Mendelova genetika v příkladech Aplikace DNA markerů v mykologii a molekulárni taxonomii doc. RNDr. Michal Tomšovský, Ph.D., Ústav ochrany lesů a myslivosti, LDF MENDELU, Brno Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio CZ.1.07/2.2.00/28.0018
Co je taxonomie? Dvě pojetí: A) Taxonomie = popis, klasifikace, a kategorizace organizmů podle pravidel nomenklatury. Systematika = taxonomie + evoluční vztahy mezi organizmy + biodiverzita B) Taxonomie = Systematika Nomenklatura = soubor pravidel, jak pojmenovávat a třídit organizmy binomická nomenklatura (Linné, Systema Naturae 1758) obsažen v International Code of Nomenclature. Existují kódy nomenklatury botanické, zoologické a n. prokaryot.
Proč molekulární taxonomie? Základem klasifikace organizmu by měla být rekonstruovaná fylogeneze dané vývojové linie taxonomický systém by měl být přirozený. Podobnost Příbuznost Vodní obratlovce s hydrodynamickým tělem lze rozlišit podle anatomických znaků. U některých skupin organizmů anatomii použít nelze.
Pojetí druhu Dvě odlišné lidské kultury (domorodý národ a euroamerická vědecká komunita) rozlišují přibližně stejný počet druhů ptáků na Papue N. Guineji [Novotný V.: Papuánské (polo)pravdy 2004] Intuitivní rozlišování druhů na základě vnější podobnosti. Druh - základní taxonomická jednotka, ± přirozená Jaká kritéria se používají pro rozlišování druhů?
Kritéria pro rozlišování druhů Typologická definice druhu druh vymezen nomenklatorickým typem (typový exemplář) podle pravidel nomenklatury na základě morfologických znaků (popis morfologických znaků). Definice biologického druhu (Mayr 1982) zástupci jednoho druhu se mezi sebou pohlavně rozmnožují, zástupci jiných druhů se nerozmnožují (špatně se to zjišťuje v praxi).
Představy o evoluční historii organizmů Pojetí druhu založené na historii Původní představy byly analogické ke genealogickým Stromům šlechtických rodů.
Kladistika Přirozený systém na základě genealogické příbuznosti = kladogeneze (Hennig 1966) Kladogeneze = postupné odvětvování vývojových linií v rámci linií existujících hierarchické uspořádání taxonů do vzájemně vnořených skupin. Kladisté nepovažují přítomnost rozlišovacích znaků (anageneze evoluční novinky specifické pro nové vývojové větve) za důležité. Nevycházejí ze standardních taxonomických kategorií Kladistický druh vzniká odštěpením (speciací) a zaniká vymřením (extinkcí)
Evoluční systematika Spojuje požadavek na vývojovou příbuznost taxonů s požadavkem na přítomnost rozlišovacích znaků. Nepřípustné polyfyletické taxony, parafyletické taxony ± přípustné (nepřípustné v kladistice) Polyfyletický taxon potomci různých předků Parafyletický taxon někteří potomci jednoho předka Monofyletický taxon všichni potomci jednoho předka
Definice fylogenetického druhu Požadavek na monofyletičnost daného druhu a přítomnost diagnostického znaku (nebo kombinace více znaků) vhodného k rozlišení od jiných druhů. Fylogeneze = vznik a vývoj jednotlivých evolučních linií je předmětem fylogenetiky Nejčastější metodou fylogenetiky je analýza sekvencí DNA
Vznik nových druhů - speciace Alopatrická speciace genetické rozdíly (reprodukční izolace) mezi druhy vzniknou díky geografické bariéře. Peripatrická s. část populace druhu osídlí nově vzniklou ekologickou niku (ostrov). Parapatrická s. část populace málo pohyblivých druhů se nekříží se zbytkem populace a vzniknou genetické rozdíly - reprodukční izolace. Tento typ speciace bývá zpochybňován. Sympatrická s. nový druh se formuje na stejném území. Polyploidizační speciace u rostlin.
Molekulární znaky v taxonomii Výhody: Velké množství znaků (sekvence velkého množství genů) Sekvence různých genů bývají na sobě nezávislé. Znaky jsou často selekčně neutrální = nehrozí nebezpečí vzniku podobných znaků nepříbuzných taxonů na základě selekčního tlaku. Univerzální použitelnost a relativní dostupnost PCR a sekvenování DNA.
Molekulární znaky v taxonomii Příklady využití: 1) Testování morfologického pojetí druhu vztahy mezi variabilitou morfologickou a molekulární. 2) Testování biologického pojetí druhu míra genetické příbuznosti kryptických druhů (druhy morfologicky podobné, ale vzájemně se nerozmnožující). 3) Výzkum vzájemných vývojových vztahů dobře odlišitelných druhů podle tradičních kritérií.
