MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta ANTIMUTAGENNÍ AKTIVITA OBSAHOVÝCH LÁTEK V ZELENINĚ A V OVOCI. Disertační práce. Školitel disertační práce:

MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta ANTIMUTAGENNÍ AKTIVITA OBSAHOVÝCH LÁTEK V ZELENINĚ A V OVOCI Disertační práce Školitel disertační práce: RNDr. Jiří Totušek, CSc. Vypracovala: Mgr. Lucie Mandelová Brno 2006

Poděkování: Děkuji RNDr. J. Totuškovi, CSc. za odborné vedení, ochotu, vstřícnost, konzultace a cenné rady při vypracování této disertační práce. Dále děkuji pracovníkům farmakologického ústavu za pomoc při práci s experimentálními zvířaty. Mgr. Lucie Mandelová

OBSAH 1 Úvod...5 1.1 Nutričně významné složky zeleniny a ovoce...7 1.2 Polyfenoly...12 1.2.1 Dělení polyfenolů...12 1.2.1.1 Fenolové kyseliny...13 1.2.1.2 Flavonoidy...14 1.2.1.2.1 Dělení flavonoidů...15 1.2.1.2.1.1 Flavonoly...15 1.2.1.2.1.2 Flavony...16 1.2.1.2.1.3 Isoflavony...17 1.2.1.2.1.4 Flavanony...18 1.2.1.2.1.5 Anthokyanidiny...19 1.2.1.2.1.6 Flavanoly...20 1.2.1.3 Stilbeny...21 1.2.1.4 Lignany...22 1.2.2 Obsah polyfenolů ve stravě...22 1.2.3 Příjem polyfenolů...25 1.2.4 Metabolismus polyfenolů...26 1.2.4.1 Absorpce...26 1.2.4.2 Metabolizace...29 1.2.4.3 Biologická využitelnost...30 1.2.4.4 Eliminace...32 1.2.5 Biologické účinky polyfenolů...33 1.2.5.1 Antioxidační účinky...34 1.2.5.2 Estrogenní účinky...37 1.2.5.3 Vliv na endoteliální funkce...39 1.2.5.4 Angiogenní účinky...40 1.2.5.5 Protizánětlivé účinky...40 1.2.5.6 Imunomodulační účinky...41 1.2.5.7 Antimutagenní a antikarcinogenní účinky...42 1.2.5.7.1 Indukce detoxikačních enzymů...44 1.2.5.8 Negativní vlastnosti polyfenolů...49 1.3 Glukosinoláty...50 1.3.1 Biosyntéza glukosinolátů...50 1.3.2 Struktura glukosinolátů...51 1.3.3 Dělení glukosinolátů...53 1.3.4 Výskyt glukosinolátů...54 1.3.5 Enzymatické změny glukosinolátů...57 1.3.6 Vliv vnějších podmínek na přeměnu glukosinolátů...59 1.3.7 Příjem glukosinolátů...61 1.3.8 Metabolismus isothiokyanátů...62 1.3.9 Biologické účinky glukosinolátů a jejich rozkladných produktů...64 1.3.9.1 Antibakteriální účinky...64 1.3.9.2 Antioxidační účinky...64 1.3.9.3 Chemopreventivní účinky...65 1.3.9.3.1 Vliv na metabolismus detoxikačních enzymů...66

1.3.9.3.2 Inhibice buněčného růstu a indukce apoptózy...69 1.3.9.4 Estrogenní účinky...71 1.3.9.5 Negativní vlastnosti...72 1.4 Výběr mutagenů...74 1.4.1 Heterocyklické aminy...74 1.4.2 Nitrososloučeniny...75 2 Cíle práce...77 2.1 Dílčí úkoly...77 3 Materiál a metody...78 3.1 Mikronukleus test in vivo...78 3.1.1 Roztoky, činidla a média...79 3.1.2 Uspořádání pokusů...80 3.1.2.1 Experiment č. 1...81 3.1.2.2 Experiment č. 2...82 3.1.2.3 Experiment č. 3...84 3.1.3 Zpracování a statistické vyhodnocení dat...87 3.2 Chemiluminometrické měření fagocytární aktivity myších leukocytů...89 3.2.1 Roztoky, činidla a média...89 3.2.2 Uspořádání pokusů...90 3.2.3 Zpracování a statistické vyhodnocení dat...90 3.3 Stanovení počtu leukocytů a diferenciálního krevního obrazu myší...92 3.3.1 Uspořádání pokusů...92 4 Výsledky...93 4.1 Hodnocení antimutagenního účinku sulforafanu a jeho vlivu na imunitní odpověď u myší...93 4.2 Hodnocení antimutagenního účinku indol-3-karbinolu a jeho vlivu na imunitní odpověď u myší...98 4.3 Hodnocení antimutagenní aktivity brokolicové šťávy ošetřené vysokým tlakem...107 5 Diskuze...110 6 Závěr...125 7 Souhrn...127 Summary...129 8 Seznam použité literatury...131 9 Seznam publikovaných prací a prací přijatých k publikaci...162 10 Seznam použitých zkratek...164 11 Přílohy...166

1 Úvod Rakovina je obecný pojem pro multifaktoriálně podmíněné onemocnění. V ekonomicky vyspělých zemích představuje druhou nejčastější příčinu smrti. Příčinami nádorového onemocnění jsou genetické faktory, kterým lze však přisuzovat pouze malý podíl na vznik tohoto onemocnění. Rozhodující jsou většinou faktory zevního prostředí, kterým je organismus člověka vystaven. Strava a životní styl jedince jsou jedny z nejvýznamnějších zevních činitelů, které se podílí až z 90 % na vzniku nádorového onemocnění. Strava představuje jednu z nejsložitějších komplexních směsí prostředí. Odhaduje se, že přibližně 35 % všech případů nádorového onemocnění může být ovlivněno stravou a ta tak hraje důležitou roli v etiologii a v prevenci vzniku nádorů. Nejvíce, až z 90 % lze stravou zabránit především nádorům trávicího traktu (jícen, žaludek, tlusté střevo a rektum). Otázkou zůstává, které z faktorů stravy jsou nejvíce vztaženy k prevenci rakovinného onemocnění, jakými mechanismy tyto faktory působí, jak mohou interferovat s procesem karcinogeneze a jaké preventivní kroky by měly být podstoupeny k minimalizaci nežádoucích účinků těchto faktorů, které naopak riziko vzniku nádorového onemocnění zvyšují. Vznik nádorů podporují zejména životní prostředí, životní styl, výživa, technologická resp. kulinární úprava stravy. Toto všechno může negativně ovlivňovat proces karcinogeneze. Negativně působí nadměrný přívod energie, tuků, soli, alkoholu a naopak nedostatečný příjem ochranných faktorů, které jsou zastoupeny především v ovoci a zelenině. Výsledky mnoha studií prokazují, že ovoce a zelenina obsahuje velké množství biologicky aktivních látek, které jsou schopné snižovat riziko vzniku nádorového onemocnění a dalších tzv. civilizačních chorob. Je prokázáno, že v zemích s nízkou spotřebou ovoce a zeleniny je úmrtnost na rakovinu daleko vyšší ve srovnání se zeměmi, kde je spotřeba ovoce a zeleniny vyšší. Tyto látky se také zapojují do biochemických procesů a jsou účinnými pomocníky imunitního systému. Bojují s reaktivními formami kyslíku, jejichž tvorbu v organismu podporuje mimo jiné kouření, nadměrná konzumace alkoholu, znečištěné životní prostředí a mnoho dalších faktorů. Většinou se jedná o působení komplexní směsi látek, mezi kterými dochází ke vzájemným interakcím, čímž je ovlivněn jejich účinek. Často je velmi obtížné či nemožné posoudit toxické resp. genotoxické působení směsi chemických sloučenin na základě znalostí o toxicitě jednotlivých látek. 5

