Apoptóza: metody detekce Karel Souček, Alena Vaculová Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166
analýza fragmentace DNA detekce asymetrie lipidové membrány analýza změny mitochondriálního potenciálu detekce kaspázové aktivity
Apoptóza
Nekróza vs. Apoptóza nekróza apoptóza http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/cytotech/apopto/data/chap10.htm
Apoptóza vs. nekróza Aktivace kaspáz Kondenzace buňky a organel Kondenzace chromatinu Ztráta asymetrie buněčné membrány Zachování integrity buněčné membrány Tvorba bodies a jejich fagocytóza okolními buňkami Prozánětlivé stimuly, produkce cytokinů Nabobtnání buňky a organel Ztráta asymetrie buněčné membrány Rychlá ztráta integrity buněčné membrány Vylití cytosolu do mezibuněčného prostoru (From W. Wood et al., Development 127:5245 5252, 2000. The Company of Biologists.) http://www.imcworldwide.org/cbr/l1c-m2.html
Morfologie nekróza vs. apoptóza ztráta integrity plazmatické membrány bobtnání cytoplazmy a zvětšení buňky rozbití jádra desintegrace buněčných organel kompletní lyze buňky bobtnání cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena zmenšení velikosti buňky kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu udržení integrity intracelulárních organel formace tzv. apoptotických bodies
Biochemie nekróza vs. apoptóza Bez účasti specifických molekul Pasívní proces bez dodání energie z ATP Neregulovaná destrukce jaderné DNA Není specifická role mitochondrií Ztráta regulace iontových rovnováh Aktivace specifických molekul Nutné dodání energie ve formě ATP Specifická fragmentace jaderné DNA Uvolnění specifických regulátorů z mitochondrií Změny symetrie membrán
Fyziologický význam nekróza vs. apoptóza Postihuje skupiny buněk Indukována nefyziologickými stimuly Poškození okolní tkáně vylití toxických látek Spouští zánět Týká se jednotlivých buněk Indukována fyziologickými stimuly Fagocytóza makrofágy Není zánět
Kritické body v detekci buněčné smrti in vitro vs. in vivo normální vs. nádorové populace doba trvání časového okna kdy je možné zachytit určitý znak se liší (!) u jednotlivých buněčných populací v závislosti na induktoru buněčné smrti v závislosti na konkrétním znaku který detekujeme (zvolené metodě) různé buňky ze stejné populace mohou umírat různým způsobem smrti
Detekce buněčné smrti Analýza fragmentace DNA sub G 0 /G 1 populace TUNEL
Normal Cell Cycle G 2 M G 0 DNA Analysis G 1 s C o u n t subg 0 G 1 G 0 G 1 s G 2 M - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342-7-AAD 0 200 400 600 800 1000 2N 4N DNA content Purdue University Cytometry Laboratories
Analýza subg 0 /G 1 populace
Analýza subg 0 /G 1 populace - extrakce nízkomolekulárních fragmentů pomocí citrátového pufru
Analýza subg 0 /G 1 populace výhody rychlá a levná analýza analýza možná zároveň s detekcí buněčného cyklu lze použít jakoukoliv značku vázající se na DNA limitace omezená specificita subg 0 populace je detekovatelná i u mechanicky poškozených buněk extrakce nízkomolekulárních fragmentů DNA závisí na protokolu zpracování buněk buňky umírající apoptózou z G 2 fáze je obtížné detekovat
Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dutp nick end labeling - TUNEL detekce zlomů DNA 3 -OH konec jedno- nebou dvouřetězcových zlomů je označen modifikovaným analogem báze pomocí deoxynukleotidyl transferázy vizualizace přímá (FITC-dUTP) nepřímá (AP, POD, anti-brdu Ab)
