Diagnostika a léčba DMP

Diagnostika a léčba DMP Viktor Kožich Martin Hřebíček Ústav dědičných metabolických poruch 1.LF UK a VFN Praha

Patofyziologie metabolitů u DMP substrát <1500 Da vedl.produkt >1500 Da produkt 1 2 3

Kategorie DMP-příklady Malá molekula Komplexní molekula Hromadění substrátu Chybění produktu Aminoacidopatie Hyperamonemie Org.acidurie Glykogenosy Poruchy BOX MK Poruchy synthesy kreatinu Lysosomální nemoci CDG syndromy Generalisované peroxisomální nemoci

Otázky ke zkoušce Vyšetřovací metody u DMP. Novorozenecký a selektivní screening v ČR Léčba DMP malých molekul-principy a příklady Léčba DMP komplexních molekulprincipy a příklady.

Osnova Diagnostika obecně Novorozenecký screening Selektivní screening Léčba

Proč je třeba znát diagnosu? Vysvětlení klinických příznaků Omezení úzkosti a nejistoty Prevence zbytečných dalších vyšetření Prevence dalších komplikací Zahájení léčby Stanovení rizika pro příbuzné probanda

Diagnostika verifikace hypothes pacient http://farm1.static.flickr.com/21/100467846_832c312de1_o.gif

Diagnostika DMP je genetické testování

Genetiké testování Selektivní screening Celopopulační screening

Screening To screen= prosévat Screening= identifikace osob se zvýšeným rizikem nemoci Diagnosa se ověřuje jinými nezávislými metodami

zdraví falešné nálezy pacienti

Úrovně diagnostiky

Úspěšná diagnostika DMP + Vědoucí lékař(ka) Dostupný laboratorní test 3.bp.blogspot.com/.../s320/physicianatdesk.jpg

Genetické testování Selektivní screening Celopopulační screening

Novorozenecký screening

Novorozenecký screening Aktivní vyhledávání nemocí v celé populaci, presymptomatická diagnostika Sensu stricto- laboratorní analysa suchých krevních skvrn Zakladatel-Prof. Robert Guthrie 1916-1995

JMG Wilson and G Jungner: Principles and Practice of Screening for Disease, WHO 1968

Klasická kritéria pro screening Nemoc je důležitá a častá Latentní fáze, kdy je nemoc bezpříznaková Průběh nemoci a mechanismy jsou známé Spolehlivý test Test je populací akceptovatelný Hledání pacientů musí být kontinuální proces Přijatelná léčba Podmínky pro diagnostiku a léčbu Konsensus o tom, kdo má být léčen Náklady dg a léčby musí být ekonomicky vyvážené v systému zdravotní péče

Jak se rozhodnout, které nemoci se mají screenovat?

Prospěch versus riziko USA: prospěch postiženého dítěte a znalost diagnosy Evropa: poškození rodin u falešně pozitivních nálezů nebo nemocí s nejasnou prognosou/léčbou

Newborn Screening: Toward a Uniform Screening Panel and System Michael S. Watson, PhD, Marie Y. Mann, MD, MPH, Michele A. Lloyd-Puryear, MD, PhD, Piero Rinaldo, MD, PhD, and R. Rodney Howell, MD, editors Genet Med 2006:8(5,Supplement):1S 11S The Maternal and Child Health Bureau commissioned the American College of Medical Genetics to outline a process for the standardization of outcomes and guidelines for state newborn screening programs and to define responsibilities for collecting and evaluating outcome data, including a recommended uniform panel of conditions to include in state newborn screening programs. The expert panel identified 29 conditions for which screening should be mandated. An additional 25 conditions were identified because they are part of the differential diagnosis of a condition in the core panel, they are clinically significant and revealed with screening technology but lack an efficacious treatment, or they represent incidental findings for which there is potential clinical significance. The process of identification is described, and recommendations are provided.