Ve stravě se kromě látek s protektivními účinky nacházejí také cizorodé látky, které naopak riziko vzniku rakoviny zvyšují. Záleží pak na mnoha dalších podmínkách (např. na příjmu protektivních látek ze stravy), jak se příjem těchto látek uplatní ve výsledném účinku. Výzkumy se v několika posledních desetiletích zaměřují na identifikace jednotlivých obsahových složek především v ovoci a zelenině a na jejich roli ve fyziologických a patologických procesech. Výzkumy jsou rovněž směřovány na získávání informací o biologické využitelnosti a farmakokinetice, bez jejichž pochopení jsou doposud získané teoretické poznatky nedostačující. Předmětem této disertační práce je výzkum antimutagenních účinků vybraných obsahových látek ze zeleniny rodu Brassicaceae a také působení komplexní směsi těchto látek. 6

1.1 Nutričně významné složky zeleniny a ovoce Výživa hraje velmi podstatnou roli v etiologii a v prevenci nádorového onemocnění (Greenwald et al., 2001). V rostlinné stravě (ořechy, obiloviny, luštěniny, zelenina a ovoce) bylo identifikováno tisíce biologicky aktivních sloučenin. Zelenina a ovoce jsou botanicky nejrozmanitější a mají velký potenciál přispívat svoji rozličností a komplexností k prevenci řady onemocnění (Lampe, 1999). Ovoce a zelenina obsahují škálu chemicky různorodých látek, které vstupují rozličnými mechanismy do procesu karcinogeneze, inhibují jej nebo v ideálním případě zastavují. Často tyto látky působí příznivě i proti vývoji kardiovaskulárních nemocí a dalších tzv. civilizačních chorob (Weisburger, 2000; Kalač, 2001). Ve většině studií je zvýšený příjem zeleniny a ovoce spojen s nižším rizikem nádorového onemocnění. Jedná se především o nádory plic, dutiny ústní, jícnu, žaludku a tlustého střeva (Park a Pezzuto, 2002). Méně jednoznačné výsledky platí pro hormonálně ovlivněné nádory (prs, prostata) (Fiala, 2004). Výsledky studií vedly vědce ke snaze izolovat nutričně významné složky, které se nacházejí v zelenině a ovoci a ty poté aplikovat ve farmakologických dávkách. Podávání izolovaných látek však může v některých případech, zejména ve vyšších dávkách vést k nepříznivým účinkům. To může poukazovat na fakt, že aplikace izolované látky může představovat pouze prostředníka nebo může poukazovat na jinou živinu nebo kombinaci živin, které jsou účinné. V současnosti není zcela jasné, které z nutričně významných látek působí nejvíce protektivně proti nádorovému onemocnění, neboť zelenina a ovoce představují komplexní směs, která obsahuje velké množství potencionálně prospěšných látek, zahrnující vitaminy, minerální látky, vlákninu a biologicky aktivní složky (karotenoidy, flavonoidy, steroly, fenoly, isothiokyanáty, indoly aj.) (viz tab.1.) (Kim, 2001; Fiala, 2004). Mechanismy, kterými obsahové látky zeleniny a ovoce mohou snižovat výskyt rakoviny jsou složité a komplexní a většinou představují inhibici některé z fází procesu karcinogeneze (Park a Pezzuto, 2002). Mohou zahrnovat indukci detoxikačních enzymů, inhibici tvorby nitrosaminů, zabezpečení složek pro tvorbu protinádorových látek, zředění a vazbu karcinogenních látek v trávicím traktu na vlákninu, alteraci metabolismu hormonálních látek, antioxidační, protizánětlivé, imunomodulační a jiné účinky (Kim, 2001). 7

Tab. 1. Možné antikarcinogenní látky obsažené v ovoci a zelenině (Kim, 2001) Karotenoidy Askorbát Tokoferoly Selén Kyselina listová Vláknina Dithiothiony Glukosinoláty/indoly Isothiokyanáty/thiokyanáty Sloučeniny allia (allicin a allyldisulfidy) Rostlinné steroly Isoflavony Inhibitory proteáz Kumariny Dosavadní poznatky o roli ovoce a zeleniny vyústily v doporučení jíst alespoň pět porcí ovoce (2 porce) a zeleniny (3 porce) denně, což odpovídá doporučení dle Světové zdravotnické organizace (WHO) 400 gramů denně (s výjimkou brambor). Je třeba si uvědomit, že preventivní působení složek ovoce a zeleniny je zřejmě komplexní a vzájemně se prolíná a těžko může být nahrazeno aplikací izolovaných látek (Kalač, 2001). Běžně konzumovaná strava, především však zelenina a ovoce jsou zdrojem mnoha mikronutrientů. Některé z nich, např. β-karoten (prekurzor vitaminu A), vitamin E, vitamin C a selen, vykazují antioxidační vlastnosti, a také vápník, vitamin D a kyselina listová jsou předmětem experimentálních a epidemiologických výzkumů sloužících ke zjištění jejich vlivu na riziko nádorového onemocnění. Např. strava bohatá na ovoce a zeleninu, tedy na příjem β-karotenu vykazuje inverzní vztah k rakovině plic. Nicméně izolované podávání β-karotenu může vést naopak ke zvýšenému riziku rakoviny plic. Zdá se tedy, že β-karoten je pouze jakýmsi markerem pro jiné sloučeniny obsažené v zelenině a ovoci, které mohou inhibovat proces karcinogeneze (Greenwald et al., 2001). Podobně nekonzistentní důkazy platí i pro vitamin E. V některých studiích vede jejich podávání ke sníženému riziku rakoviny plic a děložního hrdla, v jiných naopak vůbec nesnižuje riziko rakoviny plic. Nicméně existují studie, které zkoumají vztah vitaminu E k riziku vzniku rakoviny prostaty u kuřáků a výsledky naznačují, že derivát vitaminu E, vitamin E sukcinát může fungovat jako spouštěč buněčné apoptózy u lidských prostatických buněk v pokusech in vitro (Israel et al., 2000). Strava bohatá na vitamin C, opět tedy na ovoce a zeleninu, pravděpodobně snižuje riziko rakoviny žaludku a snad i rakoviny dutiny ústní, hltanu, jícnu, plic, slinivky břišní 8

