16 Kapilární elektroforéza v klinické praxi J. Tomková Úvod Kapilární elektroforéza (CE) patří mezi separační, elektromigrační techniky. Je založena na rozdílné rychlosti migrace nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli a lze ji použít pro separaci nízkomolekulárních i vysokomolekulárních látek. Mezi výhody CE patří vysoká separační účinnost, malá spotřeba vzorku a chemikálií, rychlost a nízké provozní náklady. CE našla své uplatnění v analýze sérových proteinů, lipoproteinů, izoenzymů, v molekulární biologii, při diagnostice hemoglobinopatíí, dědičných metabolických poruch, ale také při monitorování hladin léčiv a jeho metabolismu, kterým se budu zabývat ve svém příspěvku. Thiopurinová terapie Thiopurinové deriváty (merkaptopurin, thioguanin a azathioprin) byly vyvinuty Gertrudou Elionovou a Georgem Hitchingesem v padesátých letech minulého století (1). Tyto látky se používají k léčbě dětské akutní lymfoblastické leukémie, nespecifických střevních zánětů (Crohnova choroba a ulcerózní kolitida) a k zabránění rejekce štěpu po transplantaci orgánů (2). Jejich hlavní účinek je imunosupresivní. Dochází k inhibici proliferace imunokompetentních buněk vedoucí k narušení a snížení buněčné imunity. Antiproliferační účinek thiopurinů je spojen s inkorporací deoxythioguaninových nukleotidů do genomové DNA a s inhibicí její transkripce. Druhým mechanismem účinku je inhibice de novo syntézy purinových nukleotidů, zprostředkovaná methylthioinosin monofosfátem. V našem souboru jsme na OKB FN Olomouc, laboratoři dědičných metabolických poruch, vyšetřovali vzorky jak od zdravých dospělých dobrovolníků, tak od dětských pacientů s Crohnovou chorobou, kteří byli léčeni azathioprinem. Crohnova choroba je chronické zánětlivé onemocnění trávícího traktu neznámého původu. Patří do skupiny onemocnění označovaných jako nespecifické střevní záněty. Na rozdíl od ulcerózní kolitidy, která postihuje pouze tlusté střevo, může vypuknout prakticky v celém průběhu trávicí trubice, od ústní dutiny až po konečník. Zanícená místa se hojí jizvami, které zužují trávicí trubici. Azathioprin je imidazolový derivát 6-merkaptopurinu, který se po absorpci v těle rychle neenzymaticky konvertuje na 6-merkaptopurin (MP). Intracelulárně se MP přeměňuje pomocí hypoxantin guanin fosforibosyl transferázy na thioinosin monofosfát a dále pak inosin-5-monofosfátdehydrogenázou a guanidin-5-monofosfátsyntázou na 6-thioguaninové nukleotidy (3). Tato anabolická cesta je kompetitivní se dvěma katabolickými cestami. První z nich je oxidace MP na kyselinu 6-thiomočovou pomocí xantinoxidázy, tento enzym je blokován allopurinolem. Při druhé je MP přeměňován na 6-methylmerkaptopurin pomocí thiopurin methyltransferázy (TPMT) (4) (obr. 1). TPMT Aktivita TPMT je polymorfní s autosomálně kodominantním charakterem přenosu. Deficit enzymové aktivity TPMT vede ke snížené tvorbě methylmerkaptopurinů a ke zvýšené tvorbě 6-thioguaninových nukleotidů. Gen TPMT je lokalizován na chromozomu 6 (6p22.3) a obsahuje 9 intronů a 10 exonů, cdna a čtecí rámeček (open reading frame ORF). V bělošské populaci má 89 % osob normální aktivitu TPMT a 11 % sníženou aktivitu, jedná se o heterozygoty s mutací jedné alely. Kompletní deficit TPMT se vyskytuje u 0,3 % jedinců, kteří jsou homozygoti s mutací obou alel (5). 