UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd STANOVENÍ A MONITOROVÁNÍ KARDIOMARKERŮ U AKUTNÍHO KORONÁRNÍHO SYNDROMU Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Hradec Králové 2013 Magda Kopecká
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Datum.. podpis.. Magda Kopecká Poděkování Především bych ráda poděkovala za vedení práce prof. MUDr. Jaroslavu Dršatovi, CSc. a své skvělé konzultantce MUDr. Heleně Brodské, Ph.D. za cenné rady a připomínky. Dále děkuji dr. Pavlu Žďárskému za ochotu a pomoc při formálním zpracování práce a velké díky patří i mé rodině hlavně, za její trpělivost. 2
ABSTRAKT Unverzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Autor: Kopecká Magda Studijní program: Zdravotnická bioanalytika Název práce: Stanovení a monitorování kardiomarkerů u akutního koronárního syndromu Druh práce: Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Cíl práce: Cílem práce je charakterizovat akutní koronární syndrom, poskytnout přehled základních charakteristik biomarkerů, které mají význam pro klinické užití v diagnostice a monitorování pacientů s akutním koronárním syndromem, především s akutním infarktem myokardu, podat informaci o jejich racionálním využití, objasnit možnosti a principy jednotlivých stanovení a v neposlední řadě pojednat o problematice správného ordinování požadavků na vyšetření jednotlivých kardiomarkerů. ABSTRACT Assessment and monitoring of cardio-markers in acute coronary syndrome. The aim of the thesis is to characterize an acute coronary syndrome, provide an overview of basic biomarker characteristics, which are important for clinical application in diagnostics and monitoring of patients with an acute coronary syndrome, primarily an acute heart attack, provide information about their rational utilization, clarify the possibilities and principles of particular assessments and also address the issue of proper prescription of screening claims for particular cardio-markers. 3
OBSAH 1. AKUTNÍ KORONÁRNÍ SYNDROM 1.1. Definice...8 1.2. Rozdělení..8 1.3. Infarkt myokardu.8 1.3.1. Definice infarktu myokardu.8 1.3.2. Názvosloví infarktu myokardu.9 1.3.3. Etiologie a patofyziologie infarktu myokardu.9 1.3.4. Klinický obraz a diagnostika infarktu myokardu 10 2. BIOMARKERY PRŮKAZU POŠKOZENÍ SRDEČNÍHO SVALU 2.1. Historie používaných kardiomarkerů.12 2.2. Požadavky na ideální kardiomarker...12 2.3. Charakteristika jednotlivých markerů 13 2.3.1. Aspartátaminotransferáza a laktátdehydrogenáza...13 2.3.2. Myoglobin 15 2.3.3. Kreatinkináza a její izoenzymy, izoformy CK-MB 16 2.3.4. Troponiny 19 2.3.5. Natriuretické peptidy 21 2.3.6. Jiné kardiomarkery..22 3. PRINCIPY A MOŽNOSTI STANOVENÍ 3.1. Preanalytické požadavky 25 3.2. Možnosti stanovení enzymů...27 3.2.1 Kinetické metody..27 3.2.2 Stanovení hmotnostní koncentrace 28 3.3. Chemiluminiscenční metody..29 3.4. Ultrasenzitivní metody...30 3.5. Point of care testing 31 4. MONITOROVÁNÍ AKUTNÍHO KORONÁRNÍHO SYNDROMU 4.1. Doba odezvy pro stanovení srdečních biomarkerů Turn Around Time.30 4.2. Vstupní vyšetření při podezření na akutní koronární syndrom.30 4
4.3. Potvrzení diagnózy akutního infarktu myokardu.31 4.4. Dynamika změn biochemických markerů myokardiální nekrózy...31 4.5. Časování odběrů jednotlivých kardiomarkerů.34 4.6. Doporučené postupy odběrů a realita...34 5. ZÁVĚR 6. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 5
ÚVOD Akutní koronární syndromy jsou nejčastější příčinou morbidity a mortality ve vyspělých zemích. Jde o stavy charakterizované akutní ischémií myokardu. Patofyziologickým mechanismem je uzávěr koronární tepny, který je výsledkem prasknutí nebo eroze aterosklerotického plátu. Rupturou plátu je porušen nesmáčivý povrch tepny a krev se dostává do kontaktu se strukturami, které spouštějí proces hemokoagulace. Při tomto procesu dochází k zástavě krvácení se všemi důsledky. Z aktivovaných destiček se uvolňují prokoagulační působky, aktivuje se koagulační kaskáda a výsledkem je tvorba trombinu, který přemění fibrinogen na fibrinová vlákna a ta tvoří kostru trombu, který následně uzavře koronární tepnu. Pokud trombus zcela uzavře tepnu na dobu alespoň dvaceti minut, je výsledkem nekróza akutní infarkt myokardu. Důležitým pomocníkem při stanovení diagnózy akutního infarktu myokardu jsou kardiospecifické enzymy a proteiny, které se vylučují z poškozeného myokardu do cirkulace. Koncentraci těchto látek lze stanovit v plazmě nebo v séru, případně v plné krvi postiženého. The acute coronary syndromes are the most common cause of mortality in the developed countries. These conditions are characterized by an acute ischemia of myocardium. The patho-physiologic mechanism is manifested by the closer of coronary artery, which is a consequence of a rupture or erosion of atherosclerotic plate. The plate rupture damages the water-repellent artery surface and the blood gets in contact with structures triggering the process of hemocoagulation. During this process a bleeding arrest takes place with all the consequences. The activated thrombocytes release pro-coagulation particles, and the coagulation cascade is activated, resulting in the formation of thrombin, that converts fibrinogen to fibrin fiber creating the skeleton of thrombus, which subsequently closes the coronary artery. If the artery is fully closed by thrombus for at least twenty minutes it results in a necrosis acute myocardial infarction. 6
An important help in the diagnosis of an acute myocardial infarction are the cardio specific enzymes and proteins that are discharged by the damaged myocardium into circulation. The concentration of these substances can be determined in plasma or serum, or in the complete blood of the patient. 7