a děložního hrdla. Toto bylo prokázáno v pokusech s vysokým a nízkým příjmem vitaminu C (Greenwald et al., 2001). Epidemiologické a experimentální studie naznačují, že vitamin D a vápník může ovlivňovat riziko kolorektálního karcinomu a rakoviny prostaty. Nicméně mnohé z nich naznačují slabý vztah mezi příjmem vápníku a kolorektálním karcinomem a výsledky nejsou přesvědčivé (Greenwald et al., 2002). Vláknina a strava bohatá na vlákninu (ovoce, zelenina, cereálie, obilniny) by mohla dle epidemiologických studií také snižovat riziko vzniku rakoviny tlustého střeva a prsu. Výsledky studií však také nejsou zcela jednoznačné. Vláknina může ovlivňovat rakovinu tlustého střeva několika mechanismy, které zahrnují zvýšení obsahu stolice a tím naředění karcinogenních látek, prodloužení tranzitního času tlustým střevem, což vede ke snížení interakcí karcinogenů se sliznicí střeva, přímou vazbu karcinogenních látek, změny enzymatické aktivity intestinální mikrobiální flóry a tím snížení koncentrace sekundárních žlučových kyselin, produkci mastných kyselin s krátkým řetězcem pomocí fermentace, které mohou inhibovat proces karcinogeneze změnou ph tlustého střeva a zvýšenou dostupností butyrátu. Butyrát je zodpovědný za zastavení růstu (indukcí cyklin dependentních inhibitorů kinázy), dělení a apoptózu nádorových buněk tlustého střeva a prsu (Greenwald et al., 2001; Kim, 2001). Výsledky in vitro studií potvrzují, že některé mikronutrienty, vykazující antioxidační vlastnosti, a tedy ochranu proti oxidačnímu poškození biomolekul, jako jsou lipidy, lipoproteiny a DNA, také ovlivňují proces karcinogeneze. Selén je součástí selenoproteinů (např. glutathion peroxidázy, thioredoxin reduktázy), které fungují jako enzymy, které mohou ovlivňovat riziko rakoviny. Některé kohortové studie poukazují na inverzní vztah mezi konzumací selenu a rakovinou plic a prostaty. Experimenty na zvířecích modelech demonstrují, že selén může proces karcinogeneze inhibovat. Antioxidační mikronutrienty mohou ovlivňovat tento proces také jinými mechanismy. Např. vitamin E inhibuje buněčnou proliferaci, karotenoidy buněčnou transformaci a dělení, zlepšují buněčnou komunikaci a imunitní odpověď. Vápník a vitamin D snižují buněčnou proliferaci (Greenwald et al., 2001). Dále existuje velká skupina látek, označována v zahraniční literatuře jako fytochemikálie. Jedná se o širokou skupinu biologicky aktivních látek, zahrnujících tisíce chemicky rozličných sloučenin. Mnohé z nich jsou zkoumány v laboratorních experimentech pro jejich potenciální schopnosti ovlivnit proces karcinogeneze a ve snaze odhalit mechanismu tohoto účinku. Nicméně aplikovatelnost výsledků 9

experimentálních studií ze zvířat na člověka není přímočará, neboť lidé konzumují stravu jako komplexní směs mnoha biologicky aktivních sloučenin a dalších látek, které na sebe navzájem působí. Kvantifikovat příjem těchto látek ve stravě je také značný problém. Neznáme přesné složení všech dostupných potraviny ani podíl jednotlivých biologicky aktivních látek. Nejsou ani známé spolehlivé biomarkery jejich příjmu. Proto jsou někdy výsledky studií zkoumajících vztah nádorového onemocnění a příjmu biologicky aktivních látek obtížně interpretovatelné (Greenwald et al., 2001). Existují také problémy se srovnáváním účinné expozice v experimentálních studiích a příjmem těchto látek u lidí (Dragsted et al., 1997; Lampe, 1999). V tab. 2. uvádím vybrané biologicky aktivní sloučeniny s příklady nejčastěji zastoupených látek, potravními zdroji a jejich možnými chemopreventivními vlastnostmi. Vzhledem k širokému zastoupení biologicky aktivních látek v zelenině a ovoci není možné uvést zde jejich podrobný popis, a tak bych se ráda v dalších částech disertační práce zaměřila na dvě významné skupiny látek, kterým je v posledních letech věnováno mnoho pozornosti ze strany vědců. Jedná se o skupinu látek sekundárního metabolismu rostlin - polyfenoly a glukosinoláty. 10

Tab.2. Vybrané biologicky aktivní sloučeniny ve vztahu k prevenci nádorového onemocnění (Greenwald et al., 2001) Třída Nejčastější zástupci Zdroje v potravě Mechanismus prevence nádorového onemocnění Karotenoidy α-karoten β-karoten Lykopen β-kryptoxantin Astaxantin žluto-červená a tmavě zelená zelenina a ovoce antioxidační aktivita modulace metabolismu karcinogenů inhibice buněčné proliferace inhibice exprese onkogenů prospěšné účinky na imunitní systém prospěšné účinky na buněčnou transformaci a diferenciaci zlepšení mezibuněčné komunikace Organo-siřičité sloučeniny Diallyl sulfid Diallyl disulfid Allyl methyl trisulfid Dithiothiony česnek, cibule, brukvovitá zelenina zvýšení aktivity detoxikačních enzymů II. fáze inhibice buněčné proliferace indukce buněčné diferenciace alterace metabolismu steroidních hormonů inhibice aktivity ornithin dekarboxylázy Polyfenoly Fenolové kyseliny Hydroxyskořicové kyseliny Flavanoly Flavanony Katechniny zelenina a ovoce, zelený čaj, červené víno snížení tvorby DNA adduktů inhibice buněčné proliferace indukce zastavení buněčného cyklu a apoptózy inhibice signální transdukce zlepšení mezibuněčné komunikace zlepšení imunitních funkcí Fytoestrogeny Isoflavony, sójové boby, alterace metabolismu estrogenů Lignany zelenina, snížení aktivity tyrosin kinázy žito indukce zastavení buněčného cyklu a apoptózy ovlivnění DNA-zlomů vyvolaných topoisomerázou II Glukosinoláty, Glukobrassicin brukvovitá zvýšení aktivity detoxikačních enzymů isothiokyanáty, Sulforafan zelenina II. fáze indoly Indol-3-karbinol indukce zastavení buněčného cyklu a apoptózy inhibice buněčné adheze a invaze Terpeny Monoterpeny zelenina a zvýšení aktivity detoxikačních enzymů Seskviterpeny ovoce II. fáze (např. citrusové) ovlivnění buněčné progrese indukce apoptózy 11

1.2 Polyfenoly Polyfenoly tvoří jednu z nejpočetnějších a nejvíce zastoupených skupin rostlinných metabolitů a tvoří tedy nedílnou součást potravy lidí i zvířat (Bravo, 1998). Zpočátku byly studovány pro jejich esenciální funkci ve fyziologii rostlin (růst, reprodukce, ochrana před patogeny a predátory). Až donedávna byly také u těchto látek objevovány většinou jen škodlivé a nepříznivé účinky, neboť polyfenoly jsou schopné se vázat na makromolekuly (bílkoviny, sacharidy, trávicí enzymy) a tím se snižuje nutriční hodnota potravy. Postupně však docházelo k poznání jejich antioxidačních vlastností a využitelnosti v lidském organismu, jejich možné role v prevenci nemocí spojených s oxidačním stresem (kardiovaskulární, nádorové a neurodegenerativní nemoci) (Bravo, 1998; Manach et al., 2004). Výzkumy se dnes zaměřují především na určení přesných mechanismů vedoucích k protektivním účinkům a na identifikaci pravděpodobně nejprospěšnějších polyfenolických látek. Tyto výsledky pak mohou pomoci v určení optimálního příjmu polyfenolů stravou (Manach et al., 2004). 1.2.1 Dělení polyfenolů Polyfenoly představují širokou skupiny sloučenin s více než osmi tisíci fenolickými látkami známými v současné době. Polyfenoly jsou produkty sekundárního metabolismu rostlin. Vznikají biogeneticky ze dvou hlavních syntetických cest: šikimátové acetátové Vzniká tak extrémně široká a komplexní skupina látek. Přírodní polyfenoly zahrnují látky od jednoduchých fenolových molekul, jako je kyselina fenolová, až k vysoce polymerizovaným sloučeninám s molekulární hmotností větší než 30 kda, jako jsou tanniny. Primárně se vyskytují v konjugované formě, s jednou či více sacharidovými jednotkami (monosacharidy, disacharidy či oligosacharidy) β-glykosidicky vázanými k hydroxylovým skupinám. Glukóza je nejběžnější připojený sacharid. Vazby s jinými sloučeninami (karboxylové a organické kyseliny, aminy, lipidy a vazby s jinými fenoly) jsou rovněž běžné (Bravo, 1998). Polyfenolické sloučeniny mohou být rozděleny do několika skupin v závislosti na počtu aromatických kruhů a způsobu vazby mezi jednotlivými aromatickými kruhy. 12

