anti-rna Polymerase III ELISA Kit

anti-rna Polymerase III ELISA Kit Kat. č. 7836E: 48 jamek POUZE PRO PROFESIONÁLNÍ POUŽITÍ MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F 4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi 460-0008, Japonsko Tel.: +81 52 238 1901 Fax: +81 52 238 1440 URL: http://www.mbl.co.jp

- OBSAH - Symboly 59

URČENÉ POUŽITÍ Souprava anti-rna Polymerase III ELISA je semikvantitativní enzymová imunosorpční analýza (ELISA) k detekci protilátek proti RNA polymeráze III v lidském séru. Souprava anti-rna Polymerase III ELISA je určena k diagnostickému použití in vitro jako pomůcka pro zjištění určitých autoimunitních onemocnění. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Systémová skleróza (SSc) je autoimunitní onemocnění charakterizované mikrovaskulárním poškozením a fibrózou kůže a vnitřních orgánů (1). Hlavními cíli autoprotilátkových odpovědí u pacientů se systémovou sklerózou jsou RNA polymerázy (RNAP) I, II a III. Každá z těchto RNA polymeráz katalyzuje transkripci unikátní sady genů: RNA polymeráza I (RNAP I) transkribuje geny ribozomální RNA, RNA polymeráza II (RNAP II) transkribuje všechny protein kódující geny a některé malé jaderné RNA geny a RNA polymeráza III (RNAP II) transkribuje geny, které exprimují malé stabilní RNA včetně 5S RNA a transferových RNA (2). Protilátky proti RNAP I a RNAP III jsou téměř vždy přítomné společně (anti-rnap I/III Ab) a některá séra obsahují rovněž protilátky proti RNAP II (anti-rnap II Ab) (3-5). Protilátky proti RNAP I/III jsou nejčastější u bílých severoamerických pacientů se systémovou sklerózou (6) a jsou asociované s difúzní formou systémové sklerózy, s vysokou četností renálních krizí a vysokou mortalitou (3,4,7). Navíc bylo prokázáno, že některá séra pacientů se systémovou sklerózou obsahují autoprotilátky rozpoznávající RNAP II, avšak ne RNAP I ani RNAP III. Protilátky proti RNAP II jsou rovněž přítomné v sérech některých pacientů se systémovým lupus erythematodes (SLE) nebo překryvnými syndromy (8,9). Souprava Anti-RNA Polymerase III ELISA měří metodou ELISA s vysokou citlivostí protilátky proti RNA polymeráze III přítomné v séru. PRINCIP Souprava Anti-RNA Polymerase III ELISA měří protilátky proti RNAP III přítomné v séru metodou ELISA. Sérum pacienta a naředěné kalibrátory se přidají do mikrojamek, které jsou potažené antigeny RNA polymerázy III. Protilátky proti RNA polymeráze III následně reagují s imobilizovanými antigeny (Inkubace se vzorkem). Po promytí, které odstraní veškeré nenavázané sérové proteiny, se přidá křenová peroxidáza konjugovaná s protilátkou proti lidskému IgG a inkubuje se (Inkubace s konjugátem). Po dalším kroku promytí se přidá substrát peroxidázy a inkubuje se po další dobu (Inkubace se substrátem). Poté se do každé jamky přidá kyselý roztok, aby se enzymatická reakce zastavila a ustálil se vývoj barevného produktu. Výsledek testu se kvantifikuje spektrofotometrickým měřením reakce a vynesením hodnot do grafu. STRUČNÝ POSTUP TESTOVÁNÍ <Inkubace se vzorkem> Do každé mikrojamky přidejte 100 µl naředěného vzorku (1:101). 20-30 C, 60 min Promytí 3