1. AKUTNÍ KORONÁRNÍ SYNDROM 1.1. Definice Pojem akutní koronární syndrom je souhrnné označení pro některé formy nestabilní anginy pectoris, akutní fázi infarktu myokardu a náhlé úmrtí v důsledku akutního uzávěru věnčité tepny. (Vojáček, 1998) Společným podmiňujícím momentem je nestabilita aterosklerotického procesu koronárních tepen. (Engliš, Šochman, 2009) 1.2. Rozdělení Existuje mnoho klinických definic nestabilní anginy pectoris. Jedna z možností rozlišuje tři typy nestabilní anginy pectoris (Gazes, 1998) Progredující anginu pectoris, která je charakteristická vzrůstající frekvencí stenokardie, zhoršováním tolerance zátěže a snížením odpovědi na původně účinnou léčbu. Variantní anginu pectoris, která je způsobena lokalizovaným spazmem věnčité tepny. Protrahované stenokardie, což jsou stenokardie bez zřejmé vyvolávající příčiny trvající 20 minut a déle, ischemie může přetrvávat i desítky minut po odeznění subjektivních příznaků, u těchto nemocných je třeba vyšetřením EKG a srdečních enzymů vyloučit vznik infarktu myokardu. 1.3. Infarkt myokardu 1.3.1. Definice infarktu myokardu Dle patofyziologické definice je jako infarkt myokardu (dále IM) označována akutní ložisková ischemická nekróza srdečního svalu vzniklá na podkladě náhlého uzávěru nebo extrémního zúžení věnčité tepny, která zásobuje příslušnou oblast. Termín infarkt myokardu by měl být používán s doplňujícími údaji, které upřesňují jeho velikost. Pokud se jedná o mikroskopický IM, jde o fokální nekrózu srdečního svalu, pokud je postiženo méně než 10 % svaloviny levé komory srdeční, hovoříme o malém IM. Středně velký IM zasahuje 10 30 % a velký IM postihuje více než 30 % svaloviny levé 8
komory. Podle časových souvislostí se jako akutní IM označuje 6 hodin až 7 dnů trvání, hojící se 7 až 28 dnů a zhojený 29 dnů a více. (Špaček, Widimský, 2003) 1.3.2. Názvosloví infarktu myokardu Q-infarkt myokardu, transmurální infarkt je provázený vznikem a přetrváváním patologických kmitů Q minimálně ve dvou EKG svodech. Tento stav je doprovázený elevacemi ST na EKG, jež obvykle odráží úplný trombotický uzávěr věnčité tepny. Podle makroskopického vzhledu nekróza prostupuje téměř celou tloušťkou stěny srdečního svalu. Non-Q-infarkt myokardu, intramurální je bez rozvoje nových patologických kmitů Q. Na EKG může být jakýkoli jiný patologický nález, nejčastěji deprese ST, je zde současné zvýšení aktivity CK-MB i troponinu I nebo T. Makroskopicky nekróza zahrnuje pouze vnitřní část stěny srdečního svalu a nedosahuje až k epikardu. Mikroinfarkt, minimální myokardiální léze je charakteristická zvýšením troponinu I nebo T při normálních hodnotách aktivity CK-MB a bez čerstvých EKG změn. (ESC/ACC Redefinition of Myocardial Infarction, 2000) 1.3.3. Etiologie a patofyziologie infarktu myokardu Příčinou IM je uzávěr koronární tepny. Nejčastěji se jedná o trombotický uzávěr infarktové tepny, nasedající na nestabilní aterosklerotický plát. Mezi neovlivnitelné faktory aterosklerózy patří především věk (> 45 let u mužů, > 55 let u žen), mužské pohlaví, genetická zátěž a mezi ovlivnitelné faktory kouření cigaret, poruchy lipidového metabolismu (zvýšený LDL cholesterol, snížený HDL cholesterol), hypertenze, obezita, snížená fyzická námaha, diabetes melitus, inzulinová rezistence či porušená tolerance glukózy. Mnoho nemocných především mladších věkových skupin (< 35 let) ovšem nemá zjistitelné známky koronární aterosklerózy. Důvodem vzniku IM u těchto jedinců je protrahovaný spasmus, trombóza nebo embolie koronární tepny. Podkladem mohou být 9
zánětlivé změny, protrombotické stavy, kontuze myokardu nebo nepoměr mezi dodávkou a spotřebou kyslíku v srdečním svalu. O tom, jak veliký bude rozsah nekrózy myokardu, rozhodují faktory ovlivňující rychlost progrese nekrózy, mezi něž se řadí přítomnost kolaterál, doba trvání uzávěru koronární tepny, spotřeba kyslíku v myokardu tj. výše krevního tlaku a srdeční frekvence, reperfúzní léčba, čas do reperfúze a také předcházející opakovaná expozice myokardu ischémii. (Špaček, Widimský, 2003) 1.3.4. Klinický obraz a diagnostika akutního infarktu myokardu Nejčastějším příznakem akutního IM je bolest v oblasti sterna, která je delší než 20 minut. Postižení pociťují tlak, svírání nebo pálení. Bolest může být lokalizována i na atypických místech např. v zádech, ve spodní čelisti, v epigastriu, v krku, v levé horní končetině apod. Bolest v typickém případě vyzařuje z přední strany hrudníku do některé z výše uvedených lokalizací. Doprovodnými příznaky přibližně u poloviny nemocných jsou dušnost, nauzea až zvracení, pocení, slabost, mdloby. Příznaky mohou být mírné, atypické, vzácně i chybí. (Špaček, Widimský, 2003) Je důležité odlišit bolest na hrudi nekardiální příčiny, která může být muskuloskeletální, psychogenní, může mít původ v onemocnění gastrointestinálního traktu (např. peptický vřed, gastroezofageální reflux apod.) nebo může být plicního původu. Řada nemocných s akutním IM však bolest na hrudi nemusí pociťovat. Z těchto důvodů je v současné době kladen důraz na potvrzení diagnózy akutního IM průkazem pozitivity biochemických markerů nekrózy srdečního svalu, na zpřesňování laboratorních testů pro jejich určení a na vývoj nových markerů s vyšší senzitivitou a specifitou. V diagnostice akutního infarktu myokardu zaujímají kardiomarkery své pevné místo. Redefinice akutního infarktu myokardu vychází z průkazu: (ESC/ACC Redefinition of Myocardial Infarction, 2000) 1. Typického vzestupu a následného pozvolného poklesu nebo vzestupu a následného rychlého poklesu biochemických markerů spolu s výskytem alespoň jednoho z následujících znaků: klinické symptomy ischemie, vývoj 10
patologických kmitů Q alespoň ve dvou svodech, nové elevace ST nebo deprese ST, intervence na postižené tepně. 2. Patologicko-anatomického nálezu akutního infarktu myokardu Je nutné podotknout, že i přes pokrok v současné biochemii je konečná diagnóza infarktu myokardu především klinická. 11