Frekvence Časné klinické projevy Max. 700 bodů Závažnost nemoci Prospěch léčby-pacient Prospěch léčby-rodina Prevence úmrtí

Sensitivita a specifita testu Vlastnosti testu Max. 700 bodů

Existence léčby Cena léčby Účinnost léčby Potvrzení diagnosy Akutní léčba Jednoduchost léčby Max. 700 bodů

Max. 2100 bodů

81 nemocí 1 29 nemocí 2 25 nemocí http://www.bioethics.gov/images/new_born_screening.gif

34 44 44 45 50 53 35 51 50 32 41 47 46 37 29 29 41 48 40 DC 51 13 31 45 35 33 36 29 50 41 48 31 45 33 45 48 52 31 31 35 54 49 32 50 49 24 31 31 46 4 9 51 52 32 52 52 31 30 NS USA-2009

Evropa 0-29 nemocí

Screenované nemoci ČR 10/2009 ~1:2 900 Kumulativně 1:1 200 ~1:4 000 ~1:4 000

Jak správně odebírat správné sušení 3 hod, ne přímé teplo, pokoj.t, bez kontaktu denní odesílání vzorků!!!!!!! http://cms.ich.ucl.ac.uk/website/imagebank/images/neonatal_appendix.gif

Proč je důležitý správný odběr?

Tandemový hmotnostní spektrometr (MS/MS)

Pacienti s DMP Nemoc Selektivní screening (odhad/rok/ ČR) Pilotní studie ÚDMP (2001-2008, n=98 039) Celá ČR 2010 (n= 117 705) Celá ČR 2011 (n= 108 673) PKU/HPA (15-20) 15 18 19 MCAD deficit 0-1 2 10 3 LCHAD deficit 0-1 3 0 2 GA I 0-1 0 2 0 leucinosa 0-1 0 1 0 VLCAD 0-1 0 0 1 Ostatní (IVA, CPTI, CACT, CPTII) 0-1 0 0 0 Celkem 15-25 20 31 25

Informace pro rodiče www.novorozeneckyscreening.cz

Genetické testování Selektivní screening Celopopulační screening

Selektivní screening Klinický výběr pacientů je klíčovou komponentou selektivního screeningu

Klinický obraz DMP-věk http://www.hrr.co.uk/acatalog/crocodile_toddler.jpg http://www.co.shasta.ca.us/html/dss/images/fosterparentingadopt/infant.jpg http://markandrich.googlepages.com/old-woman.jpg/old-woman-full.jpg

Klinický obraz DMP-orgány http://universe-review.ca/i10-82-organs.jpg

Klinický obraz-multisystémovost http://www.istockphoto.com/file_thumbview_approve/5982111/2/istockphoto_5982111-human-internal-organs.jpg

Základní situace s dif dg. DMP Malé molekuly akutně nemocný novorozenec (opakovaná) ataka dlouhotrvajícího bezvědomí neprospívání kojence těžší PMR/epilepsie/tonusové změny Velké molekuly progredující postižení CNS a svalstva dysmorfie obličeje organomegalie (játra, slezina, srdce)

Signály možnosti DMP Rodinná anamnesa: konsanguinita, podobný průběh nemoci u příbuzných, neobjasněné úmrtí příbuzných Onemocnění považované původně za běžné neodpovídá na standardní léčbu Multisystémové onemocnění Průběh nemoci ovlivněný zevními faktory/potravou katabolismus hladovění příjem proteinů nebo cukrů (galaktosa, fruktosa) Nevysvětlitelné laboratorní odchylky při běžných vyšetřeních Podklad y- Dr.D.Behulová

Potrava a DMP malých molekul (Sub)akutní toxicita mléko (laktosa)-hepatopathie sacharosa/fruktosa/sorbitol- hepatopathie a hypoglykemie bílkovinná strava- zvracení, letargie, koma (poruchy cyklu močoviny, organické acidurie) MCT oleje- porucha srdečního rytmu (poruchy betaoxidace MK) Hladovění a DMP ketotická hypoglykemie u glykogenos hypoglykemie se sníženou tvorbou ketolátek (poruchy beta-oxidace MK) metabolické koma (MAc nebo hypermamonemie) při katabolismu/hladovění