<Inkubace s konjugátem> Do každé jamky přidejte 100 µl konjugátu. 20-30 C, 60 min Promytí <Inkubace se substrátem> Do každé jamky přidejte 100 µl substrátu. 20-30 C, 30 min Do každé jamky přidejte 100 µl zastavovacího roztoku. Odečtěte absorbanci Interpretace výsledků REAGENCIE A SKLADOVÁNÍ 1) Mikrojamkové proužky 48-jamkové mikrojamkové proužky (6 x 8 jamek) pokryté antigenem vyráběným z rekombinantních purifikovaných proteinů a odlamovací proužky v držáku, které jsou neprodyšně uzavřené do foliového obalu se sušidlem, jsou stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 2) Kalibrátor 1 (0 U/ml) Jedna lahvička obsahující 1,5 ml rozpouštědla s 0,09% azidem sodným. Kalibrátor je připravený k použití, není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 3) Kalibrátor 2 (100 U/ml) Jedna lahvička obsahující 1,5 ml lidského séra pozitivního na protilátky proti RNA polymeráze III v rozpouštědle s 0,09% azidem sodným. Kalibrátor je připravený k použití, není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 4) Konjugát Jedna lahvička obsahující 15 ml křenové peroxidázy konjugované s kozí protilátkou proti lidskémi IgG, HEPES, Proclin 150 a BSA. Konjugát je připraven k použití. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 5) Rozpouštědlo Jedna 50ml lahvička obsahující PBS, Tween-20 a 0,09% azid sodný. Rozpouštědlo je připraveno k použití. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 4

6) Koncentrát promývacího roztoku (20x) Jedna 50ml lahvička obsahující PBS a Tween-20 ve formě 20násobného koncentrátu. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 7) Substrát Jedna 20ml lahvička obsahující směs 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin dihydrochloridu a peroxidu vodíku (TMB/H 2 O 2 ). Substrát je připraven k použití. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 8) Zastavovací roztok Jedna 20ml lahvička obsahující 1N kyselinu sírovou. Zastavovací roztok je připraven k použití. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 9) Pozitivní kontrola Jedna lahvička obsahující 1,5 ml lidského séra pozitivního na protilátky proti RNA polymeráze III v rozpouštědle s 0,09% azidem sodným. Pozitivní kontrola je připravená k použití, není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. 10) Negativní kontrola Jedna lahvička obsahující 1,5 ml rozpouštědla s 0,09% azidem sodným. Negativní kontrola je připravená k použití, není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 C až do vyznačeného data expirace. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ (1) Tento výrobek je určen pouze pro diagnostické použití in vitro. (2) Komponenty soupravy nepoužívejte po uplynutí data expirace. (3) Zamezte kontaktu reagencií s kůží, očima a oblečením. Při kontaktu reagencií s kůží je okamžitě omyjte velkým množstvím vody. TMB obsahuje dráždivou látku a zastavovací roztok obsahuje 1N kyselinu sírovou, která je jedovatá a žíravá. (4) Kalibrátor 2 a pozitivní kontrola jsou odvozené z lidského séra, v kterém nebyly detekovány antigeny hepatitidy B ani protilátky proti hepatitidě C, HIV-1 nebo HIV-2. Žádná testovací metoda však nedokáže zaručit nepřítomnost těchto ani jiných infekčních agens. S těmito reagenciemi a všemi pacientskými vzorky se musí zacházet jako s materiálem potenciálně přenášejícím AIDS, hepatitidu a jakákoli další infekční onemocnění. (5) Kalibrátor 1, kalibrátor 2, pozitivní kontrola, negativní kontrola a rozpouštědlo obsahují azid sodný (0,09 %) jako konzervační činidlo a musí se s nimi zacházet s opatrností - zabraňte požití a styku s kůží a slizničními membránami. Azid sodný může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a vytvářet výbušné azidy kovů. Při vylévání materiálů obsahujících azid sodný do odpadu je proto nezapomeňte vždy spláchnout velkým množstvím vody. (6) Některé komponenty soupravy obsahují materiály živočišného původu pocházející z neinfekčních zvířat. S těmito komponentami se však musí při jejich použití a likvidaci zacházet jako s potenciálně biologicky nebezpečným materiálem. (7) V průběhu jednoho testování se musí používat mikrojamkové proužky, konjugát, rozpouštědlo a kalibrátor 2 s odpovídajícími čísly šarží. Nikdy nepoužívejte reagencie z jiných souprav jako náhradu. 5