2. BIOMARKERY PRŮKAZU POŠKOZENÍ SRDEČNÍHO SVALU 2.1. Historie používaných kardiomarkerů Biochemické markery poškození myokardu se v diagnostice začínají významněji uplatňovat v padesátých letech minulého století. V této době byly popsány změny aspartátaminotransferázy (dále AST) u akutního infarktu myokardu. Uvolnění AST z poškozených kardiomyocytů poprvé popsali r. 1954 Karmen a kol. Na přelomu let šedesátých se začala vyšetřovat aktivita laktátdehydrogenázy (dále LD) a kreatinkinázy (dále CK), v následujících letech byly vyvinuty metody stanovení myoglobinu a izoenzymů LD a CK. Nevýhodou stanovení AST, LD a CK je jejich malá orgánová a z ní vyplývající diagnostická specifičnost. Metoda radioimunoanalýzy ke stanovení CK, respektive izoenzymu MB frakce byla vyvinuta již v sedmdesátých letech a v osmdesátých letech představovalo stanovení MB frakce základ pro diagnostiku a odhad velikosti akutního infarktu myokardu. Nejprve byly vyvinuty metodiky na stanovení koncentrace katalytické aktivity CK a CK-MB. Přímo její skutečnou hmotnostní koncentraci bylo možno stanovit jako tzv. CK-MB mass koncem osmdesátých let a v klinické praxi v letech devadesátých. Vyšetřování CK-MB bylo dlouhou dobu zlatým standardem biochemické diagnostiky akutních koronárních syndromů. Klinická praxe ale ukázala, že stanovení CK-MB je málo nebo zcela neúčinné při určování prognostického rizika u nemocných s nestabilní anginou pectoris, u nichž dochází k ložiskovým nekrózám myokardu. V devadesátých letech se začínají uplatňovat zcela kardiospecifické a diagnosticky citlivější kardiomarkery srdeční troponiny, které se vyskytují ve strukturních bílkovinách kardiomyocytu a podle nichž se mění i klasifikace akutního infarktu myokardu. 2.2. Požadavky na ideální kardiomarker Ideální laboratorní ukazatel nekrózy myokardu by se měl nacházet v myokardu ve vysoké koncentraci, neměl by se vyskytovat v jiných tkáních ani za patologických stavů, měl by být uvolňován brzy po začátku ischemie, jeho zvyšování by mělo korelovat s rozsahem poškozené tkáně, jeho koncentrace by měla přetrvávat zvýšená po několik hodin až dnů, ne však příliš dlouho, aby byla umožněna detekce recidivy poškození myokardu. Měla by být také známá korelace mezi přítomností nebo 12
nepřítomností laboratorního ukazatele v séru a prognózou nemocných, zejména pro krátkodobé i dlouhodobé stanovení rizika u nemocných s akutním koronárním syndromem. (Zima, 2002) Tyto charakteristiky jsou ovlivňovány celou řadou faktorů: Velikostí molekuly a relativní molekulovou hmotností obecně platí, že čím menší je molekula markeru, tím rychleji je tento marker uvolňován do cirkulace, ale také je rychleji eliminován ledvinami. Lokalizací v buňce proteiny, které jsou vázány na buněčnou membránu, jsou uvolňovány rychleji, než proteiny z cytosolu. Cytozolové proteiny jsou ale uvolňovány pomaleji než kontraktilní bílkoviny, které jsou málo rozpustné. Poměrem uvolňování určuje procentuální množství proteinu uvolněného ze tkáně a nalezeného v krvi. Specifitou pro myokard významným přínosem je skupina troponinů, u nichž se specifita blíží ke 100 %. Ostatní markery mají nižší specifitu pro myokard. 2.3. Charakteristika jednotlivých markerů V současné době v biochemické laboratoři nejčastěji stanovujeme markery strukturálního postižení myokardu srdeční troponiny, myoglobin, kreatinkinázu její MB frakce a isoformy, což jsou ukazatele nekrózy myokardu a natriuretické peptidy, jako ukazatele poškození funkce myokardu. Stanovení katalytické aktivity AST, jež patřila k prvním používaným biochemickým ukazatelům akutního infarktu myokardu, dnes již není doporučováno. Celková aktivita LD je spíše používána jako nespecifický marker rozpadu buněk, např. při nádorových onemocněních a stanovení jejích izoenzymů se pro diagnostiku akutního koronárního syndromu již nepoužívá. 2.3.1. Aspartátaminotransferáza a laktátdehydrogenáza (AST, LD) AST je buněčný enzym, který se vyskytuje jak v cytoplazmě, tak v mitochondriích. Jeho molekulová hmotnost (Mr) je 93 000 Da a biologický poločas rozpadu 17 hodin. 13
Podle názvosloví ho řadíme do skupiny transferáz, přenášející dusíkaté skupiny, konkrétně aminoskupinu. Podílí se tedy na metabolizmu dusíku. Katalyzuje přenos aminoskupiny z L-aspartátu na 2-oxoglutarát za vzniku oxalacetátu a L-glutamátu. Reakce se uplatňuje při syntéze, odbourávání a přeměně aminokyselin. (Přeměňuje také L-tyrozin, L-fenylalanin a L-tryptofan). Aktivitu AST nalézáme i v séru. Do krve se dostává z běžného obratu buněk, které tento enzym obsahují. Přibližně stejná aktivita, jako je v myokardu, je v kosterním svalu. Dále se ve větším množství nachází v játrech, ledvinách pankreatu, slezině, plicích a erytrocytech. V hepatocytu je 35 % z celkové aktivity AST lokalizováno v cytoplazmě, 65 % tvoří mitochondriální izoenyzm. (Racek, 1999) Stoupá za 4 až 6 hodin po začátku ischémie, vrchol aktivity je přibližně za 1 až 2 dny a k normalizaci hodnot dochází do 5 dnů. Hladina u akutního IM může být zvýšena až 25x. Normální hodnoty jsou 0,10 0,72 ukat/l. (věk 15 110) LD je buněčný enzym vyskytující se v cytoplazmě všech buněk. Jeho Mr je 135 000 Da a biologický poločas rozpadu 110 hodin. Patří do skupiny oxidoreduktáz. Podílí se na oxidačně-redukčních dějích v organismu. Katalyzuje poslední krok anaerobní glykolýzy, kdy z pyruvátu vzniká laktát. Struktura molekuly je tvořena 4 podjednotkami o Mr 34 000. Každá z těchto podjednotek může být buď M (muscle) nebo H (heart). Celkem tedy může vzniknout 5 izoenzymů označovaných LD1 až LD5. Jednotlivé tkáně se liší poměrem jejich zastoupení. Izoenzym LD1 má podjednotkové složení H 4 (myokard a erytrocyty) LD2 má H 3 M (myokard a erytrocyty), LD3 má H 2 M (kosterní svaly), LD4 má HM 3 (játra a kosterní svaly) a LD5 má M 4 (játra a kosterní svaly). Srdeční sval obsahuje především izoenzym LD1, ten se však nachází i v erytrocytech, žaludku, ledvinách a pankreatu. Při poměru LD1/LD2 vyšším než 1 je možné zvažovat diagnózu akutního IM. Celková LD není specifická pro nekrózu myokardu. Aktivita stoupá v průměru za 10 hodin od začátku akutního IM, vrcholu dosahuje za 24 až 48 hodin, přetrvává zvýšená až 10 dnů. Normální hodnoty: ženy 2,2 3,6 ukat/l, muži 2,2 3,8 ukat/l, novorozenci 3,8 10,0 ukat/l. 14
2.3.2. Myoglobin Obr. 1 Konformace molekuly myoglobinu Zdroj: <http://www.wikiskripta.eu/index.php/biochemick%c3%a9_ukazatele_akut tn%c3%adho _infarktu_myokardu> Myoglobin je cytoplazmatický protein s nízkou Mr 17 800 Da a plazmatickým poločasem pouze 10 20 minut, je filtrován glomeruly. Je to hemoprotein nacházející se v buňkách příčně pruhovaného svalstva kosterního i srdečního. Tvoří 2 % z celkového obsahu proteinů ve svalové buňce. Myoglobin reverzibilně váže kyslík a zvyšuje jeho transport do mitochondrií, a tím hraje významnou úlohu v aerobním metabolismu buněk. Myoglobin není specifický pro srdeční sval. Zvýšené hladiny se objevují při jakémkoliv poškození kosterního svalstva, při velké svalové zátěži, při renální insuficienci. Při tkáňovém poškození je velmi rychle uvolňován do plazmy. (Racek, 1999) Vzestup sérových koncentrací u akutního IM nastupuje rychle, již 1 2 hodiny po začátku onemocnění, koncentrace kulminují během 4 10 hodin, k normě se vracejí do 24 hodin. Myoglobin je považován za nejcitlivější biochemický markerr akutního IM vhodný pro časný záchyt myokardiální nekrózy mezi 2 12 hodinou od začátku postižení. Díky rychlému a relativně krátkému vzestupu je použitý k detekci reinfarktu 15