Jsou rozlišovány čtyři skupiny: 1. Fenolové kyseliny 2. Flavonoidy 3. Stilbeny 4. Lignany (Manach et al., 2004). 1.2.1.1 Fenolové kyseliny Rozlišujeme dvě třídy fenolových kyselin: deriváty kyseliny benzoové (kys. ellagová, gallová, hydrolyzované tanniny) deriváty kyseliny skořicové (kys. p-kumarová, kávová, chlorogenová, ferulová, sinapová) (viz obr.1.). Tyto kyseliny se nacházejí jak ve volné, tak v esterifikované formě. Dvě hlavní hydroxybenzoové kyseliny představuje kyselina gallová a ellagová. Nalézají se převážně v bobulích (maliny, jahody, ostružiny) a ořeších (King a Young, 1999). Celkově hydroxybenzoové kyseliny bývají zastoupeny v běžné stravě ve velmi malých koncentracích s výjimkou některých druhů červeného ovoce, černé ředkve a cibule. Zde jsou zastoupeny řádově v desítkách mg.kg -1 čerstvé hmotnosti. R 1 = R 2 = OH, R 3 = H : K. protokatechuová R 1 = R 2 = R 3 = OH : K. gallová R 1 = OH : K. kumarová R 1 = R 2 = OH : K. kávová R 1 = R 2 = OH : K. ferulová Obr. 1. Chemická struktura hydroxybenzoových a hydroxyskořicových kyselin (Manach et al., 2004) Významný zdroj kyseliny gallové představuje čaj (Camelia sinensis). Čajové lístky mohou obsahovat až 4,5 g.kg -1 čerstvé hmotnosti. Mimo jiné jsou hydroxybenzoové 13

kyseliny součástí komplexních struktur hydrolyzovaných tanninů (gallotanninů a ellagotanninů). Hydroxyskořicové kyseliny jsou v naší stravě běžnější. Výjimečně se nalézají ve volné formě, vyjma zpracované potravy (zmrazení, sterilizace či fermentace). Většinou je nacházíme glykosylované či ve formě esterů kyseliny chininové, šikimátové a vinné. Hydroxyskořicové kyseliny se nacházejí především ve vnějších vrstvách zralého ovoce a jejich koncentrace se během zrání snižuje, nicméně s růstem plodu se celkový obsah zvyšuje. Nejrozšířenější je kyselina kávová, jak volná tak esterifikovaná a představuje 75 % a 100 % z celkového obsahu hydroxyskořicových kyselin obsažených v ovoci. Její ester kyselina chlorogenová je přítomna v mnoha druzích ovoce, zeleniny a v kávě. Jeden šálek kávy (200 ml) obsahuje 50 350 mg této kyseliny. Borůvky, kiwi, švestky, třešně a jablka poskytují asi 0,5 2 g hydroxyskořicových kyselin v 1 kg čerstvého ovoce. Kilogram čerstvých brambor poskytuje asi 100 200 mg této kyseliny. Vařené brambory pouze 35 % původního obsahu, a pečením se chlorogenová kyselina degraduje zcela. Kyselina ferulová je zastoupena nejvíce v obilovinách (0,8 2 g.kg -1 sušiny) a to především ve vnějších vrstvách zrna. Obiloviny tak představují její nejvýznamnější zdroj (Manach et al., 2004). Fenolové kyseliny a jejich deriváty vykazují účinky primárních antioxidantů (Velíšek, 2002). 1.2.1.2 Flavonoidy Flavonoidy, které představují nejvýznamnější samostatnou skupinu polyfenolů, obsahují v molekule dvě benzenová jádra spojená tříuhlíkovým řetězcem. Jedná se o uspořádání C 6 -C 3 -C 6. Svými vlastnostmi se liší od ostatních polyfenolických sloučeniny a proto jsou uváděny jako samostatná skupina rostlinných látek. Dodnes je známo více jak 4000 flavonoidních látek a stále jsou objevovány nové (Velíšek, 2002). U většiny flavonoidů je C 3 řetězec součástí heterocyklického kruhu a flavonoidy jsou tak odvozeny od heterocyklické sloučeniny 2H-chromenu, substituovaného v poloze C-2 fenylovou skupinou, který se nazývá flavan. Jeho kostra se skládá ze dvou benzenových jader (A a B) a kruhu odvozeno od 2H pyranu (C) (viz obr. 2.). Běžně jsou všechny 3 kruhy substituované methoxy- či hydroxyskupinami, jejich deriváty se pak liší stupněm oxidace či substituce. Flavonoidy se nejčastěji vyskytují jako glykosidy nebo méně běžně jako volné látky. (Bravo, 1998; Velíšek, 2002 ). 14

Obr. 2. Flavan základní struktura flavonoidů (Velíšek, 2002) 1.2.1.2.1 Dělení flavonoidů Podle stupně oxidace kyslíkového heterocyklu (kruh C) rozeznáváme šest podtříd flavonoidů: a. Flavonoly b. Flavony c. Isoflavony d. Flavanony e. Anthokyanidiny f. Flavanoly (katechiny a proanthokyanidiny) (Manach et al., 2004) 1.2.1.2.1.1 Flavonoly Hlavním zástupcem početné skupiny flavonoidů jsou flavonoly (viz obr. 3.). Jsou zastoupeny v relativně nízkých koncentracích 15 30 mg.kg -1 Nejbohatšími zdroji jsou česnek (až 1,2 g.kg -1 čerstvé hmotnosti. čerstvé hmotnosti), pór, brokolice a borůvky (Manach et al., 2004) a jablka (Lachman et al., 2000). Nejznámějšími aglykony jsou kvercetin, kemferol a myricetin. Kvercetin je všudypřítomný v ovoci a zelenině a je kvantitativně nejvíce zastoupen v rostlinné stravě (Scalbert a Williamson, 2000). Kemferol se nachází převážně v listové zelenině a ovoci, také v bobulích, bylinách, luštěninách a kořenové zelenině. Isorhamnetin nalezneme v cibuli a hruškách a další flavonol myricetin v bobulích, kukuřici a čaji. Aglykony se vyskytují v poměrně malém množství, hlavní formou flavonolů jsou glykosidy. Nejčastější cukernou složkou představuje glukóza či rhamnóza. V ovoci tak rozeznáváme mezi 5 10 různými flavonolovými glykosidy. Běžným glykosidem rostlin je rutin. Ten a některé další glykosidy vykazují antioxidační vlastnosti, mají vliv na pružnost a permeabilitu krevních kapilár. 15

R 2 = OH, R 1 = R 3 = H : Kemferol R 1 = R 2 = OH, R 3 = H : Kvercetin R 1 = R 2 = R 3 = OH : Myricetin Obr. 3. Chemická struktura flavonolů (Manach et al., 2004) Ve větším množství se flavonoly a jejich glykosidy nachází v čaji a tím významně přispívají k trpké chuti čaje. Nalézají se rovněž ve víně, kde jejich koncentrace dosahuje až 45 mg flavonolů.l -1. Flavonoly se akumulují ve vnějších částech rostlinných tkání (slupka, listy), neboť jejich syntéza je stimulována světlem. V závislosti na expozici slunečnímu světlu existují znatelné rozdíly v jejich obsahu. V listové zelenině (hlávkový salát, zelí) bývá koncentrace glykosidů 10 a vícekrát vyšší ve vnějších listech než ve světlejších vnitřních částech (Manach et al., 2004). 1.2.1.2.1.2 Flavony Flavony jsou společně s flavonoly žlutými pigmenty rostlin. Chemická struktura flavonů je zobrazena na obr. 4. Jsou mnohem méně běžné než flavonoly. Hlavními zástupci této skupiny jsou glykosidy apigenin a luteolin, obsažené hlavně v bylinách (petržel), červených paprikách a celeru. Pokud jsou přítomné ve vyšších koncentracích, přispívají k barvě rostlinných tkání. C-glykosidy (vitexin a orientin) se nacházejí především v pšenici a jáhlech (Manach et al., 2004). Ve fících se např. nachází C-glykosid schaftosid, sloužící k identifikaci fíkové šťávy v jiných ovocných šťávách (Velíšek, 2002). Citrusové ovoce obsahuje polymethoxylované flavony nobiletin, sinensetin a tangeretin, které se podílejí na chuti ovoce díky přítomnosti senzoricky významných látek (Manach et al., 2004). 16