Indicie DMP při běžných laboratorních vyšetřeních moči a likvoru Vyšetření moči Abnormální zápach Abnormální zbarvení Krystalurie ph moči Ketolátky Kyselina močová Myoglobin Vyšetření likvoru Glukosa Celková bílkovina Laktát

Selektivní screening Jeden metabolit Profil metabolitů= metabolomika

http://www.surlalunefairytales.com/illustrations/cinderella/images/hall_cinderella.jpg

http://2.bp.blogspot.com/_lgbf1vcdeqw/sh2egb6e8bi/aaaaaaaaf50/tjlencqeu8o/s400/popelka.jpg

http://ustl1.univ-lille1.fr/chimie/html/enseignement/ate_web/chrom/tswett_final.jpg

HPTLC- oligosacharidy v moči Foto Dr.Ledvinová

Deficit a L- iduronidasy Foto Dr.Ledvinová (excretion of dermatan sulphate/ds and heparan sulphate/hs )

AMA- citrulinemie pacient kontrola

Komplexní směsi-obtížná detekce http://www.surlalunefairytales.com/illustrations/cinderella/images/hall_cinderella.jpg http://2.bp.blogspot.com/_ndsioeq29im/thgz8dhnaki/aaaaaaaacwi/mbo0743ibkq/s1600/kym+hepworth,+mixed+beads.jpg

12,29 14,96 4,24 14,80 17,80 3,57 13,47 5,93 12,08 5,07 6,63 18,40 Voltage [mv] 10,64 14,70 6,64 12,28 13,80 5,86 14,81 3,26 6,61 7,21 7,77 10,36 11,51 18,39 13,72 10,63 12,08 14,00 14,70 Voltage [mv] 5,54 GC: methylmalonová aciduria 200 175 150 125 100 75 50 25 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 Time [min.] 350 300 250 200 150 100 50 13,72 13,81 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 Time [min.]

14,88 3,29 12,29 14,96 4,24 14,80 17,80 3,57 13,47 5,93 12,08 5,07 6,63 18,40 Voltage [mv] 10,64 14,70 5,12 5,94 18,47 18,69 Voltage [mv] 6,67 14,74 10,68 GC: deficit MCAD 250 200 150 100 12,28 12,33 13,76 13,85 50 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 Time [min.] 350 300 250 200 150 100 50 13,72 13,81 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 Time [min.]

Hmotnostní spektrometrie 1. rozměr MS LC GC www.nature.com/.../v2/n2/fig_tab/nrd1011_f5.html

Fragmentace http://www.ch.cam.ac.uk/staff/pics/es1.jpg

Sensitivita Alkaptonurie: 1-5 g homogentisátu /d Cystinurie: 1-5 g cystinu /d Moč-litry PKU: 0.1 g Phe /l krve 0.2 1 ml séra MCAD: C8 acylcarnitin 0.0001 g / l krve NS terč 0.003 ml krve

In vivo měření metabolitů Před léčbou Deficit kreatinu v mozku (MRS) Po léčbě

Vyšetřování metabolitů u DMP Specializované testy Obvykle nedostupné v rutinních laboratořích Většinou profilové analysy Většinou chromatografické techniky, potřebné je nákladné vybavení Metody pracné, řada in-house testů Komplexita interpretace (např. organické kyseliny), nutná specializace

Selektivní screening Enzymová aktivita Účinnost transporteru Množství enzymu? Lze použít ELISU?

Principy enzymologického vyšetření separace substrátu a produktu kvantifikace přírůstku či úbytku substrát* produkt* kofaktor změněný kofaktor kvantifikace přírůstku či úbytku

Stanovení enzymů u DMP Obvykle nutné buňky Leukocyty, fibroblasty Tkáně plodu a obalů plodu Techniky fluorimetrické a radiometrické (event. fotometrické), velký rozmach MS/MS Měřený parametr: úbytek substrátu nebo tvorba produktu změny kofaktoru

Typické výsledky enzymologie Postižení homozygoti jasně deficitní Heterozygoti: překryv Zdraví homozygoti: obvykle negausovské rozdělení aktivity v populaci

