s okolním vazivem křížově z protilehlých čtvrtí u prasat se z přední části těla zvířete odebírá ln. cervicalis superficialis dorsalis, u skotu ln. cervicalis superfricialis neboli ln. praescapularis u prasat se ze zadní části těla zvířete odbírají lnn. iliaci medii, u skotu lnn. iliofemorales. V případě, že tyto uzliny chybí, odebírá se jak u prasat, tak u skotu ln. popliteus. celá neporušená slezina nebo její část o délce nejméně 10 cm celá neporušená ledvina nebo její část o délce nejméně 10 cm kostka jater o hraně 6-8 cm, případně s vyprázdněným nebo podvázaným žlučníkem, u selat, jehňat, kůzlat celá játra chybí-li některé vnitřnosti, odebírá se k vyšetření neporušená rourovitá kost nebo její část o délce nejméně 10 cm vzorek prodloužené míchy z oblasti mozkového kmene U malých jatečných zvířat se k vyšetření odebírají celá těla. Vzorky pro mikrobiologický rozbor se odebírají také z částí těla a orgánů (tuku), které jsou změněné. Přístroje termostat vodní lázeň Pomocná zařízení kahan opalovací pistole Chemikálie 29

kultivační půdy krevní agar s beraní krví, glukózový agar, tlumivá peptonová voda, pomnožovací půdy dle Rappaport-Vassiliadise a Müller-Kaufmanna, XLD agar, půda s brilantovou zelení Spotřební materiál a běžné laboratorní vybavení bakteriologické kličky nástavec na pipety parafín pipety 1ml, 10 ml sterilní pinzety, skalpely, nůžky stojan na zkumavky zkumavky Pracovní postup Pro všechna mikrobiologická vyšetření se vzorky ke kultivaci odebírají po předchozím opálení povrchu vzorku opalovací pistolí. Povrchové opálení je potřebné pro odstranění sekundární kontaminace. Poté se vzorek v místě opálení nařízne za použití sterilních nástrojů a samotná vyšetřovaná tkáň se odebírá z hloubky vzorku. Primokultivace 1. Připravte a popište si Petriho misky s krevním agarem viz schéma 1. Na jednu misku budou kultivovány vzorky svaloviny, na druhou vzorky mízních uzlin, na třetí vzorky orgánů. 2. Připravte a popište si Petriho misky s XLD agarem a agarem BZ (půda obsahující brilantovou zeleň). Na jednu misku budou kultivovány vzorky svaloviny, na druhou vzorky mízních uzlin, na třetí vzorky orgánů. 30