v době, kdy přetrvává vysoká koncentrace troponinu. Vzhledem k tomu, že myoglobin není orgánově specifický, má především negativní prediktivní hodnotu. Pokud jsou hodnoty normální mezi 4. a 6. hodinou od počátku obtíží, můžeme s vysokou přesností vyloučit poškození srdečního svalu. (Aschermann, 2004) Hladiny mohou dosahovat až 20násobku fyziologických hodnot. Normální hodnoty: muži 17 105 ug/l, ženy 14 66ug/l. 2.3.3. Kreatinkináza (CK) a její izoenzymy, izoformy CK-MB Obr. 2 Prostorová struktura kreatinkinázy Zdroj: <http://www.wikiskripta.eu/index.php/biochemick%c3%a9_ukazatele_akutn%c C3%ADho_inf arktu_myokardu> CK je cytoplazmatický a mitochondriální enzym s Mr 86 000 Da a biologickým poločasem rozpadu 17 hodin. Katalyzuje fosforylaci kreatinu na kreatinfosfát pomocí ATP. Je přítomen v řadě orgánůů a tkání. Kromě srdečního svalu jej lze prokázat především v kosterních svalech, mozku, trávicím ústrojí, plicích, ledvinách, játrech, slezině a v malém množství v erytrocytech. (Špaček, Widimský, 2003) 16
CK je tvořena dvěma podjednotkami: M (muscle) a B (brain), každá o Mr 40 000 Da. Různým zastoupením podjednotek se rozlišují tři izoenzymy CK. 1. CK-MM se nachází převážně v příčně pruhovaném svalstvu kosterním a srdečním 2. CK-MB tvoří asi 40 % celkové CK v srdečním svalu (je též obsažena i v kosterním svalstvu) 3. CK-BB se nalézá ve vyšší koncentraci v mozku, placentě, prostatě, uteru a je produkována také některým typem nádorů. (Aschermann, 2004) Celková CK je nespecifickým ukazatelem poškození myokardu, je závislá na věku, rase, pohlaví a svalové hmotě. Katalytická koncentrace celkové CK se zvyšuje v průběhu 4 6 hodin po počátku ischemie, vrchol aktivity je za 18 24 hodin a k normě se vrací do 36 40 hodin Pro diagnostiku akutního IM je nutné nejméně dvojnásobné zvýšení aktivity CK. (Pudil, Tichý, 2007) Indikuje se jako pomocný marker k hodnocení dynamiky a rozsahu poškození myokardu. Normální hodnoty: muži 0,65 5,14 ukat/l, ženy 0,43 3,21 ukat/l CK-MB izoenzym kreatinkinázy je dimer tvořený řetězci M a B, je lokalizován v cytosolu svalových buněk a usnadňuje pohyb vysokoenergetických fosfátů z cytosolu do mitochondrií a zpět. (Špaček, Widimský, 2003) Tento izoenzym je specifický pro myokard, v kosterním svalstvu se nachází pouze při jeho poškození, a to ve velmi malých množstvích. Pozitivní je podíl CK-MB na celkovém zvýšení CK nad 5 %. Ke zvýšení CK-MB dochází obecně při nekróze buněk myokardu, nezávisle na příčině tohoto stavu. Proto nacházíme zvýšené hodnoty např. po chirurgickém výkonu na srdci, u myokarditid a perikarditid, při úrazech elektrickým proudem nebo při velké svalové zátěži. Při akutní ischemické nekróze kardiomyocytů dochází k vzestupu koncentrace v krvi za 3 10 hodin po začátku onemocnění, maxima dosahuje přibližně za 24 hodin a vrací se k normě do 48 72 hodin. (Friedecký, Engliš, 2007) 17
CK-MB lze stanovit jako enzymovou aktivitu nebo jako protein ve formě hmotnostní koncentrace, pak hovoříme o CK-MB mass (viz Možnosti a principy stanovení) CK-MB mass může být vhodným laboratorním markerem pro diagnostiku reinfarktu v době, kdy v krvi přetrvává vysoká koncentrace troponinů. Je možné ho použít pro diagnostiku akutního IM v případě, že nejsou k dispozici troponiny. Normální hodnoty CK-MB mass: 0,60 6,30 ug/l Izoformy CK-MB V séru se mohou vyskytovat celkem 4 izoformy CK-MB. Většinu tvoří tkáňová forma MB2 a v séru její konvertovaná forma MB1. (Aschermann, 2004) Jelikož normálně se tkáňová izoforma CK-MB vyskytuje v plazmě v minimálním množství a je rychle převáděna odštěpením lyzinu na formu plazmatickou, poskytne její stanovení v plazmě rychlejší a více senzitivní diagnostiku akutního IM než standardní stanovení CK-MB. (Špaček, Widimský, 2003) Při akutním IM množství vyplavené CK-MB2 převyšuje CK-MB1 a jejich vzájemný poměr je vyšší než 1,5 a pokud je současná koncentrace CK-MB2 nad 1,0 U/l, je tento nález vysoce specifický a senzitivní pro akutní nekrózu myokardu. Detekce těchto izoforem je možná již 3 hodiny od počátku obtíží a negativní nález v tomto období má vysokou negativní prediktivní hodnotu. (Aschermann, 2004) 18
2.3.4. Troponiny Obr. 3 Troponinový komplex Zdroj: <http://en.wikipedia.org/wiki/troponin> Troponiny jsou strukturní bílkoviny buněk příčně pruhovaného svalstva. (Engliš, Šochman, 2009) Tvoří skupinu tří proteinů C, I, T, které v reakci s tropomyozinem vytvářejí troponin- páteře tropomyozinový komplex. Tento komplex je součástí regulační a strukturální kontraktilního aparátu příčně pruhovaného svalstva. (Aschermann, 2004) Troponiny mají obecně tři izoformy, vyskytující se v kosterním svalstvu a v myokardu. V embryonálním období jsou obě formy vylučovány v obou typech tkání a v dospělosti je srdeční izoforma exprimována pouze v myokardu. (Aschermann, 2004) Troponin C (TnC) je vazebný protein pro vápníkový ion Troponin I (TnI) je kalcium-dependentní inhibitor interakce tenkých a tlustých myofilament reguluje tedy kontrakci příčně pruhovaného svalstva. Má Mr 23 876 Da, biologický poločas je menší než 120 minut. Koncentrace v myokardu je 4 6 mg, volného v cytosolu je 2,8 4,1 %. 19