70 % známých mutací tvoří TPMT*3, z toho 55 % připadá na TPMT*3A, 7 % na TPMT*3B a 13 % na TPMT*3C (6). Pokud je pacientům s deficitem TPMT podávána standardní dávka merkaptopurinu nebo azathioprinu, dochází k akumulaci thioguaninových nukleotidů v erytrocytech. Tato akumulace obvykle vede k těžké hematopoetické toxicitě (7). Pacienti s kompletním deficitem TPMT mohou být léčeni 6-merkaptopurinem, jestliže je jim snížena dávka na 6 % až 10 % standardní dávky (8). Na našem pracovišti jsme stanovili enzymovou aktivitu u 56 vzorků, z toho 30 vzorků bylo od dospělých zdravých dobrovolníků a 26 od dětských pacientů s Crohnovou chorobou. Vyšetřovaným materiálem byla nesrážlivá krev, ze které jsme izolovali erytrocyty, které jsme promývali roztokem NaCl. Takto získané erytrocyty jsme lyzovali pomocí vychlazené deionizované vody (0 C). Lyzát erytrocytů byl přidán do inkubační směsi, která obsahovala K 2 HPO 4, allopurinol, DTT a SAM. Po protřepání byl přidán 6-MP. Takto připravené vzorky byly inkubovány 2 hod při teplotě 37 C. Inkubace byla ukončena deproteinací pomocí trichloroctové kyseliny (TCA). Vzorky byly dále protřepány, 30 s sonifikovány a centrifugovány. Supernatant byl dvakrát zpětně extrahován diethy-
letherem. Po extrakci byly vzorky zamraženy na -50 C a následně lyofilizovány. Vysušené extrakty byly rozpuštěny v 50 µl deionizované vody a analyzovány nebo uchovány při -20 C pro pozdější analýzu. Všechny analýzy byly prováděny na přístroji Beckman P/ACE 5510 s detektorem diodového pole (obr. 2). Separace probíhala v nepokryté křemenné kapiláře a pro dosažení lepší citlivosti metody byl aplikován součet vlnových délek v rozmezí 285-305 nm. Jako pufr byla použita 3-(cyklohexylamino)-1-propansulfonová kyselina (CAPS) s přídavkem methanolu. CAPS byl upraven pomocí triethylaminu na ph 11,2. Inosintrifosfát pyrofosfohydroláza (ITPáza) ITPáza katalyzuje pyrofosfohydrolýzu inosintrifosfátu (ITP) na inosinmonofosfát. Deficit ITPázy je klinicky benigní a projevuje se akumulací ITP v erytrocytech. Gen ITPázy je lokalizován na chromozomu 20p13 a obsahuje 9 exonů, cdna a čtecí rámeček (9). U deficitu ITPázy se vyskytují dva polymorfizmy 94C>A a IVS2+219A>C. Polymorfizmus 94C>A je spojen s vedlejšími účinky (nevolnost, pankreatitida a hepatotoxicita) při léčbě azathioprinem u pacientů s Crohnovou chorobou. Na našem pracovišti jsme stanovili enzymovou aktivitu u 100 vzorků, z toho 80 vzorků bylo od dospělých zdravých dobrovolníků a 20 od dětských pacientů s Crohnovou chorobou. Vyšetřovaným materiálem byla nesrážlivá krev, ze které jsme izolovali erytrocyty, které jsme promývali roztokem NaCl. Takto získané erytrocyty jsme lyzovali pomocí vychlazené deionizované vody (0 C). Lyzát erytrocytů byl přidán do inkubační směsi, která obsahovala Tris pufr, dithiothreitol a MgCl 2 a byla provedena 15 minutová preinkubace. Poté byl ke vzorkům přidán ITP a vzorky byly inkubovány 15 min při teplotě 37 C. Inkubace byla ukončena deproteinací pomocí trichloroctové kyseliny (TCA). Vzorky byly dále protřepány, 30 s sonifikovány a centrifugovány. Supernatant byl dvakrát zpětně extrahován diethyletherem. Po extrakci byly vzorky buď přímo analyzovány nebo uchovány při -20 C pro pozdější analýzu. Všechny analýzy byly prováděny na