(8) Před zahájením testování se musí všechny reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu (20-30 C). (9) Během testování a během skladování soupravu nevystavujte přímým slunečním paprskům. (10) Zabraňte mikrobiální a křížové kontaminaci reagencií a vzorků. (11) Inkubační teploty nad a pod normální pokojovou teplotu (20-30 C), kratší nebo delší doby trvání inkubace a nepřesné ředění mohou způsobit chybné výsledky. (12) Jamky se musí důkladně proplachovat promývacím roztokem, aby se zabránilo falešným pozitivům. (13) Pipetujte opatrně, abyste zabránili napěnění vzorků a reagencií, což by mohlo způsobit křížovou kontaminaci mezi mikrojamkami. (14) Všechny mikrojamkové proužky, které nejsou právě potřebné, se musí vrátit zpět do sáčku se zipovým uzávěrem a ten opětovně pečlivě těsně uzavřít, aby se zabránilo absorpci vlhkosti. (15) Koncentrát promývacího roztoku se může při 2-8 C zakalit. To však není příčinou rozporných výsledků. (16) Vybavení použité pro testování se musí zlikvidovat nebo ošetřit tak, jak je uvedeno níže. Inkubujte ve 2% (finální koncentrace) roztoku glutaraldehydu po dobu více než 1 hodiny nebo v 0,5% chlornanu sodném (ekvivalent přibližně 5000 ppm chlóru) po dobu více než 1 hodiny nebo autoklávujte při 121 C po dobu více než 20 minut. (17) Naměřené hodnoty protilátek proti RNA polymeráze III lze použít pouze jako pomocnou informaci při diagnóze. Každý lékař musí výsledky interpretovat s ohledem na anamnézu pacienta, fyzické nálezy a výsledky dalších diagnostických postupů. POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ BALENÍ Čtečka mikrodestiček (vlnová délka: 450 nm, 620 nm / reference) Multikanálová pipeta (např. 100 µl-300 µl) Jednokanálová pipeta (např. 10 µl a 100 µl) Nádržka na reagencie Automatická myčka nebo promývačka Deionizovaná nebo destilovaná voda Jednolitrový kalibrovaný válec na přípravu promývacího roztoku Testovací zkumavky na ředění pacientských vzorků (např. 1000 µl) Jednorázové pipetovací špičky Papírové utěrky Umyvadlo a dezinfekční prostředek Kryt na mikrodestičku POSTUP PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Před použitím vytemperujte reagencie a vybavení na pokojovou teplotu (20-30 C). Mikrojamkové proužky: Vyjměte požadované mikrojamkové proužky ze sáčku a umístěte je do rámečku. Nepoužité proužky uložte ihned zpět do chladničky. Promývací roztok: Koncentrát promývacího roztoku nařeďte před použitím v poměru 1:20 (např. přidejte 50 ml koncentrátu promývacího roztoku k 950 ml destilované vody). Naředěný promývací roztok je stabilní 2 týdny při 2-8 C. 6

Kalibrátor 1, kalibrátor 2, pozitivní kontrolu, negativní kontrolu, konjugát, rozpouštědlo, substrát ani zastavovací roztok neřeďte, jsou připravené k použití. PŘÍPRAVA VZORKŮ Používejte čerstvé sérum pacienta. Pokud je zapotřebí, je možné ho zamrazit na teplotu nižší než -20 C po dobu až jednoho měsíce nebo na teplotu nižší než -70 C pro delší skladování. Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování. *V případě skladování při teplotě pod -20 C po dobu delší než 6 měsíců nebo po opakovaném zmrazování a rozmrazování jsou v důsledku denaturace IgG získávány nespecifické výsledky. Každý vzorek séra pacienta nařeďte v poměru 1:101 přidáním 10 µl séra k 1 ml rozpouštědla. *Naředěné vzorky se musí použít v průběhu jednoho dne. *Rozpouštědlo může vytvářet sraženinu. To však není příčinou rozporných výsledků. POSTUP TESTOVÁNÍ KROK 1. (INKUBACE SE VZORKEM) Za použití multikanálové pipety přeneste 100 µl kalibrátoru 1, kalibrátoru 2, pozitivní kontroly, negativní kontroly a každého naředěného vzorku do příslušných mikrojamek testovací destičky s antigenem. Kalibrátory a pozitivní ani negativní kontroly neřeďte. * Inkubace začíná napipetováním do mikrojamek potažených antigenem. Pipetování je třeba provést co možná nejrychleji. Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě (20-30 C). KROK 2. (PROMYTÍ) Odsajte a zlikvidujte obsah každé jamky. Každou jamku naplňte promývacím roztokem a poté obsah opět zcela odsajte a zlikvidujte. Promytí proveďte celkem 4krát. Zbývající promývací roztok odstraňte z destičky sklepnutím do papírové utěrky. Pokud používáte automatickou myčku, promytí proveďte celkem 4krát. * Doporučujeme, aby si každá laboratoř ověřila dobu promývání vhodnou pro přítomné vybavení. * Promývací roztok se musí používat při 20-30 C. KROK 3. (INKUBACE S KONJUGÁTEM) Roztok konjugátu nalijte do nádržky. Přidejte 100 µl konjugátu do každé jamky pomocí multikanálové pipety. Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě (20-30 C). KROK 4. (PROMYTÍ) Mikrodestičku promyjte podle postupu uvedeného v kroku 2. KROK 5. (INKUBACE SE SUBSTRÁTEM) Roztok substrátu nalijte do nádržky. Přidejte 100 µl substrátu do každé jamky pomocí multikanálové pipety. * Použijte jinou nádržku, než kterou jste použili na pipetování konjugátu. Je třeba použít novou nádržku na jedno použití, protože substrát se může snadno oxidovat kovovými ionty. * Jakmile se substrát jednou nalije do nádržky, nesmí se vracet zpět do zásobní lahve. Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě (20-30 C). KROK 6. (ZASTAVENÍ REAKCE) Zastavovací roztok nalijte do nádržky. Do každé jamky napipetujte 100 µl roztoku multikanálovou pipetou. 7