Troponin T (TnT) váže TnC a TnI na tropomyozin. Jeho Mr je 37 000 Da, biologický poločas 120 minut. Koncentrace v myokardu 10,8 mg a volného v cytosolu je 6 8 %. (Engliš, Šochman, 2009) Troponiny I a T jsou základními a současně nejcitlivějšími a nejspolehlivějšími biochemickými markery akutní myokardiální nekrózy. Uvolňují se jenom z myokardu. Troponin T je sice v minimálním množství exprimován v kosterním svalu, novější metody (viz kapitola Možnosti a principy stanovení) však tuto frakci nezachycují. (Špaček, Widimský, 2003) Podle všech doposud zveřejněných mezinárodních doporučení poskytují u akutního koronárního syndromu oba troponiny v diagnostice a při stratifikaci rizika dalšího vývoje kardiovaskulárního onemocnění rovnocenné klinické informace. (Apple, 2007; Christenson, 2007; Jaffe, 2006) Při akutním IM dochází k vzestupu troponinů v periferní krvi nejdříve po 2 4 hodinách, k diagnosticky využitelnému vzestupu dochází však většinou teprve za 4 6 hodin po začátku onemocnění. Vrcholu dosahují za 12 48 hodin. Na rozdíl od jiných markerů nekrózy myokardu pokračuje postupné uvolňování troponinů z již nekrotických myofibril kardiomyocytu a podmiňuje tím trvání zvýšených koncentrací v krvi v řádu dní 7 až 14 dní, podle velikosti nekrózy. (Friedecký a kol., 2007) V této souvislosti je nutné připomenutí rozhodovacího limitu pro použití troponinů. Podle doporučení ESC/AHA je rozhodovací limit pro AIM stanoven u TnT jako tzv. hodnota cut-off a je 0,01 0,03 ug/l odpovídá 99. percentilu zdravých osob s variačním koeficientem menším než 10 % a u TnI jsou rozhodovací limity udávány výrobci jednotlivých souprav. (Pro analyzátor Beckman Coulter Accu je diagnostická hranice pro nekrózu myokardu stanovena na hodnotu 0,04 ug/l.) Hodnota diagnostické hranice nezávisí na pohlaví a u dospělých osob ani na věku. Hodnoty diagnostických hranic u dětí nejsou doposud stanoveny. 99. percentil 99. percentil hodnot referenčního souboru zdravých osob, koncentrace Tn (ug/l), která vymezuje 99 % nižších hodnot souboru. Cut-off na úrovni CV<10 % nejnižší koncentrace Tn (ug/l) stanovitelná s celkovou nepřesností CV <10 %. 20
K vzestupu troponinu mohou vést kromě myokardiální ischémie i jiná neischemická poškození buněk myokardu, např. myokarditida, perikarditida, endokarditida, rabdomyolýza, účinky toxinů hadů. Lehce zvýšené koncentrace se vyskytují při těžším renálním selhání, kdy po dialýze dochází k poklesu TnI téměř o 90 %, hladina TnT naopak po dialýze stoupá a hrozí falešná pozitivita. 2.3.5. Natriuretické peptidy Natriuretické peptidy (dále NP) jsou látky s hormonální aktivitou, které mají typickou kruhovou strukturu s postranními řetězci. Základ tvoří 17členný aminokyselinový kruh spojený disulfidickým můstkem. (Jabor, 2010) Rozlišujeme: Vlastní NP s hormonální aktivitou atriální natriuretický peptid (ANP), mozkový natriuretický peptid (BNP), natriuretický peptid typu C (CNP), dále DNP, PNP, VNP peptidy se stejnou strukturou, pocházející z vývojové linie NP Fragmenty NP NT-pro ANP, NT-pro BNP a další Ostatní látky s natriuretickou aktivitou bradykinin, dopamin, NO a další Významně zasahují do hemostázy vody a iontů, jsou produkovány v řadě orgánů. Klinicky nejvýznamnější je jejich syntéza v myokardu. Způsobují vzestup glomerulální filtrace, natriurézy a diurézy, v cévách vazodilataci. Blokují neurohumorální systém renin-angiotenzin-aldosteron, působí jako antagonisté sympatiku. V klinické praxi jsou hodnoceny jako indikátory selhávání srdce jako pumpy (bez ohledu na jeho etiologii) a jako projev aktivace jednoho ze základních neurohumorálních systémů regulace srdeční výkonnosti. (Friedecký a kol., 2007) Hlavním stimulem pro zvýšenou tvorbu a uvolňování NP do cirkulace je tlakové přetížení myocytů. (Pudil a kol., 2007) K vzestupu NP při výše zmíněném přetížení dochází řádově během desítek minut. V praxi je využíváno vyšetření BNP a NT-pro BNP. Podle dosud zveřejněných mezinárodních doporučení (Apple a kol., 2007; Christenson a kol., 2007) poskytuje 21
stanovení obou látek jak u pacientů s dominující klinickou symptomatologií dušností, tak i u nemocných s podezřením na akutní koronární syndrom rovnocenné klinické informace. Volí se spíše nižší cutt-off hodnoty pro posouzení rizika, např. 80 ng/l v případě BNP a 800 ng/l u NT-pro BNP. (Jabor, 2010) Při nálezu hladiny BNP < 100 ng/l (NT-pro BNP < 300ng/l) činí u neléčených pacientů diagnózu srdečního selhání velmi nepravděpodobnou a hodnoty BNP > 400 ng/l (NTpro BNP > 2000 ng/l) diagnózu srdečního selhání výrazně podporují. 2.3.6. Jiné kardiomarkery Mezi některé novější markery srdečního poškození lokálního a systémového zánětu řadíme: Solubilní CD40 ligand (CD40 L), což je transmembránový protein, který se vyskytuje v aktivovaných trombocytech. V destabilizovaných aterosklerotických placích je uvolňován do krve jako solubilní CD40 L. Je markerem aktuální trombogenní aktivity a může pomoci odhalit pacienty se zvýšeným rizikem trombózy a může být užitečným ukazatelem nestability aterosklerotického plátu u AKS ve spojení s markery srdeční ischemie. (Pudil, Tichý, a kol.,2007) Pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A) je glykoprotein patřící do skupiny insulinu podobných růstových faktorů. Je přítomen v lidských fibroblastech a při ruptuře nestabilního aterosklerotického plátu je uvolňován do cirkulace. Je syntetizován i v průběhu těhotenství a je především používán pro screening Downova syndromu. C-reaktivní protein (CRP/hs CRP) u nemocných s klinickou symptomatologií AKS s ischemií nebo nekrózou je vzestup koncentrace CRP především důsledkem nespecifické reakce organismu na akutní zánět. Stanovení zejména hscrp (high sensitivity C-reactive protein) má velký prognostický význam pro nemocné s AKS. 22
Koncentrace CRP při přijetí nemocného a v časné fázi onemocnění vyšší než 15 mg/l je spojena s vysokým rizikem nepříznivého vývoje onemocnění. U stabilizovaných nemocných s AKS jsou přetrvávající hodnoty nad 3 mg/l spojeny s vysokým rizikem vzniku kardiovaskulární příhody. Novější markery ischemie a nekrózy myokardu jsou: Ischemií modifikovaný albumin (IMA) stanovuje se vazebná kapacita albuminu pro kobalt. V průběhu ischemie albumin snižuje svou afinitu pro tento prvek. Diagnostická senzitivita IMA je při přijetí nemocných v časné fázi AKS vyšší než pro Tn. Vyšetření je používáno k časnému vyloučení ischemie. Volné mastné kyseliny (free fatty acids-ffa) většina sérových volných mastných kyselin je vázána na albumin, pouze male množství nenavázaných mastných kyselin je přítomno v solubilní formě. Mechanizmus zvýšení koncentrace FFA po ischemii není jasný. Zvýšená hladina je časným, ale nespecifickým ukazatelem ischemie myokardu, za 30 minut se hladina zvýší 14x. (Pudil, Tichý a kol., 2007) Glykogenfosforyláza BB (GPBB) je jedním ze tří izoenzymů vyskytujících se v lidských tkáních. (GPLL jaterní, GPMM svalový, GPBB mozek, myokard). Je to glykolytický enzym, který má roli v metabolismu cukrů. Katalyzuje první krok glykogenolýzy. V průběhu ischemie je glykogen odštěpen a GPBB konvertuje na cytoplazmatickou formu, která může po vzestupu permeability buněčné membrány přejít do cirkulace. Je to časný, ale nespecifický marker nekrózy, koncentrace stoupá 2 4 hodiny po začátku bolesti, vrcholu dosahuje za 6 20 hodin a k normě se navrací za 1 2 dny. Cholin spolu s kyselinou fosfatidovou jsou hlavním produktem štěpení fosfolipidové membrány účinkem fosfolipázy D. Aktivace tohoto enzymu je jedním z klíčových faktorů destabilizace koronárního plátu. Stanovení cholinu u nemocných se stenokardiemi významně koreluje s výskytem náhlé smrti. 23