R 1 = H, R 2 = OH : Apigenin R 1 = R 2 = OH : Luteolin Obr. 4. Chemická struktura flavonů (Manach et al., 2004) 1.2.1.2.1.3 Isoflavony Podrobně zkoumanou skupinou jsou isoflavony, které jsou stavebně podobné estrogenům (viz obr. 5.). Ačkoliv se nejedná o steroidy, obsahují hydroxylové skupiny v poloze 7 a 4, které jsou analogní s hydroxyly v estradiolové molekule. Jsou schopné vázat se k estrogenovým receptorům a v důsledku toho jsou nazývány fytoestrogeny (Manach et al., 2004). R 1 = H : Daidzein R 1 = OH : Genistein Obr. 5. Obecná struktura isoflavonů (Manach et al., 2004) Tyto látky vykazují různé biologické účinky (antioxidativní, antikarcinogenní, kardioprotektivní, estrogenní/antiestrogenní, antibakteriální a další) a výsledky studií naznačují, že by mohly chránit či zpomalit vývoj hormonálně závislých nádorů (prs, prostata) a nemocí (osteoporóza) (Mazur, 1998). Pravděpodobně se uplatňují v iniciační a promoční fázi karcinogeneze a inhibují proliferaci endoteliálních buněk (Adlercreutz, 1999). Isoflavony a některé jejich deriváty však vykazují toxické účinky spojené s jejich estrogenní aktivitou (Velíšek, 2002). 17

Je jich známo přes 200. Vyskytují se především v luštěninách (čeleď bobovitá, Fabaceae). Sója (Glycine max) a sójové výrobky jsou jejich hlavním zástupcem. Obsahují tři hlavní sloučeniny: genistein, daidzein a glycitein, v poměru 1:1:0,2. Obsah isoflavonů v sóji se však liší podle oblasti, podmínek pěstování a zpracováním. Sójové boby obsahují v 1 kg mezi 580 3800 mg isoflavonů. Sójové mléko pak v 1 litru 30 175 mg. (Manach et al., 2004). 1.2.1.2.1.4 Flavanony Flavanony jsou nalézány ve vysokých koncentracích pouze v citrusovém ovoci, méně již v rajčatech a některých aromatických rostlinách (máta, lékořice). Přispívají k typické chuti citrusového ovoce. Chemická struktura je zobrazena na obr. 6. Hlavními aglykony jsou hesperetin (pomeranče), naringenin (grapefruity) a eriodictyol (citróny). R 1 = H, R 2 = OH : Naringenin R 1 = R 2 = OH : Eriodictyol R 1 = OH, R 2 = OCH 3 : Hesperetin Obr. 6. Chemická struktura flavanonů (Manach et al., 2004) Flavanony jsou obecně glykosylovány disacharidy v pozici 7 a to buď neohesperidózou, zodpovědnou za hořkou chuť či rutinózou, která je bezbarvá. V 1 litru pomerančového džusu je obsaženo okolo 200 600 mg hesperidinu a 15 85 mg narirutinu, takže jedna sklenice džusu představuje 40 140 mg glykosidů flavanonů. A protože se tyto látky nalézají nejvíce pod slupkou a v tkáních mezi jednotlivými segmenty, obsah flavanonů je až pětkrát vyšší v celém ovoci než ve sklenici džusu (Manach et al., 2004). 18

1.2.1.2.1.5 Anthokyanidiny Anthokyany jsou glykosidy různých aglykonů, které se nazývají anthokyanidiny (viz obr. 7.). Anthokyany, též nazývané anthokyaniny jsou nejrozšířenější skupinou rostlinných barviv nalézajících se v buněčných vakuolách. Jsou nositeli růžové, červené, modré a nachové barvy. Dosud bylo identifikováno kolem 300 různých anthokyanů. Podle ph existují barevné i nebarevné formy. Anthokyany jsou značně nestabilní. Aby se zabránilo jejich degradaci, dochází ke glykosylaci, převážně glukózou v pozici 3 a esterifikaci s různými organickými a fenolovými kyselinami (Manach et al., 2004). Tvorbou komplexů se slinnými proteiny, jsou tyto látky zodpovědné za trpkou chuť ovoce a nápojů (čaj, pivo, víno, jablečný mošt) (Rasmussen et al., 2005). Anthokyaniny se nalézají především v ovoci, bobulích hrozna modrých odrůd révy vinné, v cereáliích, a v některých druzích listové a kořenové zeleniny (červené zelí, fazole, lilek baklažán, cibule a ředkvička) R 1 = R 2 = H : Pelargonidin R 1 = OH, R 2 = H : Kyanidin R 1 = R 2 = OH : Delfinidin R 1 = OCH 3, R 2 = OH : Petunidin R 1 = R 2 = OCH 3 : Malvidin Obr. 7. Chemická struktura anthokyanidinů (Manach et al., 2004) Nejznámější zástupci této skupiny jsou kyanidin, dále pelargonidin, peonidin, delfinidin, petunidin a malvidin. Počet anthokyanů v rostlinách je různý a pohybuje se od několika málo (ostružiny, jahody) až po více než deset různých pigmentů (borůvky, réva vinná). 19

Nalézají se hlavně ve slupkách, ale i v dužině (jahody, třešně). Barva obvykle odpovídá obsahu anthokyanů. U černého rybízu a ostružin dosahuje 2 4 g.kg -1. Víno obsahuje v 1 litru 200 350 mg anthokyanů, jeho složení se mění se stupněm zrání vína (klesají původní anthokyany a stoupají stabilnější červené pigmenty) (Velíšek, 2002; Manach et al., 2004). Anthokyanová barviva byla povolena v potravinářském průmyslu k barvení potravin. Jejich toxicita a mutagenita nebyl prokázána nebo byla velmi nízká (Velíšek, 2002). Naopak u anthokyaninů byly prokázány antioxidační vlastnosti (Prior, 2003). 1.2.1.2.1.6 Flavanoly Flavanoly existují jako monomery (katechiny) (viz obr. 8.) a polymery (proanthokyanidiny). Katechiny se nalézají v mnoha druzích ovoce, ale jsou také zastoupeny v révovém víně. Zelený čaj a čokoláda však představují zdaleka jejich nejbohatší zdroj. Šálek odvaru ze zeleného čaje obsahuje až 200 mg katechinů. Černý čaj obsahuje díky procesu fermentace méně monomerů flavanolů, neboť ty podléhají oxidaci za vzniku komplexnějších kondenzovaných polyfenolů známých jako teaflaviny a tearubigeny. R 1 = R 2 = OH, R 3 = H : Katechiny R 1 = R 2 = R 3 = OH : Gallokatechin Obr. 8. Chemická struktura flavanolů (Manach et al., 2004) Nejznámějšími flavanoly jsou již výše zmíněné katechiny a epikatechiny, které se nalézají především v ovoci, zatímco gallokatechiny, epigallokatechiny a epigallokatechin gallát nalezneme zejména v luštěninách, hroznech a významněji jsou zastoupeny v čaji. 20