ODEČTENÍ Absorbanci každé jamky odečtěte při 450 nm. Pokud je k dispozici čtečka destiček s duální vlnovou délkou, nastavte testovací vlnovou délku na 450 nm a referenční na 620 nm. * Odečtení je třeba provést co možná nejrychleji po zastavení reakce. * Před odečtením se ujistěte, že dno destičky je čisté a suché a že na povrchu kapaliny v jamkách nejsou přítomné žádné bubliny. VÝPOČET VÝSLEDKŮ ( A 450 <vzorek> - A 450 <kalibrátor 1>) Jednotková hodnota (U/ml) = x 100 ( (A 450 <kalibrátor 2> - A 450 <kalibrátor 1>) *A 450 je zkratka hodnoty absorbance při 450 nm. *Pro protilátky proti RNA polymeráze III není k dispozici mezinárodní referenční materiál. Test je kalibrovaný na relativní arbitrární jednotky. KONTROLA KVALITY Každý výsledek testu musí splňovat následující kritéria. A 450 kalibrátoru 1: 0,100 A 450 kalibrátoru 2: 0,500 Pozitivní a negativní kontroly musí vždy poskytnout následující výsledky: Hodnota Anti-RNAP III (U/ml): Podle popisu na daném štítku. Nedosažení těchto hodnot může indikovat, že soupravu již nelze dále používat. Pokud se kterékoli z těchto kritérií nesplní, výsledky nelze použít a test se musí zopakovat. Před zopakováním testu zkontrolujte následující parametry postupu. inkubační teplota inkubační doba promytí ředění vzorků INTERPRETACE TESTU A OČEKÁVANÉ HODNOTY Následující informace jsou určeny pouze jako vodítko při interpretaci. Doporučujeme, aby si každá laboratoř stanovila vlastní kritéria pro interpretaci testu na základě populací vzorků, které běžně zpracovává. Hodnota anti-rnap III (U/ml) Interpretace < 28 Negativní na anti-rnap III Ab 28 Pozitivní na anti-rnap III Ab 8