Copeptin je peptidový hormon, chemicky příbuzný antidiuretickému hormonu (vazopresinu), skládá se z 39 aminokyselin. Pravděpodobně se účastní transportu vazopresinu do neurohypofýzy. Hladina copeptinu se prudce zvyšuje při akutním endogenním stresu v organismu. U myokardiální léze se jeho nejvyšší plazmatická hladina zvyšuje v čase vzniku symptomů, v dalším průběhu již klesá. Dle provedených studií je specifita i senzitivita copeptinu jako markeru koronární léze výborná. Negativní prediktivní hodnota při vyloučení AKS byla při současném stanovení troponinu 99,7 % a senzitivita 98,8 %. Copeptin reaguje na ischemii věnčitých tepen rychleji než troponin. Jedná se o nový a perspektivní marker, jehož stanovení společně s troponinem pomůže vyloučit s velmi vysokou pravděpodobností AKS. Uvedené markery (CD40 L, PAPP-A, choline,copeptin) mohou přispívat k časné stratifikaci vysokého rizika vývoje onemocnění. V současné době ale chybí standardizované metody jejich stanovení, informace o rozhodovacích hodnotách, doporučení pro časování odběrů. Většina metod pro stanovení těchto markerů se nachází ve fázi klinických studií a jejich uplatnění v klinické praxi je malé. 24
3. PRINCIPY A MOŽNOSTI STANOVENÍ V této části práce se budu věnovat kardiomarkerům, které se v rámci diagnostiky a monitorování akutního koronárního syndromu vyšetřují v centrální biochemické laboratoři Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky ve VFN v Praze. Jedná se o velkou rutinní laboratoř se statimovým úsekem v nepřetržitém provozu. Paleta kardiomarkerů je následující: TnI, myoglobin, BNP, CK-MB mass a CK, AST a LD jako součást komplexního vyšetření u AKS. Ke stanovení používáme automatický analyzátor Unicel DxC 880i a Unicel DxI f. Beckmann Coulter. 3.1. Preanalytické požadavky Zdroje preanalytické variability lze charakterizovat jako ovlivnění výsledků vyšetření, které se vyskytují: 1. před odběrem biologického materiálu, 2. při odběru biologického materiálu, 3. mezi odběrem a analýzou. Preanalytické vlivy jsou významné a velké množství z nich lze minimalizovat. Laboratoř je povinna zajistit jednoznačné instrukce o přípravě pacienta, odběru, transportu a skladování biologického materiálu. Tyto instrukce připravuje laboratoř ve spolupráci s klienty. (SEKK, ČLS JEP, kol. aut., 2005) Při stanovení kardiomarkerů se jako významný zdroj preanalytické variability uplatňuje hemolýza proces rozpadu erytrocytů, modifikující vzhled a složení plazmy. U hemolytického vzorku může být aktivita AST zvýšena až 40x, u LD až 160x, u CK hemoglobin interferuje svým zbarvením. Obecně je hemolýza jednou z nejčastějších příčin ovlivnění výsledku laboratorního vyšetření, která se uplatní uvolněním látek z hemolyzovaných erytrocytů i analytickou interferencí vlivem změněného zabarvení plazmy. 25
Dalším ovlivnitelným preanalytickým faktorem je fyzická aktivita. U odběrů na vyšetření AST, CK, CK-MB je fyzická zátěž nevhodná, před odběrem na BNP je doporučený klid na lůžku v trvání 20 minut. Typ primárního vzorku, druh odběrových nádobek U všech výše uvedených analytů s výjimkou BNP se doporučuje stanovení z Liheparinové plazmy (ve výjimečných případech lze použít sérum), pro BNP je požadována EDTA-plazma, Při sledování dynamiky onemocnění je nutné používat stejné typy odběru. Plazma nebo sérum se doporučuje oddělit od krvinek do dvou hodin po odběru. Stabilita vzorků Tab. 1 Stabilita vzorků při rozdílných teplotách v plazmě (SOP-ÚLBLD-VFN) analyt lab.teplota 2 8 o C 20 o C Troponin I 2 hod. 24 hod. 6 měsíců Myoglobin 8 hod. 24 hod. 4 týdny CK-MB mass 8 hod. 48 hod. 4 týdny BNP testovat ihned 4 hod. 1 rok AST 4 dny 7 dnů 12 týdnů CK 2 dny 1 týden 4 týdny LD 7 dnů 4 dny 6 týdnů Informace jsou poskytnuty výrobci souprav ke stanovení kardiálních biomarkerů klinickým laboratořím. 26
Další údaje, které musí klinické laboratoře znát: Identifikace shody souprav ke stanovení biomarkerů soupravy musí být označeny evropskou značkou shody CE, harmonizovaným symbolem IVD (in vitro diagnostika) a doplněny návodem v českém jazyce. Údaje o systému měření druhy používaných protilátek, údaje o kalibraci a kalibračním materiálu, případně o jeho návaznosti na referenční materiál, údaje o přesnosti, mezi detekce, mezi stanovitelnosti, informace o kontrolních materiálech systému vnitřní kontroly kvality. Informace o interferencích především o vlivu myších nebo jiných protilátek, fibrinogenu, ikterických, hemolytických a lipemických materiálů a koncentraci často používaných léků. Informace o rozhodovacích mezích hodnoty cutt-off pro jednotlivé markery. 3.2. Možnosti stanovení kardiospecifických enzymů 3.2.1. Kinetické metody Kinetické metody jsou založeny na měření reakční rychlosti kontinuálním měřením absorbance, sledují přírůstek nebo úbytek některého reaktantu. (Doležalová a kol., 1995) Metody jsou využívány ke stanovení katalytické koncentrace (enzymové aktivity) enzymu. Stanovení je založeno na využití substrátové specifičnosti a značné katalytické účinnosti enzymů. Jsou dostatečně citlivá a přesná, je-li zvolena vhodná koncentrace substrátu vzhledem k enzymu a vhodná metoda stanovení úbytku substrátu nebo přírůstku v čase, neboli vhodná metoda stanovení rychlosti reakce. Aby byla zajištěna srovnatelnost těchto změn v jednotlivých časových intervalech, je nutné, aby úbytek substrátu nebo přírůstek produktu v čase byl lineární, aby reakce probíhala podle kinetiky 0. řádu, s konstantní rychlostí. Při reakci 0.řádu nezávisí rychlost reakce na koncentraci reagujících látek, toho je dosaženo, když je veškerý enzym nasycen substrátem, je-li substrát v nadbytku. Pak probíhá reakce s maximální rychlostí. Pokud se měří změny absorbance NADH (nikotinamidadenidinnukleotid) v UV oblasti, tak se tyto metody označují pojmem optický test. 27