Proanthokyanidiny, také známé jako kondenzované tanniny, jsou dimery, oligomery a polymery katechinů. Tanniny jsou vysoce hydroxylované molekuly a mohou tvořit nerozpustné komplexy se sacharidy a proteiny. Kondenzované tanniny jsou díky tvorbě komplexů se slinnými proteiny zodpovědné za svíravou chuť ovoce (vinná réva, broskve, bobule, jablka, hrušky), nápojů (víno, čaj, pivo, jablečný mošt) a za hořkost čokolády. Svíravost se mění i během procesu zrání a s dosažením zralosti mizí (Manach et al., 2004). 1.2.1.3 Stilbeny Stilbeny (viz obr. 9.), strukturně podobné flavonoidům, jsou v lidské výživě zastoupeny pouze v malém množství. Vyskytují se ve volné formě nebo vázané jako glykosidy. Některé z nich prokazují antimikrobní vlastnosti a proto se řadí mezi fytoalexiny, což jsou sekundární metabolity rostlin, které se tvoří jako odpověď na stres (Šmidrkal et al., 2001). Resveratrol Obr. 9. Chemická struktura stilbenů (Manach et al., 2004) Do této skupiny patří známý resveratrol a jeho glukosid piceol. Resveratrolu se připisuje významná úloha v prevenci kardiovaskulárních nemocí, vykazuje antiaterogenní, protizánětlivé a antioxidační účinky, v posledních letech jsou zkoumány jeho možné antikarcinogenní účinky (Fremont, 2000; Ignatowitz a Baer-Dubowska, 2001). Nalézá se především ve slupkách bobulí modrých odrůd révy vinné. Zráním se jeho obsah zvyšuje (až do 20 mg.kg -1 ) (Kopec, 2000). V menším množství se nalézá také ve vínech. V jednom litru je obsaženo přibližně 0,3 2 mg resveratrolu, více v červeném než bílém (Scalbert a Williamson, 2000). 21

1.2.1.4 Lignany Pro svoji estrogenní aktivitu bývají lignany také řazeny do skupiny fytoestrogenů. Lignany se nacházejí především v různých druzích semen, v celých zrnech, luscích zeleniny a také v ovoci. Při technologickém zpracování však dochází k odstranění lignanů se slupkami společně s vlákninou a proto je lidská strava na tyto látky celkem chudá. Nejbohatším zdrojem lignanů tak zůstává lněné semínko, lněný olej a celozrnné žitné pečivo. Lněné semínko obsahuje sekoisolariciresinol (SECO) (až 3,7 g.kg -1 sušiny) (viz obr. 10) a malé množství matairesinolu. Lignany jsou metabolizovány střevní mikroflórou na enterodiol a enterolakton (Manach et al., 2004). Sekoisolariciresinol Obr. 10. Chemická struktura lignanů (Manach et al., 2004) 1.2.2 Obsah polyfenolů ve stravě Dnes existuje široké množství literárních údajů o složení polyfenolů a jejich obsahu v rostlinné stravě a nápojích. Jejich množství v potravinách se pohybuje v širokém rozmezí od 1 mg.kg -1 do 3000 mg.kg -1. Obsah polyfenolů v rostlinné stravě může být ovlivněn řadou faktorů, zejména odrůdou a podmínkami pěstování rostliny, zralostí v době sklizně, zpracováním, skladováním či kulinární úpravou. Navíc nejsou polyfenoly v rostlinách rozloženy rovnoměrně a proto může mít následné zpracování podstatný vliv na jejich konečné množství. Například tvorba glykosidů flavonu a flavonolu vysoce závisí na světle, proto jsou nejvyšší koncentrace těchto sloučenin nalézány v listech a zevních částech 22

rostlin, s pouze stopovým množstvím v podzemních částech rostlin. Množství kvercetinu v jablečné slupce je asi 1 mg.g -1 čerstvé váhy, po oloupání však jablko neobsahuje žádné další flavonoly (Burda et al., 1990). Podobné je to s obsahem polyfenolů v obilovinách před a po zpracování na mouku. Tepelné zpracování vede také ke snížení obsahu polyfenolů. U rajčat a cibule se vařením ztrácí 75 80 % z původního obsahu kvercetinu, při přípravě v mikrovlnné troubě 65 % a smažením 30 %. Při tepelné úpravě v páře se ztrácí nejméně polyfenolů. Podobná situace je s bramborami, zde se polyfenoly ztrácejí jak loupáním, tak vařením. Na druhé straně může být technologickým procesem obsah polyfenolů zvýšen, jako je tomu např. při výrobě ovocných džusů nebo vín. Při lisování ovocné šťávy dojde k uvolnění fenolových látek (narušením buněčné struktury), které jsou za syrového stavu nedostupné. Ovoce je obvykle bohatší na polyfenoly než zelenina. Celkový obsah polyfenolů bývá okolo 10 20 g.kg -1 čerstvého ovoce. Jsou zastoupeny hlavně proanthokyanidiny (jablka, švestky, hrozny) a anthokyaniny (třešně a další červené ovoce), které se běžně nenacházejí v zelenině. Konzumace výrobků z obilovin pak přispívá k příjmu fenolových kyselin pouze pokud jsou pro výrobu použita celá zrna. Čokoláda je také bohatá na polyfenoly, zvláště na katechiny a proanthokyanidiny a může tak významně přispívat k jejich celkovému příjmu. Neméně důležitým zdrojem polyfenolů v lidské výživě jsou nápoje. Lidem, kteří konzumují pravidelně čaj, kávu, víno a ovocné džusy, poskytují tyto nápoje hlavní přísun polyfenolů (Scalbert a Williamson, 2000). V hroznech révy vinné (Vitis vinifera L., V. labrusca, V. rotundifolia) a také v bílých a červených vínech se vyskytuje resveratrol, který patří do skupiny stilbenů. Převážně se nachází ve slupkách. Během zrání bobulí se jeho obsah postupně zvyšuje. Obsah resveratrolu se liší dle druhu a odrůdy (vyšší obsah v hroznech V. rotundifolia než ve V. vinifera L.). Jeho obsah je ovlivněn i zeměpisnou šířkou a nadmořskou výškou (chladnější oblasti - vyšší obsah resveratrolu). Kontaminace a stresory během růstu rovněž zvyšují jeho koncentraci. Nesporný vliv má i technologie zpracování. Červená vína mají asi šestkrát vyšší koncentraci resveratrolu než vína bílá (Kopec, 1999). Faitová et al. (2004) porovnávali obsah resveratrolu v Ryzlinku rýnském z různých vinařských oblastí ČR. Nejvyšší obsah byl nalezen u vín z roudnické oblasti (0,262 mg.l -1 ), nejnižší ve vínech ze žernosecké oblasti (0,051mg.l -1 ). Podobně Totušek et al. (1994) stanovovali obsah resveratrolu v červených vínech z jihomoravských vinařských oblastí, z roku 1999. Přičemž nejvyšší obsah byl nalezen ve vínech jakostního stupně 23