OMEZENÍ Stejně jako u kteréhokoli jiného diagnostického testovacího postupu slouží výsledky získané pomocí soupravy Anti-RNA Polymerase III ELISA pouze jako pomůcka při diagnóze a nelze je interpretovat jako vlastní diagnostiku. FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY KLINICKÁ SPECIFICITA A SENZITIVITA Onemocnění Pozitivní vzorek Četnost pozitivů MCTD 0/10 0,0% SLE 0/20 0,0% SjS 0/27 0,0% SSc 14/40 35% CREST 2/5 40% MCTD: smíšené choroby pojiva SLE: systémový lupus erythematodes SjS: Sjögrenův syndrom SSc: systémová skleróza CREST syndrom: syndrom zahrnující kalcinózu, Raynaudův fenomén, ezofageální dysfunkci, sklerodaktylii a teleangiektázii SPOLEHLIVOST MĚŘENÍ Opakovatelnost byla demonstrována testováním 3 vzorků v 8 replikátech. Reprodukovatelnost byla stanovena testováním 3 vzorků v 5 různých dnech (day-to-day) a testováním 3 vzorků na 2 šaržích (lot-tolot). Hodnoty CV (%) reprodukovatelnosti i opakovatelnosti byly nižší než 15 % u každého vzorku. ROZSAH TESTU Rozsah metody této soupravy je od 5 U/ml do 300 U/ml. INTERFERUJÍCÍ LÁTKY Hemoglobin (až 523 mg/dl), bilirubin (až 20,9 mg/dl), chylus (až 2800 jednotek turbidity formazinu) ani revmatoidní faktor (až 500 IU/ml) nemají vliv na výsledek testu, avšak zabraňte použití vysoce hemolyzovaných vzorků nebo vysoce lipemických vzorků. LITERATURA 1. Medsger TA Jr. Systemic sclerosis (scleroderma): clinical aspects. In: Koopman WJ, editor. Arthritis and allied conditions. 13th ed. Philadelphia: Lea & Febiger; 1997. p. 1433-64. 2. Roeder RG. Nuclear RNA polymerases: role of general initiation factors and cofactors in eukaryotic transcription. Methods Enzymol 1996; 273: 165-71 3. Kuwana M, Kaburaki J, Mimori T, Tojo T, Homma M. Autoantibody reactive with Three classes of RNA polymerases in sera from patients with systemic sclerosis. J Clin Invest 1993; 91: 1399-404. 9

4. Okano Y, Steen VD, Medsger TA Jr. Autoantibody reactive with RNA polymerase III in systemic sclerosis. Ann Intern Med 1993; 119: 1005-13. 5. Hirakata M, Okano Y, Pati U, Suwa A, Medsger TA Jr, Hardin JA, et al. Identification of autoantibodies to RNA polymerase II: occurrence in systemic sclerosis and association with autoantibodies to RNA polymerase I and III. J Clin Invest 1993; 91: 2665-72. 6. Kuwana M, Okano Y, Kaburaki J, Toji T, Medsger TA Jr. Racial differences in the distribution of systemic sclerosis-related serum antinuclear antibodies. Arthritis Rheum 1994; 37: 902-6. 7. Kuwana M, Kaburaki J, Okano Y, Tojo T, Homma M. Clinical and prognostic associations based on serum antinuclear antibodies in Japanese patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum 1994; 37: 75-83. 8. Satoh M, Ajmani AK, Ogasawara T, Langdon JJ, Hirakata M,Wnag J et al. Autoantibodies to RNA polymerase II are common in systemic lupus erythematosus and overlap syndrome. J Clin Invest 1994; 94: 1981-9. 9. Satoh M, Kuwana M, Ogasawara T, Ajmani AK, Langdon JJ, Kimpel D, et al. Association of autoantibodies to topoisomerase I and the phoshorylated(iio) form of RNA polymerase II in Japanese scleroderma patients. J Immunol 1994; 153: 5838-48. 10

** Na štítku jsou použity následující symboly. K diagnostickému použití in vitro Katalogové číslo Č. šarže 48 testů Viz návod k použití Viz návod k použití dostupný na webové stránce Viz návod k použití dostupný telefonicky Datum použitelnosti Skladujte při 2 až 8 C. 11

Vyrábí Autorizovaný zástupce 12

<Komponenty ELISA soupravy> Mikrojamkové proužky Kalibrátor 1 Kalibrátor 2 Konjugát Rozpouštědlo Koncentrát promývacího pufru (20x) 13

Substrát Zastavovací roztok Pozitivní kontrola Negativní kontrola 14

Výrobce: MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F 4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi 460-0008, Japonsko Tel: +81 52 238 1901 Fax: +81 52 238 1440 Autorizovaný zástupce v EU: QARAD b.v.b.a. Cipalstraat 3, B-2440 Geel, BELGIE www.e-labeling.eu/mbl009286 +800 135 79 135 GR 00800 161 2205 7799 TR 00800 142 064 866 Revize: 27. listopadu 2014 27/11/2014 Č. 7836CE0051-1 15