TUNEL
TUNEL výhody citlivost, specificita http://www.ihcworld.com/imagegallery/albums/userpics/10003/tunel.jpg možnost kombinace s detekcí buněčného cyklu limitace finančně a časově náročný protokol spotřeba velkého množství buněk některé druhy fixace mohou u určitých buněk vést k artefaktům Pozn. Nutnost používat 0.2-1% BSA v oplachovacích pufrech
Detekce buněčné smrti detekce asymetrie lipidové membrány
Detekce asymetrie lipidové membrány fosfatidylseriny (PS) jsou translokovány na vnější stranu membrány během časné apoptózy PS na vnější straně membrány slouží jako jeden ze signálů pro fagocyty
Detekce asymetrie lipidové membrány
Detekce asymetrie lipidové membrány pro detekci translokace PS využíváme fluorescenčně značený protein Annexin V Annexin V vytváří Ca 2+ závislou vazbu s PC v normální buňce intracelulárně kotví cytoskeletární proteiny k lipidovým membránám translokace PS je jedním z důsledků změny morfologie a modulace cytoskeletu u apoptických buněk
Detekce pomocí annexinu V R1 R2 File: K-ANX-FITC/PI Quad % Total UL 0.21 UR 21.39 LL 70.17 LR 8.23 File: CHX_50/5h-ANX-FITC/PI Quad % Total UL 1.42 UR 29.11 LL 58.43 LR 11.04
Detekce translokace PS výhody časný a specifický znak apoptózy možnost kombinace s detekcí povrchových CD antigenů limitace je nutné během analýzy odlišit mrtvé buňky není možné analyzovat fixované vzorky
Detekce buněčné smrti analýza změny mitochondriálního potenciálu
Mitochondrie, ΔΨ m a apoptóza Mitochondrie hrají důležitou roli v regulaci apoptózy klíčové regulátory jsou proteiny z Bcl-2 rodiny permeabilita mitochondriální membrány může ovlivnit uvolnění cytochromu c a aktivaci kaspáz některé proteiny z mezimebránového prostoru mitochondrií mohou indukovat apoptózu nezávislou na kaspázách (AIF, endonuclease G)
Death signal convergence onto mitochondria Baliga B., Kumar S. (2003) Cell Death Differ. 10: 16-18 Desagher S., Martinou J. C. (2000) Trends Cell Biol. 10: 369-377 Van Loo G., et al. (2002) Cell Death Differ. 9: 1031-1042
Δp = ΔΨ m - 60 ΔpH Mitochondrie a ΔΨ m Δp ~ elektrochemický protonový gradient (180mV) ΔΨ m ~ mitochondriální membránový potenciál (150mV) ΔpH ~ ph gradient Δp pohání ATP-ADP výměnu, import mitochondriálních proteinů a transport metabolitů - + - + - + Alberts, B., et. al. (2002), Molecular Biol. of the Cell
Mitochondrie, ΔΨ m a apoptóza Depolarizace mitochondriální membrány a ztráta ΔΨ m je důsledek otevření permeability transition pores (PTP) nebo narušení integrity vnější mitochondriální membrány Depolarizace mitochondrií je spojena s: ischemií/reperfúzí oxidativním stresem buněčnou smrtí
Detekce ΔΨ m elektrody radioaktivně značené próby lipofilní fluorescenční kationty Cossarizza, A. (1998), Purdue Cytometry CD-ROM Volume 3
Fluorescenční značky pro analýzu ΔΨm
Detekce ΔΨ m JC-1 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide ex./em. = 514/529 nm, monomer form; 585/590 nm J-aggregate form NIH 3T3 TMRE ex./em. = 551/576 nm tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate
NaBt TNF-α CH-11 floating: 4.8% DAPI: 2.1% floating: 12.7% DAPI: 2.6% floating: 5.7% DAPI: 3.5% floating: 16.3% DAPI: 6.0% 4.1% 47.5% 2.6% 42.4% control NaBt TNF-α CH-11 AA floating: 9.9% DAPI: 2.6% floating: 24.7% DAPI: 6.1% floating: 14.6% DAPI: 4.5% floating: 29.6% DAPI: 16.0% 3.8% 25.7% 2.8% 50.3% AA AA/NaBt AA/TNF-α AA/CH-11 DHA floating: 13.4% DAPI: 3.3% floating: 24.9% DAPI: 11.7% floating: 17.3% DAPI: 5.0% floating: 39.3% DAPI: 20.0% 5. 3% 26.3% 1.6% 53.7% DHA DHA/NaBt DHA/TNF-α DHA/CH-11 control AA DHA NaBt AA/NaBt DHA/NaBt TNF-α AA/TNF-α DHA/TNF-α CH-11 AA/CH-11 DHA/CH-11 of