jakostní z velkopavlovické oblasti (3,73 7,83 mg.l -1 ), Absolutně nejvyšší hodnotu vykazovala Frankovka (7,83 mg.l -1 ). Zajímavé bylo, že kvalitnější vína z této oblasti vykazovala nižší hodnoty (0,051mg.l -1 ). Tab. 3. Obsah polyfenolů v jedné porci běžně konzumovaných potravin a nápojů (mg) (Scalbert a Williamson, 2000) Potraviny Fenolové kyseliny Flavonoly Katechiny (flavonoly) Proanthokyanidiny (flavonoly) Flavanony Anthokyaniny Zelenina Brambory 200 g 28 Rajčata 100 g 8 0,5 Hlávkový salát 100 g 8 1 Cibule 20 g 7 Ovoce Jablka 200 g 11 7 21 200 Třešně 50 g 37 1 3 35 200 Další potraviny Pšeničné otruby 10 g 50 Tmavá čokoláda 20 g 16 86 Nápoje Pomerančový džus 100 ml 22 Červené víno 125 ml 12 2 34 45 4 Káva 200 ml 150 Černý čaj 200 ml 8 130 Polyfenoly jsou částečně zodpovědné za senzorické a nutriční vlastnosti rostlinné stravy. Podílejí se na svíravé a hořké chuti. Oxidace polyfenolů během zpracování či skladování tak bude ovlivňovat prospěšné či nežádoucí charakteristiky v potravních produktech. Oxidativní změny, např. hnědnutí kakaa během zpracování či oxidativní polymerace polyfenolů čaje během výroby černého čaje má za následek vývoj 24

význačných a žádoucích organoleptických vlastností. Naproti tomu, enzymatické hnědnutí polyfenolických sloučenin a neenzymové hnědnutí jsou zodpovědné za tvorbu nežádoucí barvy a chuti ovoce a zeleniny (Bravo, 1998). Průměrný obsah polyfenolů v jedné porci konzumovaných potravin a nápojů se snaží přiblížit tabulka 3. Od roku 2003 je také na stránkách ministerstva zahraničí USA dostupná databáze 225 vybraných potravin s obsahem flavonoidů (US Department of Agriculture, 2003). V příloze 2 5 jsou uvedeny tabulky s obsahem polyfenolů dle Kinga a Younga (1999). Nejprve dle jednotlivých zastoupených polyfenolů (příloha 2) a posléze tytéž údaje dle zdrojů jednotlivých polyfenolů ve stravě a nápojích (příloha 3 5).V příloze 6 jsou zobrazeny obsahy celkových polyfenolů dle Brava (1998). Aktuální obsah polyfenolů je často podhodnocen z důvodu nedostatečné analýzy nerozpustných polyfenolů, které mohou představovat důležitější zdroj polyfenolů než samotné flavonoidy (Bravo, 1998). 1.2.3 Příjem polyfenolů Díky obrovské rozmanitosti ve struktuře jednotlivých polyfenolů (rozdíly ve stavbě, oxidačním stavu, hydroxylaci fenolového kruhu, glykosylaci většiny flavonoidů apod.) je velmi obtížné odhadnou jejich množství ve stravě a také zůstává mnoho polyfenolů stále neidentifikovaných. Mimoto je obtížné srovnávat získaná data s literárními údaji a to především pro nedostatek srovnatelných analytických metod a výskytu různých druhů polyfenolických sloučenin (King a Young, 1999). Kühnau v roce 1976 spočítal, že celkový denní příjem glykosidů flavonoidů na 1 obyvatele USA byl přibližně 1g, s následujícím složením: 16 % flavonoly, flavony a flavanony, 17 % anthokyaniny, 20 % katechiny a 45 % biflavony (Kühnau, 1976). Současné studie ukazují, že příjem fenolových kyselin představuje přibližně 1/3 z celkových polyfenolů, flavonoidy pak zbylé 2/3. Vždy ale záleží na poměru konzumovaných druhů potravin a nápojů. V běžné západní stravě se konzumuje asi jen 2 4 % genisteinu a kvercetinu z celkových polyfenolů. V Japonsku je situace opačná. Vysoká konzumace sóji a sójových výrobků (10 35 g/den) přináší mnohem vyšší příjem isoflavonů (30 40 mg/den) (Kimira et al., 1998; Wakai et al., 1999). V ČR jsou hlavními zdroji polyfenolů především ovoce a nápoje. V menší míře přispívají obiloviny a zelenina. Takže lidé konzumující během dne rozmanitou stravu a 25

nápoje by měli přijmout více než 1g flavonoidů a fenolových kyselin denně (Velíšek, 2002). Ve studii vedené v Nizozemí se čtyřmi tisíci dospělými lidmi byl průměrný denní příjem flavonoidů kvercetinu, kemferolu, myricetinu, apigeninu a luteolinu celkově 23 mg, z toho 16 mg kvercetinu. Zdroje flavonoidů byly: čaj (48%), cibule (29%) a jablka (7%) (Hertog et al., 1993). Průměrný denní příjem flavonů a flavonolů ve studii s 12.763 dobrovolníky ze sedmi zemí (od roku 1958 do roku 1964) se pohyboval od 2,6 mg/den ve Finsku až k 68,2 mg/den v Japonsku (Hertog et al., 1995). Jiná studie ukazuje, že příjem flavonolů a flavonů pro jeden subjekt z každé ze 14 zemí se pohyboval od 3,6 mg/den pro osobu z Mexika až k 77 mg/den pro osobu z Finska; průměrně 27,6 mg/den. Američané, kteří dodržují makrobiotickou stravu, konzumují průměrně 15,7 mg/den (De Vries et al., 1997). Ve Španělsku je průměrný příjem polyfenolů asi 18 31 mg/den. Jejich hlavní zdroje představuje víno a jablka (Shoji et al., 2004). Ve Velké Británii dosahuje příjme flavonoidů dle Pierpointa (1990) až 900 mg denně, a to především díky vysoké konzumaci čaje. Rozdíly v příjmu flavonoidů mezi jednotlivými zeměmi nejsou však dány ani tak odlišností v jejich příjmu jako spíše rozdílnými metodikami ve shromažďování dat a designem jednotlivých studií. Příjem flavonoidů tvoří ale jen část z celkového příjmu polyfenolických sloučenin a neexistují studie, které by odhadovaly jejich celkový příjem. Jestliže by byly zahrnuty anthokyany, flavonoly, isoflavony, fenolové kyseliny a tanniny, celkový příjem polyfenolických sloučenin by mohl být vysoký, zvláště v zemích, kde je konzumováno hojně červené víno a sójové produkty. Informace o celkovém příjmu polyfenolických sloučenin by byly užitečné, neboť většina polyfenolů vykazuje řadu biologických účinků a ovlivňují tak fyziologické a patofyziologické procesy v organismu (King a Young, 1999). 1.2.4 Metabolismus polyfenolů 1.2.4.1 Absorpce Je nezbytné si uvědomit, že polyfenolické sloučeniny, které se nejčastěji vyskytují ve stravě, nemusí být nutně nejaktivnější uvnitř lidského těla. Existuje několik důvodů, které tento fakt potvrzují. Může se jednat o nedostatečnou absorpci 26

