DEMEDITEC Bordetella pertussis Toxin IgG ELISA Kat. č. DEBPT04 Návod k použití soupravy VÝROBCE: Demeditec Diagnostics GmbH Lise-Meitner-Straße 2 D-24145 Kiel (Germany), tel: +49 (0)431/71922-0, fax. +49 (0)431/71922-55, email: info@demeditec.de, www.demeditec.com DISTRIBUTOR: VIDIA spol.s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, Česká republika, tel.: 261 090 565, www.vidia.cz NÁZEV SOUPRAVY: DEMEDITEC Bordetella pertussis Toxin IgG ELISA je ELISA souprava pro detekci a kvantitativní stanovení lidských IgG protilátek proti Bordetella pertussis toxinu v séru a plazmě. POUŽITÍ: DEMEDITEC Bordetella pertussis Toxin ELISA je souprava určená pro detekci a kvantitativní stanovení specifických IgG protilátek proti Bordetella pertussis toxinu v séru a plazmě. Jsou možné i další aplikace v jiných tělních tekutinách a mohou být vyžádány od technické podpory DEMEDITECu. Lékařská zpráva nemůže být založena pouze na laboratorních výsledcích. Navíc je nutné brát v úvahu historii pacienta a další testy. OBECNÉ INFORMACE: Černý kašel je onemocnění dýchacích cest, které je způsobeno bakterií Bordetella pertussis. Infekce se přenáší vzduchem kapénkovou infekcí. Gramnegativní kokobacil produkuje řadu biologicky aktivních molekul. V průběhu patogeneze nebo v průběhu procesu imunizace proti dávivému kašli se objevují různé sloučeniny a také vykazují odlišné působení. Charakterizovány byly pertussis toxin (PT), filamentózní hemaglutinin (FHA) a různé lipopolysacharidy (LPS). Černý kašel je vysoce nakažlivý (míra infekce neočkovaný členů domácnosti byla stanovena více než 90%) a může způsobit vážná onemocnění, a to zejména u velmi malých dětí. V letech 1980 až 1989 bylo z 10 749 pacientů mladších jednoho roku 69% přivezeno do nemocnice, 22% trpělo zápalem plic, 0,9% vykazovalo encefalopatii a 0,6% zemřelo. U starších dětí a dospělých (včetně již očkovaných osob) mohou být infekce pozorovány nespecifikovaným zánětem průdušek nebo zánětem horních dýchacích cest. Dokonce jsou poměrně časté i asymptomatické případy. Serologická odpověď doprovázející onemocnění nebo imunizaci pertussovou vakcínou byla měřena aglutinačními testy, precipitiny, fixací komplementu a imunoenzymatickou metodou (ELISA). ELISA testy, ve kterých je Bordetella antigen (obsahující toxin, FHA a LPS a standardizován v U/mL) vázán na pevný nosič, jsou citlivé, snadno proveditelné a mohou být použity jak ke stanovení seropozitivity s jedním vzorkem séra, tak i k určení nedávné infekce Bordetellou stanovením IgM a IgA. Pertussis toxin (PT) je na rozdíl od jiných proteinů pocházejících z kmene Bordetelly vysoce specifický. PT je také součástí mnoha vakcín. Z tohoto důvodu byl vyvinut jednoduchý, rychlý a citlivý ELISA test pro detekci IgG protilátek proti Bordetella pertussis toxinu. Tento test je standardizován podle mezinárodní referenčních měřítek. PRINCIP TESTU: DEMEDITEC Bordetella pertussis toxin IgG testovací souprava je založena na principu enzymové imunoanalýzy (EIA). Antigen pertussis toxinu je předem navázán na povrch jamek mikrotitrační destičky. Zředěné sérum pacienta nebo standardy (ready-to-use) se pipetují do jamek mikrotitrační destičky. Dochází k vazbě mezi IgG protilátkami v séru a imobilizovaným Bordetella antigenem. Po 1