Jak se pracuje s DNA? Izolace DNA z houbových buněk mechanické drcení, extrakce DNA pomocí komerčních kitů (cena cca 100 Kč = 4 Eura / vzorek). Z celkové DNA je třeba namnožit požadovaný úsek genomu. metoda PCR Polymerase Chain Reaction (= Polymerázová řetězová reakce)
Sekvenace DNA Sekvenace DNA: Zjištění pořadí nukleotidů v daném úseku DNA ATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATT DNA sekvence je užitečná pro identifikaci neznámého organizmu = DNA barcoding. Pro identifikaci organizmu na úrovni biologického druhu je třeba zvolit tzv. konzervativní oblast DNA U hub často sekvenována tzv. ITS oblast ribozomální DNA (rdna). Neznámou sekvenci DNA lze srovnat s údaji v internetové databázi GenBank pomocí webové aplikace BLAST www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html Rozvíjí se databáze UNITE (http://unite.ut.ee/)
Ribozomální DNA Různé podjednotky rdna (18S, 28S), resp. úsek mezi nimi - tzv. ITS oblast bývají často sekvenovány. Sekvence pro srovnání jsou volně přístupné na internetu www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html. 18S 5.8S 28S ITS oblast 18S (SSU) a 28S (LSU) malá a velká podjednotka jsou konzervativnější než ITS1 a ITS2. V taxonomii hub hlavně jaderná LSU (D1/D2 doména) a mitochondriální SSU
Aplikace BLAST online identifikace sekvencí http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
Aplikace BLAST online identifikace sekvencí Sekvence určena jako Heterobasidion annosum
Kódující sekvence Zpravidla se používají paralelně s ITS. Úseky obsahují exony i introny translační elongační faktor 1-alfa (EF1a;tefa) beta tubulin (tub) RNA polymeráza II, podjednotky 1 a 2 (RPB1, RPB2) glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza (GDH) mitochondriální ATP syntáza, 6 podjednotka (ATP6)
Fylogenetické stromy Diagramy znázorňující podobnost sekvencí = příbuznost zkoumaných jedinců. Různé metody zpracování stromů: Distanční metody převod sekvencí na koeficienty podobnost (např. Neighbor-joining) Znakové metody pracují s jednotlivými bázemi jako se samostatnými znaky a) Maximální parsimonie (PAUP - placený software; MEGA, PhyML - freeware). Metodicky jde o hledání nejjednoduššího řešení a preferování jednodušších hypotéz před složitějšími. b) Maximální věrohodnost - Maximum Likelihood (PAUP; PhyML freeware) c) Bayesovská analýza (Mr.Bayes - freeware)
Různé druhy fylogenetických stromů: Fylogenetické stromy Kladogram (z řec. klados = větev) je základní typ stromu, který popisuje příslušnou hypotézu o příbuznosti, aniž by řešil, kdy došlo k štěpení jednotlivých linií a do jaké míry se jednotlivé evoluční linie liší. Fylogram podává dodatečné (aditivní) informace ve formě délky větví. Délka větve tak odpovídá množství prodělaných evolučních změn. Rychlost mutací a vzniku evolučních novinek totiž není konstantní. Záleží na prostředí, délce trvání generačního intervalu a jiných faktorech. Dendrogram představuje další formu grafického znázornění kdy koncové uzly představující recentní druhy jsou ve stejné rovině (představující současnost), stejně vzdálené od společného předka. Dendrogram ( z řec. dendron = strom) popisuje průběh evolučních změn v čase, z polohy uzlů lze odečíst kdy došlo ke štěpení jednotlivých evolučních linií. Dendrogramy se pužívají při populačních studiích na vnitrodruhové úrovni Upraveno podle: http://www.zoologie.frasma.cz/fylogeneze
Spongipellis příkladová studie Fylogram ITS http://mykoweb.prf.jcu.cz/polypores/photos/spongipellis_lits chaueri1.jpg V Evropě 4 druhy. Někteří autoři nerozlišují S. litschaueri od S. delectans ITS a LSU sekvence obou druhů se liší = jsou to odlišné druhy. Vztahy mezi S. litschaueri a S. unicolor ze Severní Ameriky: V USA 2 druhy západní druh má shodnou ITS sekvenci s S. litschaueri (možná totožný druh). Východní druh = S. unicolor. Oba druhy se liší i velikostí výtrusů.
Spongipellis LSU fylogram založený na sekvencích velké podjednotky genu pro ribozomální RNA S. spumeus typový druh rodu je evolučně vzdálený od ostatních druhů rodu.
Úskalí molekulární taxonomie Molekulární metody umožňují zkoumat problematiku i biologům bez osobní zkušenosti s danou skupinou organizmů: Práce s herbářovými položkami a jiným archivovaným biologickým materiálem. Může dojít k chybné interpretaci výsledků, pokud chybí detailní znalost problematiky. Řešení: spolupráce mezi klasickými taxonomy a molekulárními fylogenetiky.
Motto na konec..skutečnost, že sýkora koňadra má v pozici 30 cytochrom C- oxidasy aminokyselinu valin, zatímco sýkora modřinka má ve stejné pozici leucin, může pomocí vhodného technického vybavení zjistit a publikovat i člověk, který se jinak v rybách vůbec nevyzná. J. Flegr, Evoluční biologie 2005 Děkuji Vám za pozornost