Selektivní screening Analysa DNA/RNA

http://openwetware.org/images/6/61/dna_sequencing.jpg

Next generation sequencing Sekvenování exomu je dostupné (1% z 3GB) Ceny klesají (cíl 1000 USD za genom) Analysa dat je největší úskalí

Next generation sequencing?? Nejistota o fenotypových dopadech pozorovaných alelických variant

Úspěšná diagnostika DMP + vědoucí lékař/ka dostupný laboratorní test 3.bp.blogspot.com/.../s320/physicianatdesk.jpg

http://unitedcaremedical.com/pharmacy_tech.gif

Léčba DMP substrát produkt

Léčba primárního defektu substrát 2 Transplantace buněk a orgánů 1 enzym transportér Genové manipulace produkt Enzymové manipulace

Genové manipulace Náhrada genu ADA deaminasa- léčba v 90.letech Inserční mutagenesa se vznikem leukemie u části pacientů Hledají se bezpečné virové vektory Ovlivnění exprese genů Malé molekuly (PBA, VPA ) Glukosa u pofyrií (exprese HO 1) Oprava mutace Pročtení se předčasným stopkodonem Antisense oligo pro poruchy sestřihu

Léčba zaměřená na enzym Substituce normálním enzymem Parenterální podávání Transport do cílového Imunitní odpověd-protilátky Cena a výroba Stabilizace mutantního enzymu Přirozené ligandy- kofaktory Umělé ligandy-malé molekuly (farmakologické chaperony) Slibný přístup k léčbě Erlandsen H and Stevens RC, The Structural Basis of Phenylketonuria. Mol Genet Metab. 1999 Oct; 68(2):103-125.

Enzyme supplementation therapy Enzymová substituční terapie Užití u nemocí (LSD)-rutinní i v testování M.Gaucher (glukocerebrosidasa) M.Fabry (alfa galaktosidasa A) M.Pompe (kyselá alfa glukosidasa) MPS I (alfa iduronidasa) MPS II (alfa iduronátsulfatasa) MPS VI (arylsulfatasa B) M.Niemann-Pick B (kyselá sfingomyelinasa) MPS IVA Wollmanova nemoc (kyselá lipasa) Výroba rekombinantních enzymů Genzyme, TKT, Biomarin, Shire, Inotech.

ERT u Gaucherovy nemoci Hromadění glukosylceramidu převážně v buňkách odvozených od makrofágů (Gaucherovy buňky) Léčba: endocytosa zprostředkovaná receptorem manosový receptor (makrofágy, endothelie, játra) není transport do mozku glukocerebrosidasa ošetřená exoglykosidasami (odstranění M-6-P) Enzym isolovaný z lidské placenty X recombinantní enzym (CHO cells) X recombinantní enzym v mrkvi

Přirozené kofaktory Většina vitaminů= prekursory kofaktorů Příklady použití BH4 u PKU Pyridoxin u deficitu CBA a OAT Riboflavin u deficitu ETF-DH Vit.B12 u cbla a cblb Ubichinon u defektů respiračního řetězce Mo-kofaktor in kombinovaného deficitu XO/SO http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/8/89/coenzyme.gif

Farmakologické chaperony Gregersen N J Inherit Metab Dis (2006) 29:456 470

Farmakologické chaperony Slibná oblast výzkumu Často kompetitivní inhibitory enzymů Efektivita t.č. většinou nízká M.Fabry, Gaucher - klinické zkoušky

High-throughput screening (HTS) malých molekul Knihovny stovky tisíc látek Knihovny schválených a běžně užívaných léků např. NINDS Assay Interakce s proteinem: fluorescence, absorbance, křivky tavení Funkční důsledky: enzymová aktivita, biologická assay Automatizace, miniaturizace http://bccg.burnham.org/hts/htsinstrumentation.aspx

Léčba primárního defektu substrát 2 Transplantace buněk a orgánů 1 enzym transportér Genové manipulace produkt Enzymové manipulace