přístroji Beckman P/ACE 5510 s detektorem diodového pole (obr. 3). Separace probíhala v nepokryté křemenné kapiláře a detekce byla prováděna při 250 nm. Byl použit směsný pufr, který obsahoval kyselinu citrónovou a cetyltrimethylamonium bromid. Pufr byl upraven pomocí γ-aminomáselné kyseliny na ph 4,4. Závěr CE je vhodná technika pro stanovení enzymové aktivity jak TPMT, tak ITPázy. Stanovení aktivit těchto dvou enzymů je důležité před zahájením léčby azathioprinem u pacientů trpících Crohnovou chorobou pro nastavení správného dávkování léku. 1. Dervieux, T., Meshkin, B., Neri, B.: Pharmacogenetic testing: proofs of principle and pharmacoeconomic implications. Mutation Resarch. 2005 Jun, 573 (1-2): 180-194. 2. Pike,M. G., Franklin, C. L., Mays, D.C., et al.: Improved methods for determining the concentration of 6-thioguanine nucleotides and 6-methylmercaptopurine nucleotides in blood. J. Chromatog. B Biomed Sci Appl. 2001 Jun, 757 (1): 1-9. 3. Dervieux, T., Chu, Y., Su, Y., Pui, CH., Evans, W. E., Relling, M. V.: HPLC determination of thiopurine nucleosides and nucleotides in vivo in lymphoblasts following mercaptopurine therapy. Clin. Chem. 2002 Jan, 48 (1): 61-68. 4. Cuffari, C., Seidman, E. G., Latour S, Theoret, Y.: Quantitation of 6-thioguanine in peripheral blood leukocyte DNA in Crohn's disease patients on maintenance 6-mercaptopurine therapy. J. Physiol. Pharmacol. 1996 May, 74 (5): 580-585. 5. Breen, D. P., Marinaki, A. M., Arenas, M, Hayes, P.C.: Pharmacogenetic association with adverse drug reactions to azathioprine immunosuppressive therapy following liver transplantation. Liver Transplant. 2005 Jul, 11 (7): 826-833. 6. Schutz, E., von Ahsen, N., Oellerich, M.: Genotyping of eight thiopurine methyltransferase mutations: three-color multiplexing, "two-color/ shared" anchor, and fluorescence-quenching hybridization probe assays based on thermodynamic nearest-neighbor probe design. Clin. Chem. 2000 Nov, 46 (11): 1728-1737. 7. Yates, C. R., Krynetski, E. Y., Loennechen, T., Fessing, M. Y., Tai, H. L., Pui, C. H., Relling, M. V., Evans, W.E.: Molecular diagnosis of thiopurine S-methyltransferase deficiency: genetic basis for azathioprine and mercaptopurine intolerance. Ann Intern Med. 1997 Apr, 126 (8): 608-614. 8. Relling, M. V., Hancock, M. L., Rivera, G. K., Sandlund, J. T., Ribeiro, R. C., Krynetski, E. Y., Pui, C. H., Evans, W. E.: Mercaptopurine therapy intolerance and heterozygosity at the thiopurine S-methyltransferase gene locus. J. Natl. Cancer. I. 1999 Dec, 91 (23): 2001-2008. laboratorní technologie 17
9. Lin S., McLennan A. G., Ying K., Wang Z., Gu S., Jin H., Wu C., Liu W., Yuan Y., Tang R., Xie Y., Mao Y.: Cloning, expression, and characterization of a human inosine triphosphate pyrophosphatase encoded by the itpa gene. J Biol Chem. 2001 Jun, 276 (22):18695-701. laboratorní technologie Obr. 1: Metabolizmus azathioprinu XO - xantinoxidáza, HGPRT - hypoxantinguaninfosforibosyltransferáza, TPMT - thiopurinmethaltransferáza, DPK - dofosfátkináza, RR - ribonukleotidreduktáza 18
Obr. 2: Ukázka analýzy standardu 6-methylmerkaptopurinu (a) a reálného vzorku (b). 19
Obr. 3: Ukázka analýzy standardu IMP (a), reálného vzorku od zdravého dobrovolníka (b) a pacienta s deficitem ITPázy (c). * jsou nečistoty z ITP. 20