HL-60 & NDGA ΔΨm 2 h 4 h 6 h Control NDGA Cytochrome c cytosol Vondracek J., Štika J, Souček et. al., Eur. J. Pharmacol. of
ΔΨm (TMRE) čas = -1 8.5 min NDGA (HBSS) NDGA/NAC (HBSS) of
NDGA (HBSS) ΔΨm (TMRE) 16 h NDGA/NAC (HBSS) 1.1% 4.6% 79.5% 14.8% 4.2% 1.3% 89.9% 4.6% 1.6% 88.6% 5.7% 4.1% 3.3% 35.8% 54.4% 6.5% Hoechst+PI Hoechst+PI
NDGA (10%BFS) ΔΨm (TMRE) 16 h NDGA/NAC (10%BFS) 0.4% 0.1% 99.0% 0.5% 0.0% 0.0% 99.9% 0.1% R1 1.2% 10.5% 83.5% 4.8% 0.6% 4.7% 93.3% 1.4% Hoechst+PI Hoechst+PI of
Možné důsledky poškození mitochondrií Matthew G. Vander and Craig B. Thompson (1999) Nature Cell Biology. 1: E209-E216
Δψm Detekce pomocí TMRE Soucek K. et al. Leuk. Res. 2006
Δψm sorting -> cell cycle re-analysis HL60/ATRA/96h ~intact population ~collapsed
Δψm sorting -> cell cycle re-analysis HL60/ATRA/TGF-β1/96h HL60/ATRA/TGF/96h ΔΨm ~ ~intact intaktni population populace (89.15%) subg0g1: 0.67% G0G1: 76.06% S: 16.12% G2M: 7.82% R1 0 40 80 120 160 200 Channels HL60/ATRA/TGF/96h subg0g1: 0.46% G0G1: 76.04% S: 13.38% G2M: 10.58% HL60/ATRA/TGF/96h ΔΨm ~collapsed ~ kolaps (10.17%) subg0g1: 0.00% G0G1: 79.02% S: 16.43% G2M: 4.55% 0 40 80 120 160 200 Channels 0 40 80 120 160 200 Channels
real-time měření ΔΨm
Detekce ΔΨ m Human Promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 nm / 1 h) NDGA (20 µm /1 h) JC-1 (2.5 µg/ml) R1 TMRE (100 nm) DiOC 6 (3) (40 nm) MitoTracker (50 nm) Rh123 (1 ng/ml)
Detekce depolarizace mitochondriální membrány real-time JC-1 Human promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 nm) TMRE DiOC 6 (3) MitoTracker Red Rh-123
Podmínky pro real-time měření ΔΨm homogenní označení buněk standardizace teploty standardizace experimentálního zásahu Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): 1022-4, 1026. http://www.cytekdev.com
Možnosti kombinace detekce ΔΨ m s dalšími parametry Vitální značení exprese CD antigenů (TMRE, translokace fosfatidyl serin V-FITC FITC) Produkce ROS (TMRE/ TMRE/DHR-123) Ca 2+ (TMRE/ TMRE/Fluo-3 ) viabilit fluorescenční ní proteiny (TMRE/ viabilita (propidium iodide, 7-AAD) (TMRE/GFP) (TMRE, CMXRos/anti-CD Ab-FITC FITC) serinů (TMRE, CMXRos/Annexin
Detekce translokace fosfatidyl serinů, ΔΨ m a viability 0.21 7.78 6.82 0.92 0.56 23.26 23.2 1.61 R1 R1 7.60 9.93 R2 46.24 39.7 R2 TMRE TMRE 2.61 7AAD negative 6.36 7AAD negative 2.61 6.46 1.54 22.6 44.95 7.63 1.37 1.02 17.33 18.97 Human promyelocytes HL-60 NDGA (20 µm M /12 h) 1 2 3 Annexin V-FITC/TMRE/7-AAD
Detekce [Ca 2+ ] i a ΔΨ m Fluo-3 AM/TMRE (HL-60/DMSO/120 h)
Detekce ROS a ΔΨ m DHR-123/TMRE Human promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 µm) NDGA (20 µm)
Kritické parametry víceparametrové vitální analýzy kvalita označení próbou kompenzace TMRE+FLUO-3 TMRE parameter - detector amp. FL1-544 FL2-434 compensation FL1-1.1%FL2 FL2-17.5%FL1 autofluorescence FLUO-3
ΔΨm výhody rychlá a nenáročná metoda snadné odlišení buněčných populací možné kombinovat s detekcí řady dalších vitálních funkcí limitace specificitu nutno potvrdit další metodou nemožnost fixace a permeabilizace