Transplantace http://2.bp.blogspot.com/_uqbx13aymce/ta9ebolq_bi/aaaaaaaab3w/aj7yi-gu43o/s1600/allogenic.gif

Přenos hematopoetických kmenových bb Zdroj: kostní dřeň, pupečník Výhoda: přechod hematoencefalickou bariérou Nevýhoda: vysoká mortalita Lysosomální nemoci Mucopolysacharidosa I- dobrá responsivita MPS III není zpomalení progese u neurologických obtíží Krabbeho nemoc-slibné výsledky u časně diagnostikovaných pacientů (novoroz.screening New York) Peroxisomální nemoci X-ALD http://www.sflorg.com/sciencenews/images/imscn 060807_01_01.jpg

Přežívání u cerebrální formy X-ALD po přenosu hematopoetických kmenových bb Expert Review of Neurotherapeutics 2008, Vol. 8, No. 9, Pages 1367-1379

Transplantace orgánů Transplantace jater/hepetocytů GSD Poruchy cyklu močoviny Organické acidurie Transplantace ledvin Cystinosa Hyperoxalurie I M.Fabry Kombinovaná transplantace jater a ledvin Organické acidurie (zvl.mma) Hyperoxalurie I Transplantace srdce M.Fabry http://www.coldtruth.com/wp-content/uploads/2009/10/human-organ2.jpg

Léčba ovlivněním metabol.dráhy potrava 1 2 toxický prekursor substrát 3 toxický vedl. produkt netoxický produkt produkt 4

PAH PKU http://www.chemie.fu-berlin.de/chemistry/bio/aminoacid/gif/phe.gif

Děti cca 400 mg Phe/d Dospělí 800-1200 mg Phe/d

Substrát-redukující léčba Farmakologická modulace reakcí nad enzymovým blokem Příklady Nitison u tyrosinemie I a alkaptonurie Miglustat u LSD Metronidazol u propionové acidemie LNAA u PKU-kompetice o transportér

Léčba alkaptonurie a tyrosinemie I nitison (NTBC) http://www.natuurlijkerwijs.com/english/b4f4ca00.gif

Substrát-redukující léčba u M.Gaucher Miglustat (OGT 918, SC-48334, N- butyldeoxynojirimycin) Orálně aktivní aminocukr Inhibuje syntasu glukosylceramidu a synthesu glykosfingolipidů Střední koncentrace GM1 gangliosidu klesla o 38.5% po12 měsících léčby (p < 0.05) J. Clin. Invest. 103(4): 497-505 (1999) THE LANCET Vol 355 April 29, 2000.

Snížení toxicity hromaděných substrátů Méně toxické konjugáty Isovalerová acidemia-glycin Rozpustnější komplexy Cysteamin Fyzikálně chemické vlivy (moč) Alkalinizace Zvýšený přívod tekutin

Glycin u isovalerové acidemie http://img.medscape.com/fullsize/migrated/455/705/smj455705.fig1.gif

Dodání chybějícího produktu Přímo produkt blokované reakce Obohacování směsi AMK (Tyr u PKU) Glukosa u GSD Biotin u deficitu biotinidasy BH4 u defektů v synthese a recyklaci BH4 Distální obejití bloku Glukosa u poruch beta-oxidace MCT oleje u poruch beta.oxidace dlouhých MK Uridin u orotové acidurie Obohacování směsi AMK (Cys u deficitu CBS) Hemarginát u AIP

Léčba biotinem

MCT a mitochondrie MCT oleje Transport nezávislý na karnitinových transporterech Použití u defektů CARN a VLCAD

Léčba nespecifická systémová 1 Eliminace toxinů Hemodialysa Hemadsorption (výměnná transfuse) (peritoneální dialysa) 2 Obecná léčba Energie Hydratace Léčba infekce Atd.

Léčba poruchy cyklu močoviny CVVHD = continuous venovenous hemodiafiltration; HD = hemodiafiltration. Clay A S, Hainline B E Chest 2007;132:1368-1378 2007 by American College of Chest Physicians

Dědičné metabolické poruchy obvykle AR, GR substrát obvykle enzym klinicky variabilní produkt