AST katalyzuje reverzibilní transaminaci L-aspartátu a alfa-ketoglutarátu na oxalacetát a L-glutamát. Oxalacetát je poté redukován na malát v přítomnosti malátdehydrogenázy za současné oxidace redukované formy NADH na NAD. Systém monitoruje rychlost změny absorbance při 340 nm. Rychlost změny absorbance je přímo úměrná aktivitě AST. LD katalyzuje reverzibilní přeměnu pyruvátu na laktát. Pyruvát je v přítomnosti NADH působením laktátdehydrogenázy redukován na laktát. Mírou aktivity LD je rychlost oxidace NADH, kterou sledujeme měřením změny absorbance. CK katalyzuje konverzi kreatinfosfátu a ADP na kreatin a ATP. Vzniklý ATP reaguje s glukózou za katalýzy hexokinázou na ADP a glukóza-6-fosfát. Katalytická koncentrace CK je vyhodnocena detekční reakcí glukóza-6-fosfátu s NADP za katalýzy glukóza-6-fosfátdehydrogenázy na NADPH a 6-fosfoglukonát. Rychlost redukce NADP na NADPH je funkcí katalytické koncentrace CK. CK-MB dříve: imunoinhibiční stanovení, kdy je pomocí specifické protilátky proti M-podjednotkám úplně inhibován izoenzym CK-MM a pouze z 50 % izoenzym CK- MB. Za předpokladu, že v séru není přítomen izoenzym BB, je aktivita CK úměrná aktivitě B podjednotek v CK-MB. Vyšetření aktivity izoenzymu CK-MB tímto způsobem může selhat v situacích, kdy je aktivita izoenzymu BB vysoká (např. u poruch centrálního nervového systému, karcinomu prostaty, plic). V tomto případě může být aktivita CK-MB vyšší, než celková aktivita CK. Řešením je stanovení hmotnostní koncentrace. 3.2.2. Stanovení hmotnostní koncentrace Tato metoda umožňuje stanovit koncentraci CK-MB v ug/l. Nedochází k interferenci CK-BB. Jedná se o tzv. stanovení CK-MB mass. V tomto případě se prokáží i částečně degradované molekuly, které enzymatickou aktivitu ztratily, reagují však dosud se specifickou protilátkou. (Racek, 1999) Principem je sendvičová enzymoimunoanalytická metoda. Jde o chemiluminiscenční stanovení. 28
Vzorek pacienta se přidá do reakční kyvety spolu s konjugátem myší monoklonální protilátky proti lidské CK-MB s alkalickou fosfatázou a paramagnetickými částicemi potaženými myší monoklonální protilátkou proti lidské CK-BB. Lidská sérová CK-MB se naváže na konjugát protilátky proti CK-MB a je imobilizována na paramagnetických částicích potažených protilátkou proti CK-BB. CK-MB v lidském séru se váže na protilátku proti CK-BB na pevné fázi, zatímco konjugát myší protilátky proti CK-MB reaguje specificky se sérovou CK-MB (s izoformami CK-MM a CK-BB nereaguje). Po inkubaci se pomocí separace v magnetickém poli a promytí odstraní látky nenavázané na pevnou fázi. Do kyvety se přidá chemiluminiscenční substrát a světlo vytvořené při reakci se měří luminometrem. Produkce světla je přímo úměrná koncentraci CK-MB ve vzorku. (f. Beckmann Coulter) 3.3. Chemiluminiscenční metody Chemiluminiscenčí metody řadíme mezi imunochemické luminiscenční metody. Jsou to optické, analytické metody založené na schopnosti látek vyzařovat viditelné světelné paprsky po ozáření ultrafialovým světlem. Tyto látky mají schopnost přeměnit část pohlcené zářivé energie na záření o jiné vlnové délce. (Karlíček a kol., 2005) Chemiluminiscence je vznik a vyzařování světla podmíněné chemickou reakcí. Excitace je způsobena energií chemických reakcí, produkty reakcí emitují při přechodu z excitovaného do základního stavu světelné kvantum. Těmito metodami stanovujeme Troponin I, myoglobin, BNP i CK-MB mass (viz výše). Jedná se o dvoukrokové sendvičové stanovení. Vzorek je přidán do reakční kyvety s konjugátem příslušné myší monoklonální protilátky s alkalickou fosfatázou a paramagnetickými částicemi potaženým monoklonální protilátkou proti stanovovanému antigenu. V další fázi se lidský antigen naváže na příslušnou protilátku na pevné fázi, zatímco konjugát myší protilátky s alkalickou fosfatázou reaguje specificky s jiným antigenním místem na molekule analytu. Po inkubaci v reakční kyvetě se látky, které se nenavázaly na pevnou fázi, odstraní separací v magnetickém poli a promytím. V druhém kroku je do reakční kyvety přidán chemiluminiscenční substrát Lumi-Phos * 530 a světlo generované při reakci je měřeno luminometrem. Produkce světla je přímo úměrná koncentraci stanovované látky ve vzorku. 29
3.4. Ultrasenzitivní metody Dominantním biochemickým markerem diagnostiky AKS jsou především srdeční troponiny. Metody stanovení troponinů používaných v klinické praxi jsou vesměs založeny na imunochemických principech. Kardiologové a kliničtí biochemikové se snaží získat co nejspolehlivější a rychlé laboratorní metody k jejich průkazu. Tyto metody spočívají ve významném zvýšení analytické senzitivity měření. To má za následek snižování hodnot rozhodovacích limitů. Jedná se o ultrasenzitivní nebo vysoce senzitivní diagnostické metody. Vývoj těchto metod lze ukázat na stanovení TnT. Začínalo se soupravami první generace, které pracovaly se dvěma monoklonálními protilátkami, jedna byla konjugována s biotinem a detekční protilátka byla konjugována s peroxidázou, ta měla ale pouze 78 % kardiospecifitu. V soupravách druhé generace již byly používány naprosto kardiospecifické monoklonální protilátky s dobou stanovení 45 minut, tyto metody a následující již pracují na principu elektrochemiluminiscence. Metody třetí generace využívaly ke standardizaci rekombinantní srdeční troponin T, čas stanovení byl 9 18 minut, u souprav čtvrté generace byla zvýšena analytická senzitivita na detekční limit (LOD) 10ng/l. LOD limit of detection, mez detekce nejnižší měřitelná koncentrace troponinů statisticky odlišitelná od nuly. Odpovídá koncentraci Tn, která se rovná dvojnásobku směrodatné odchylky, vypočtené pro průměrnou hodnotu z 20 měření kalibrátoru s nulovou koncentrací Tn. Testy páté generace jsou modifikací souprav čtvrté generace a mají významně vyšší analytickou citlivost, té bylo dosaženo zvýšením objemu vzorku z 15 na 50 ul a zvýšením koncentrace ruthenia na detekční protilátce. LOD je nižší než 5 ng/l a metoda splňuje doporučení biochemických a kardiologických společností požadovaná pro určení rozhodovacího limitu cut-off, tj. stanovení koncentrace 99. percentilu referenčních hodnot s analytickou precizností, vyjádřenou hodnotou variačního koeficientu do 10 %. (Friedecký a kol., 2010) Podobných hodnot, jako u souprav páté generace, dosahuje dnes již velká většina nových metod stanovení TnI. V současné době jsou nabízeny v ČR soupravy celkem 30