z gastrointestinálního traktu, rychlou metabolizaci, nízkou či odlišnou biologickou aktivitou v cílových tkáních či urychlenou eliminaci z organismu (Hollman, 1997a). Ve stravě jsou flavonoidy, kromě flavanolů přítomny v glykosidické formě, která ovlivňuje chemické, fyzikální a biologické vlastnosti polyfenolů (Scalbert a Williamson, 2000). O osudu glykosidů v žaludku neexistuje mnoho přesvědčivých důkazů. Experimenty ukazují, že vstřebávání v žaludku je možné u některých flavonoidů, např. u kvercetinu a daidzeinu, ale ne pro jejich glykosidy. Většina glykosidů pravděpodobně odolává kyselé hydrolýze v žaludku a tak přichází intaktní do duodena (Manach et al., 2004). V tenkém střevě však mohou být absorbovány pouze volné flavonoidy, tzv. aglykony a některé glukosidy. Nicméně polyfenoly se převážně vyskytuje ve formě esterů, glykosidů či polymerů, které vykazují hydrofobní vlastnosti a není umožněna jejich pasivní difúze střevní stěnou (Scalbert a Williamson, 2000). Polyfenoly nemohou být absorbovány ve své původní formě. Před vlastní absorpcí dochází k hydrolýze enzymy (β-glukosidázami) nebo působením mikroflóry tlustého střeva (Kroon et al., 2004; Walle, 2004). Po hydrolýze derivátů polyfenolů na volné aglykony je umožněn jejich vstup do enterocytů, kde dochází pomocí enzymu UDPglukuronyltransferázy ke tvorbě konjugátů s kyselinou glukuronovou (Silberberg et al., 2005). Další osud je podobný jako u léčiv a mnoho informací dostupných o metabolismu přírodních polyfenolů pochází právě ze srovnávání s metabolismem léčiv. Tvorba konjugátů může dramaticky změnit biologické vlastnosti cirkulujících metabolitů. Nicméně existují významné rozdíly mezi administrací léků (obvykle ve stovkách mg v jedné dávce) a konzumací polyfenolů stravou (obvykle < 100 mg na dávku). Tyto rozdíly naznačují, že léky mohou lehce saturovat metabolické cesty, které se spoléhají na dodávku kofaktorů jako je např. UDP- glukuronová kyselina. V důsledku toho se často v krvi nacházejí nekonjugované léky. Na druhou stranu, u polyfenolů přicházejících ze stravy není očekáváno, že nasytí metabolické cesty a proto by mohly být konjugovány. Pokud jsou však polyfenoly podávány ve farmakologických dávkách, nalézají se v krvi ve volné formě (Hackett et al., 1983). Kupř. po příjmu velkých dávek (2g) (+)-katechinu, lze po 30ti minutách detekovat v krvi volný (+)- katechin. Po dvou hodinách jsou detekovány stopy methyl-katechinu a po 8 hodinách je 40% katechinu v moči v podobě konjugátů s kyselinou glukuronovou, se sulfátem nebo je katechin methylován. Nicméně konzumace několika mg (+)- katechinů normálně přítomných v červeném víně vede ke konjugaci všech cirkulujících katechinů a žádné volné polyfenoly nebyly detekovány (Bell et al., 2000). Piskula a Terao (1998) 27

prokázali u potkanů po orální dávce 10 mg (-)-epikatechinu, že jsou polyfenoly nejprve glukuronidovány během intestinální absorpce, následovala methylace a konjugace se sulfátem v játrech, s následnou methylací v ledvinách před jejich vyloučením. Množství zkonzumovaných polyfenolů je tedy určující pro jejich následný metabolismus. Jiná situace nastává u volných forem polyfenolů. Flavanoly jako (-)-epikatechin jsou často acylované, zvláště kyselinou gallovou. To má za následek, že není ovlivněna biologická využitelnost tak jako u glykosylace. Zdá se, že flavanoly prostupují přes biologickou membránu a jsou absorbovány bez dekonjugace či hydrolýzy. Deriváty kyseliny hydroxyskořicové, jako kyselina ferulová a kávová jsou běžně esterifikovány cukry, organickými kyselinami a lipidy. Například kyselina chlorogenová je esterem kyseliny kávové navázaná ke kyselině chinové, a tato sloučenina se nalézá ve velmi vysokém množství v kávě. Tyto substituenty mají značný vliv na chemické, fyzikální a biologické vlastnosti polyfenolů. V lidském těle nejsou žádné esterázy, které by byly schopny uvolnit kyselinu kávovou z kyseliny chlorogenové. Pro metabolismus kyseliny chlorogenové je tedy významná střevní mikroflóra. Podobně kyselina ferulová či jiné deriváty kyseliny hydroxyskořicové vázané na buněčnou stěnu rostlin jsou také uvolněny savčími endogenními enzymy, ale vyžadují uvolnění enzymů střevní mikroflóry. Ellagotanniny jsou také hydrolyzovány. Kyselina ellagová byla nalezena v moči a plicích myší krmených ellagotanniny z malin a granátových jablek. Nicméně není jisté, zda jde o hydrolýzu v žaludku či působením střevní mikroflóry. Vstřebávání polyfenolů záleží na jejich molekulové hmotnosti. Z důvodu velké molekulové hmotnosti proanthokyanidinů nejsou tyto látky štěpeny v žaludku člověka a nejsou ani vstřebávány v tenkém střevě. Údaje o jejich absorpci jsou však stále nedostatečné. Experimenty in vitro ukazují, že dimery a trimery prokyanidinů jsou absorbovány, na rozdíl od polymerů prokyanidinů, které mají průměrný stupeň polymerizace 7. Dimery a trimery jsou absorbovány v podobné míře jako (+)-katechiny, nicméně to bylo potvrzeno také in vivo studiemi (Scalbert a Williamson, 2000). Proanthokyanidiny procházejí do tlustého střeva, kde mohou být hydrolyzovány působením střevní mikroflóry na metabolity, které mohou vykazovat různé biologické účinky (snižování oxidačního stresu, možná účast v prevenci nádorového onemocnění střev) (Rios et al., 2002; Gonthier et al., 2003). Polyfenoly, které nemohou být vstřebány v žaludku či v tenkém střevě, přecházejí do tlustého střeva, kde dochází k hydrolýze působením mikroflóry tlustého střeva na 28

aglykony a ty jsou metabolizovány na různé aromatické kyseliny (Kühnau, 1978). Tlusté střevo obsahuje asi 10-12 mikroorganismů/cm 3 a má obrovské katalytické a hydrolytické schopnosti. K dekonjugačním reakcím dochází snadno. Např. kvercetin-3- O-rhamnoglukosid a kvercetin-3-o-rhamnosid nejsou hydrolyzovány lidskými endogenními enzymy, ale jsou snadněji hydrolyzovány střevní mikroflórou (Bacteroides distasonis, B. uniformit a B. ovatus) na kvercetin. Enterococcus casseliflavus využívá zbytky cukru kvercetin-3-o-glukosidu a tvoří acetát a laktát, ale už dále nemetabolizuje aglykony. Účinkem mikrobiálního metabolismu dochází k rozkladu polyfenolů na jednodušší fenolové sloučeniny, které jsou běžné pro mnoho různých polyfenolů. Navíc tyto metabolity mohou mít zcela jiné biologické účinky (Williamson a Manach, 2005). Mikrobiální metabolity jsou pak absorbovány a konjugovány s glycinem, kyselinou glukuronovou či sulfátem. Protože vstřebávání je hlavní dominantou tenkého střeva, je absorpce v tlustém střevě méně účinná a pomalejší. Tento jev je prokázán při absorpci kvercetinu, který se vstřebává po 0.5 0.7 hodiny po aplikaci a rutinu, který je maximálně absorbován po 6 9 hodinách. Následná biologická využitelnost rutinu je pouze 15 20 % ve srovnání s kvercetinem. Podobně je ovlivněna absorpce, pokud konzumujeme potraviny s převahou glukosidů, např. česnek, oproti potravinám se zastoupením jak glukosidů, tak glykosidů, např. jablko (Manach et al., 2004). 1.2.4.2 Metabolizace Polyfenoly, které se vstřebají, jsou následně metabolizovány v játrech a vyloučeny do žluče či přímo z enterocytů zpět do tenkého střeva a také přijdou do tlustého střeva, ale v různých chemických formách, jako např. glukuronidy, sulfáty či konjugáty s methylem (viz obr. 11.) (Silberberg et al., 2005). Chen et al. (2005) prokázali, že 35 % kvercetinu bylo opět získáno ze žluče v podobě konjugátů. Metabolismus většiny polyfenolů lze shrnout do několika základních bodů: 1. Glykosidy v plasmě se nevyskytují ve stejné podobě jako v potravinách. 2. Hlavní formou nalézající se v plasmě a moči jsou konjugáty sulfátů a glukuronátů původních aglykonů. 3. Polyfenoly, které ve své chemické struktuře obsahují o-hydroxy funkční skupiny, mohou být methylovány. 29