Kaspázy - Cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - Klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy) v cytoplazme, štěpení aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. death substráty a významně se tak podílet na šíření apoptotického signálu a exekuci apoptózy - struktura: - Prodoména - Katalytické podjednotky velká a malá (heterotetramer)
Activace pro-kaspáz www.rsc.org/ej/np/2001/a909080k/
Substráty kaspáz Strukturální proteiny laminy (jádro), aktin, fodrin (cytoskelet), keratin 18 (intermediární filamenta) Signální a regulační proteiny cpla2, PKC, některé proteiny rodiny Bcl-2, MEKK-1 Transkripční faktory MDM2, RB Proteiny v regulaci metabolismu DNA/RNA PARP, CAD inhibitor (inaktivace DNázy závislá na kaspázách)
Metody detekce kaspázové aktivity detekce aktivní formy kaspáz detekce aktivity pomocí syntetických selektivních substrátů analýza pomocí značených inhibitorů kaspáz (fluorochrome-labeled inhibitors of caspases (FLICA)) detekce štěpení substrátů kaspáz (PARP, CK18)
Detekce aktivní formy kaspáz
Detekce aktivní formy kaspáz Intracelulární detekce pomocí protilátek specifických pouze pro aktivní formu enzymu fixace PFA + permeabilizace
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů krátké značené peptidy nepermeabilní detekce v bunečných extraktech pomocí fluorimetru (Alexis, Roche, BD, BioVision) permeabilní detekce pomocí fluorescenční mikroskopie nebo průtokové cytometrie v intaktních buňkách (OncoImmunin, BioVision)
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v intaktních buňkách BioVision specifické permeabilní substráty (CaspGLOW) pan-specifický substrát (CASPScreen) (aspartyl)2-rhodamine 110 (D2R)
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v živých buňkách PhiPhiLux (OncoImmunin) Permeabilní pár fluorochromů kovalentně spojených linkerem (specifická substrátová sekvence) Po stěpení dochází ke změně konformace a nárůstu fluorescence buňky nelze dodatečne permeabilizovat!!! lze snadno studovat dynamiku aktivace http://www.phiphilux.com/princip1.htm
Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v intaktních buňkách výhody jednoduchý protokol u některých substrátů možnost kombinace s detekcí povrchových antigenů limity specifita, nízká toxicita a prostupnost substrátu nemožnost fixace a permeabilizace
Detekce kaspázových substrátů Poly(ADP)ribose polymerase (PARP) substrát kaspázy -3, -6 rutinní detekce fragmentů pomocí Western blotu analýza na průtokovém cytometru pomocí protilátek proti štěpeným fragmentům PARP (p25; p89)
Detekce kaspázových substrátů Cytokeratin 18 intermembránová filamenta epitheliálních buněk Substrát kaspázy-3, -6, -7, -9 detekce specifického fragmentu pomocí M30 Cytodeath protilátky http://www.peviva.se/prod/prod.php?key=m30%20cytodeath%20antibody
Protilátka M30 Cytodeath http://www.alexis-biochemicals.com/m30_cytodeath_monoclonal_antibody.5+m5f92729e270.0.html
Detekce kaspázových substrátů výhody jednoduchý protokol ~ standardní intracelulární imunodetekce na metanol fixovaných buňkách možnost kombinace s detekcí dalších intracelulárních antigenů limity kvalita protilátky buněčná specifita obtížná kombinace analýzy s detekcí povrchových antigenů nemožná kombinace s analýzou vitálních funkcí
Jakou metodu použít? více než jednu; principielně odlišnou; v závislosti na buněčném typu; a experimentálním zásahu.