jedné hodině inkubace při laboratorní teplotě se destička promyje zředěným promývacím roztokem, aby se odstranil nenavázaný materiál. Pak se přidá konjugát protilátky proti lidskému IgG s peroxidázou (ready-to-use) a inkubuje se po dobu 30 minut. Po dalším promytí se pipetuje roztok se substrátem (TMB) a inkubuje se po dobu 20 minut, kdy dojde k vyvolání modré barvy v jamkách. Vývoj barvy se ukončí přidáním stop roztoku, který změní barvu z modré na žlutou. Výsledná barva se měří spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Koncentrace protilátek IgG, je přímo úměrná intenzitě barvy. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY, UPOZORNĚNÍ: Pouze k in vitro použití! Nejezte ani nepolykejte! Během testu nejezte, nepijte a nekuřte, dodržujte Správnou laboratorní praxi. Všechna séra a plazma byly testovány na přítomnost HBsAG, HIV a HCV a výsledky testů byly negativní. V průběhu testu používejte ochranné rukavice a s reagenciemi nakládejte jako s potencionálně infekčním materiálem. Rozlitá séra a roztoky musí ošetřeny dezinfekčním roztokem (např. 5% chlornanem sodným) a musí být řádně zlikvidovány. Před zahájením testu vytemperujte všechny reagencie na laboratorní teplotu (18 až 25 C). Před pipetováním opatrně všechny reagencie důkladně promíchejte jemným otáčením nebo poklepáním. Vyvarujte se vytvoření pěny silným třepáním. Pipetujte v konstantních časových intervalech, aby všechny jamky mikrotitrační destičky měly stejné podmínky. Při pipetování roztoků z lahviček je třeba dbát, aby se uzávěry nekontaminovaly a nedošlo k možnému zaměnění. Obsah lahviček je obvykle citlivý na oxidaci a lahvičky by tedy měly být otevírány pouze po krátkou dobu. Aby se zabránilo kontaminaci jednotlivých roztoků, je potřeba používat jednorázové pipetovací špičky. Všechny reagenci je potřeba používat před uplynutím exspirační doby. V souladu se Správnou laboratorní praxí nebo ISO9001 by všechny používané laboratorní přístroje měly být pravidelně kontrolovány a kalibrovány. To se týká především mikrolitrových pipet a promývacího a čtecího zařízení ELISA destiček. Zabraňte kontaktu kůže, očí a sliznic s reagenciemi především se stop roztokem a roztokem substrátu, protože mohou způsobit podráždění nebo poleptání. OBSAH SOUPRAVY: Komponenty Mikrotitrační destička potažená antigenem Bordetella pertussis toxinu Standardy s 0, 25, 50 a 150 IU/mL Konjugát enzymu Substrát Stop roztok Roztok na ředění vzorků Promývací roztok (10x koncentrovaný) Objem/množství 12x8 jamek 2 ml 15 ml 15 ml 15 ml 60 ml 60 ml Plastová fólie 2 Plastový sáček 1 2
Soupravu skladujte při 2-8 C. Exspiraci této soupravy najdete na obalu soupravy. Po použití destičku znovu uzavřete, uzávěry lahviček vyměňte a pevně uzavřete; uchovávejte při teplotě 2-8 C. Otevřená souprava by měla být použita během tří měsíců. Mikrotitrační destička 12 odlamovatelných stripů s 8 jamkami potaženými antigenem Bordetella pertussis toxinu (kmen Tohama). Připraveno k použití (ready-to-use). Standardy 4 x 2 ml, lidské sérum ředěné roztokem PBS s 0, 25, 50, a 150 IU/mL protilátky proti Bordetella pertussis toxinu. Přídavek 0,01% a methylisothiazolonu a 0,01% bromonitrodioxanu. Připraveno k použití (ready-to-use). Konjugát enzymu 15 ml, proti lidskému IgG konjugovaný s HRP (králičí), v roztoku pro proteiny. Přídavek 0,01% a methylisothiazolonu a 0,01% bromonitrodioxanu a 5 mg/ml Proclinu TM. Připraveno k použití (readyto-use). Substrát 15 ml, TMB (tetramethylbenzidin). Připraveno k použití (ready-to-use). Stop roztok 15 ml, 1N roztok kyseliny. Připraveno k použití (ready-to-use). Roztok na ředění vzorků 60 ml, PBS/BSA roztok. Přídavek 0.095 % azidu sodného. Připraveno k použití (ready-to-use). Promývaci roztok 60 ml, PBS + Tween 20, 10x koncentrovaný. Výsledná koncentrace: naředit 1 díl roztoku + 9 dílů deionizované vody. Pokud se v průběhu skladování v chladu začnou srážet krystaly, koncentrát se zahřeje se na 37 C po dobu 15 minut. Plastová fólie 2 kusy fólie na zakrytí mikrotitrační destičky během inkubace. Plastový sáček Uzavíratelný sáček na skladování nepoužitých stripů. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: 1. Multikanálové a jednokanálové pipety pro pipetování 5 μl, 100 μl a 500 μl 2. Spektrofotometr (reader) pro čtení absorbance mikrodestiček při 450 nm 3. Promývací zařízení na mikrodestičky 4. Zkumavky na ředění vzorků séra 5. Deionizovaná voda ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ: Pro stanovení může být použito sérum nebo plazma (EDTA, heparin). Sérum se oddělí srážením a centrifugací krve, která je asepticky odebrána napíchnutím žíly. Vzorky séra nebo plazmy mohou být skladovány v chladničce (2-8 C) po dobu až 7 dnů. Pro delší skladování by měla být uchovávány při - 20 C. Vzorky by neměly být opakovaně zmraženy a rozmraženy. Lipemické, hemolytické nebo bakteriálně kontaminované vzorky mohou způsobit falešně pozitivní nebo falešně negativní výsledky. Pro otestování vzorků (ne standardů) musí být vzorky ředěny 1:101 roztokem na ředění vzorků (readyto-use) (např. 5 ul séra + 500 ul roztoku na ředění vzorků). 3
PRACOVNÍ POSTUP: 1. Příprava reagencí: Promývací roztok: Před použitím nařeďte 1díl + 9 dílů deionizované vody. Pokud se v průběhu skladování v chladu začnou srážet krystaly, koncentrát se zahřeje se na 37 C po dobu 15 minut. Pro spolehlivý výsledek se doporučuje přísné dodržování protokolu. Za jakékoli změny nebo úpravy je odpovědný uživatel. Před použitím vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu, neměla by ale být ponechány při této teplotě déle, než je nezbytně nutné. Standardní křivka by měla být stanovena s každým testem. Nepoužité stripy mikrotitrační destičky vraťte do plastového sáčku a skladujete je na suchém místě při teplotě 2-8 C. 2. Pracovní postup: (1) Připravte si dostatečné množství jamek mikrotitrační destičky pro standardy, kontroly a vzorky a také i pro samotný substrát (blank). (2) Do připravených jamek mikrotitrační destičky předejte 100 µl ředěných vzorků (1:101), standardů (ready-to-use) a kontrol. Nechte jednu jamku volnou na samotný substrát (blank). (3) Zakryjte destičku přiloženou fólií a inkubujte při laboratorní teplotě 60 minut. (4) Vyprázdněte jamky destičky (vyklopením nebo odsátím) a přidejte 300 µl naředěného promývacího roztoku. Tento postup opakujte celkem třikrát. Zbytky promývacího pufru poté odstraníte jemným vyklepnutím destičky na kus látky. (5) Do každé jamky pipetujte 100 µl konjugátu (ready-to-use). Nechte jednu jamku prázdnou pro samotný substrát (blank). (6) Zakryjte destičku přiloženou fólií a inkubujte při laboratorní teplotě 30 minut. (7) Vyprázdněte jamky destičky (vyklopením nebo odsátím) a přidejte 300 µl naředěného promývacího roztoku. Tento postup opakujte celkem třikrát. Zbytky promývacího pufru poté odstraníte jemným vyklepnutím destičky na kus látky. (8) Do každé jamky pipetujte 100 µl substrátu (ready-to-use). Tentokrát pipetujte i do prázdné jamky nechané pro samotný substrát (blank). (9) Zakryjte destičku přiloženou fólií a inkubujte při laboratorní teplotě 20 minut v temnu (např. v zásuvce). (10) Pro ukončení reakce pipetujte do každé jamky 100 µl stop roztoku (ready-to-use). Pipetujte i do jamky se samotným substrátem (blank). (11) Po důkladném promíchání a otření spodní části destičky změřte absorpci při vlnové délce 450 nm (případně při referenční vlnové délce 620 nm). Zbarvení je stabilní po dobu nejméně 60 minut. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Příklad Hodnota OD Upravená OD Samotný substrát (blank) 0,020 Standard 1 (0 IU/mL) 0,030 0,010 Standard 2 (25 IU/mL) 0,507 0,487 Standard 3 (50 IU/mL) 1,531 1,511 Standard 4 (150 IU/mL) 2,492 2,472 Výše uvedená tabulka obsahuje pouze příklad, kterého bylo dosaženo v rámci náhodných teplotních podmínek a prostředí. Popsané údaje nepředstavují tedy žádné referenční hodnoty, kterých je třeba dosáhnout v jiných laboratořích stejným způsobem. 4