devíti producentů. Liší se nejenom rozdílností použitých protilátek a kalibrátorů, ale i rozhodovacími limity, jež musí výrobci jednotlivých souprav udávat. (Engliš a kol., 2009) Laboratoř hodnotu cut-off nezjišťuje, musí však výrobcem doporučovanou rozhodovací hodnotu v podmínkách svého pracoviště ověřovat, musí validovat metodu. (Friedecký a kol., 2008) Zavedení ultrasenzitivních metod umožňuje diagnostikovat velmi citlivé stavy předcházející AKS a u nemocných s chronickým onemocněním myokardu přispět k velmi časnému průkazu jeho poškození. 3.5. Point of care testing Point of care testing (POCT) vyšetření v místě kontaktu s pacientem. Jedná se o analytické metody, které jsou prováděny osobami bez laboratorní erudice. U testů používajících k vyhodnocení technické zařízení je nutné důkladné proškolení pracovníků, kteří budou dané zařízení obsluhovat. Je nezbytné, aby prováděli kalibrační a kontrolní činnosti přesně podle pokynů výrobce, vedli provozní deník, prováděli pravidelnou údržbu přístroje a aby uměli reagovat na případná chybová hlášení. (Zima, 2007) Jako biologických vzorků pro měření je možno použít plnou krev nebo plazmu. Postupy POCT jsou určeny hlavně pro pracovníky intenzívní kardiologické péče k usnadnění diagnostiky AIM. Měly by se používat v místech, kde nelze docílit TAT do 60 minut. V současnosti jsou komerčně dostupné systémy POCT k průkazu nekrózy myokardu: TnT, TnI, CK-MB mass, myoglobin a k identifikaci především akutního srdečního selhání BNP, NT-pro BNP, k hodnocení zánětu CRP a jako markery trombofilních stavů lze touto metodou stanovit D-dimery. 31
4. MONITOROVÁNÍ INFARKTU MYOKARDU 4.1. Doba odezvy pro stanovení srdečních biomarkerů Turn Around Time (TAT) TAT lze charakterizovat jako časový interval od ordinace vyšetření do doby sdělení výsledku, má být 60 minut. U nemocných ošetřovaných na koronárních jednotkách intenzívní péče má být maximálně do 30 minut. Uvedené požadavky na TAT vyžadují přípravu a uplatňování systému rychlého transportu, neprodleného převzetí a přednostního vyšetření materiálu laboratoří a jejich trvalou kontrolu. Vzhledem k celkovému nárůstu statimových vyšetření je obtížné tento požadavek někdy splnit, proto na mnoha pracovištích intenzívní kardiologické péče a interních příjmech již využívají výše zmíněné metody POCT. 4.2. Vstupní vyšetření při podezření na akutní koronární syndromy Vstupní vyšetření by měla být indikována jako statim nebo vitální indikace. Z kardiomarkerů se vyšetřuje TnI, CK, výběrově myoglobin a BNP. Vyšetření CK-MB mass je možné používat pro diagnostiku AIM v případě, že nejsou k dispozici Tn a může být vhodným laboratorním markerem pro diagnózu reinfarktu v době, kdy v krvi ještě přetrvává vysoká koncentrace Tn. 4.3. Potvrzení diagnózy akutního infarktu myokardu Pro potvrzení této diagnózy by měla být provedena alespoň dvě vyšetření Tn. Druhé vyšetření za 6 hodin může být stanoveno v rozmezí 3 až 9 hodin. Pro AIM by měl být patrný pokles původně zvýšené hodnoty. Elevace Tn nad 99. percentil bez dynamiky změn nebo při absenci klinických známek ischémie by měla vést k zamyšlení nad jinou diagnózou. (Kuběna, Pařenica, 2013) Při jasném, klinickém EKG a katetrizačním nálezu svědčícím pro AIM stačí pro hodnocení dynamiky a případné orientační posouzení velikosti myokardiální nekrózy jen kontrolní, levnější celkové CK. 32
Při negativním vstupním vyšetření prováděném dříve než 6 hodin od začátku obtíží, trvající diagnostické nejistotě a potřebě potvrdit nebo vyloučit AKS co nejdříve kvůli rozhodnutí o hospitalizaci nebo jiné další péči, má smysl druhé vyšetření Tn a CK provést 6 hodin od začátku obtíží a ne 6 hodin od prvního vyšetření. Počátek obtíží ne vždy znamená začátek nekrózy myokardu, a pokud trvá diagnostická nejistota, je někdy potřeba vyšetření opakovat znovu po dalších zhruba 6 hodinách. 4.4. Dynamika změn biochemických markerů myokardiální nekrózy při AIM Tab. 2 Dynamika markerů při AIM Marker nekrózy Začátek vzestupu Maximum vzestupu Trvání vzestupu v periferní krvi TnI 3 6 hod. 12 30 hod. 1 10 dní TnT 3 6 hod. 12 75 hod. 1 15 dní CK-MB mass 3 8 hod. 9 24 hod. 1 3 dny CK 3 8 hod. 8 58 hod. 1 4 dny Myoglobin 1 3 hod. 5 8 hod. < 12 hod. Zdroj: Metodický pokyn VFN MP-LPN-05 Provádění vyšetření na ÚLBLD Obr. 4 Dynamika kardiomarkerů, dosažení násobků horních referenčních mezí Zdroj: <http://okbh.centromed.cz/metody/troponint.htm> 33
(Uvolňování kardiálních markerů do krve po AIM. Počátek je definován jako okamžik výskytu symptomů. Koncentrace markerů je vyjádřena jako násobek horního referenčního limitu jednotlivých markerů.) 4.5. Časování odběrů jednotlivých kardiomarkerů Troponin odběr troponinu při podezření na AKS by měl být proveden ihned při přijetí do nemocnice a v případě negativního výsledku by měl být opakovaně stanoven za 3 až 6 hodin. CK-MB mass je shodné s časováním odběrů ke stanovení troponinu, tj. při přijetí nemocného a po 6 až 9 hodinách po přijetí. CK-MB mass dnes představuje alternativní metodu v případě, že není dostupné stanovení Tn. Nemá tedy význam stanovovat zároveň Tn a CK-MB. Myoglobin je využitelný pro časnou diagnostiku myokardiální nekrózy mezi 2. až 12. hodinou od začátku obtíží. Odběr indikujeme při přijetí nemocného a další vyšetření v intervalu 2 až 6 hodin po začátku onemocnění. Stanovení po 12. hodině po začátku onemocnění již nemá význam. Díky rychlému a relativně krátkému vzestupu je použitelný k detekci reinfarktu v době, kdy přetrvává vysoká koncentrace Tn. BNP u nemocných, u kterých dominuje dušnost, se provádí odběr při příjmu, výsledek přispívá k odlišení kardiální a mimokardiální dušnosti. U nemocných s podezřením na AKS je doporučena doba odběru 2. až 3 den po přijetí a kontrolní vyšetření s odstupem 1. až 2. týdnů. Jednoznačná indikace je podezření na dekompenzované srdeční selhání, které se nedaří jinak potvrdit nebo vyloučit. Vzhledem k tomu, že je vyšetření BNP relativně drahé a v ambulantní praxi je u jednoho nemocného hrazeno jen 2x ročně z indikace kardiologa, měly by být ordinace vyšetření uvážlivé. 4.6. Doporučené postupy a realita Od roku 2010 dosud platí ve VFN doporučení na biochemická vyšetření při akutních koronárních syndromech i myokardiální nekróze jiné etiologie nebo při podezření na tyto stavy. Toto doporučení bylo vydané náměstkyní pro LP ve spolupráci s kardiology, 34