1. Kvalitativní vyhodnocení Vypočtené hodnoty absorpce séra pacienta, jak je uvedeno výše, jsou srovnány s hodnotou cut-off standardu (= 25 IU / ml). Pokud je hodnota vzorku vyšší, výsledek je pozitivní. Hodnoty pod cut-off ukazují na negativní výsledek. Je rozumné definovat rozsah +/-20% kolem hodnoty cut-off jako šedou zónu. V takovém případě se doporučuje opakování testu se stejným sérem nebo s novým vzorkem stejného pacienta odebraným po 2-4 týdnech. Oba vzorky by měly být měřeny paralelně ve stejném měření. Hodnota absorbance standardu 4 musí být alespoň dvakrát vyšší ve srovnání se standardem 2. 2. Kvantitativní vyhodnocení Standardy a kontroly (vše ready-to-use) soupravy Bordetella pertussis toxinu IgG jsou kalibrovány použitím retenčního postupu WHO 06/140. Jako takové jsou vyjádřeny v mezinárodních jednotkách (IU). Díky tomu je umožněno přesné a reprodukovatelné kvantitativní vyhodnocení. Proto lze kontinuálně sledovat hodnoty daného pacienta. Hodnoty pro standardy a kontroly jsou v jednotkách vytištěny na etiketách lahviček. Pro kvantitativní vyhodnocení se absorpce standardů a kontrol graficky vynese do bodového grafu (poit-to-point) proti jejich koncentraci. Ze získané referenční křivky se dle změřené absorbance odečte hodnota vzorku každého pacienta a tím se určí koncentrace v daném vzorku. Pro výpočet výsledků můžou být také použity vhodné počítačové programy. Pro proložení křivky je třeba point-topoint. Standard 2 s koncentraci 25 IU/mL slouží jako cut-off standard. Analogicky ke kvalitativnímu hodnocení je rozsah +/-20% hodnoty cut-off definován jako tzv. šedá zóna. Proto výsledky mezi 20 a 30 IU / ml jsou interpretovány jako hraniční. CHARAKTERISTIKY TESTU: Bordetella Toxin ELISA IgG IgA Opakovatelnost (intra-assay) 7,0 9,0 % 4,7 10,3 % Reprodukovatelnost (inter-assay) 7,2 11,5 % 2,7 8,7 % Přesnost mezi šaržemi (inter-lot) 4,5 15,8 % 2,0 19,0 % Analytická citlivost 0,43 IU/mL 0,48 IU/mL Recovery 101 % 105 118 % Linearita 98 124 % 69 108 % Cross-reaktivita Žádná cross-reaktivita s: Adenovirus, Parainfluenza 1/2/3 a RSV Interference Žádná cross-reaktivita s: Helicobacter, Mycoplasma a s transglutaminázou Neinterferuje s bilirubinem do 0,3 mg/ml, hemoglobinem do 8,0 mg/ml a triglyceridy do 5 mg/ml Klinická specificita 94 % 93 % Klinická citlivost 100 % 100 % 5
LITERATURA: 1. Chodorowska, M. et al. ELISA test used for serologic diagnosis of Pertussis. Med. Dosw. Microbiol., 48: 15 (1996). 2. Cherry et al.: The Epidemiology of Pertussis: A Comparison of the Epidemiology of the Disease Pertussis with the Epidemiology of Bordetella pertussis Infection. Pediatrics 115, 1422 (2005) 3. Finger, H. et al. Serological diagnosis of whooping cough. Dev. Biol. Stand., 610: 331 (1985). 4. Granström, G. et al. Specific Immunoglobulin A to bordetella pertussis antigen. J. Clin. Microbiol. 26: 869 (1988). 5. Kuno-Sakai, H. et al.: A simple and sensitive ELISA of antibodies to Pertussis antigens. Vacine 10: 350 (1992). 6. Nagel, J. et al.: Improved serodiagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis. Dev. Biol. Stand. 610: 325 (1985). 7. Reizenstein, E. et al.: Comparison of five calculation modes for antibody ELISA against Pertussis. J. Immunol. Methods 183: 279 (1995). 8. Sato, Y. et al.: An improved ELISA system for the measurement of IgG antibodies against pertussis. Dev. Biol. Stand. 73: 167 (1991). 9. Steketee, R. W. et al.: A comparison of laboratory and clinical methods for diagnosing pertussis. J. Infect. Dis. 157: 441 (1988). 10. Watanabe M. et al. : Characterization of serological responses to Pertussis ; Clinical and Vaccine Immunology 13 (3), 314 (2006). 11. Riffelmann, M. et al.: Performance of commercial enzyme linked immunosorbent assays for detection of antibodies to Bordetella pertussis, J. Clin. Microbiol. 48, 4459 (2010). 12. Wirsing von König, CH. et al.: Evaluation of a single-sample serological technique for diagnosing pertussis in unvaccinated children, J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 18, 341 (1999). 6