MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2014 Daniela Petříková
Masarykova univerzita Lékařská fakulta Význam stanovení biochemických parametrů u septických stavů Bakalářská práce Obor zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D. Autor: Daniela Petříková Brno, duben 2014
Jméno a příjmení autora: Daniela Petříková Název bakalářské práce: Význam stanovení biochemických parametrů u septických stavů Pracoviště: Oddělení klinické biochemie FN Brno Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Miroslava Beňovská, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Bakalářská práce se zabývá stanovením biochemických parametrů u septických stavů. Septické stavy jsou významnou komplikací velké řady onemocnění u dospělých i dětí. Mezi nejvíce využívané parametry patří C-reaktivní protein, prokalcitonin a nově i presepsin. V teoretické části jsou zahrnuty poznatky o sepsi a jednotlivých parametrech. V praktické části byly změřeny hodnoty presepsinu u souboru pacientů z různých oddělení FN Brno. Tyto hodnoty byly porovnány s hodnotami a prokalcitoninu, které u těchto pacientů byly již dříve analyzovány. Klíčová slova: Presepsin,, Prokalcitonin, Sepse, PATHFAST Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Miroslavy Beňovské, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne...... (vlastnoruční podpis autora)
Tato práce vznikla za podpory projektu BiochemNet Vytvoření sítě pro podporu spolupráce biochemických pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických oborů v praxi (registrační číslo CZ.1.07/2.4.00/31.0133). Projekt je realizován v rámci Operačního programu vzdělávání pro konkurenceschopnost, který je spolufinancovaný z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu ČR.
Poděkování Touto cestou bych ráda poděkovala RNDr. Miroslavě Beňovské, Ph.D. za odborné vedení při psaní bakalářské práce, za věnovaný čas a za cenné rady. Za spolupráci děkuji panu primáři MUDr. Jiřímu Žurkovi, Ph.D. z Kliniky dětské anesteziologie a resuscitace. Také děkuji celému kolektivu laborantek z Oddělení klinické biochemie za jejich pomoc a trpělivost při sběru dat.
Použité symboly a zkratky PCT SIRS C-reaktivní protein Prokalcitonin Systemic inflammatory response syndrome Systémové zánětlivé odpovědi organismu MODS Multiple organ dysfunction syndrome Syndrom mnohočetného orgánového selhání TNF Tumor necrosis factor Faktor nádorové nekrózy IL-6 Interleukin 6 VAP Ventilator-associated bronchopneumonia S ventilátorem asociovaná pneumonie CD14 Cluster of differentiation 14 LPS LBP Lipopolysacharid Lipopolysaccharide binding protein Lipopolysacharidy vázající protein TLR4 Toll-like receptor 4 TRACE POCT Time-Resolved Amplified Cryptate Emission Point of care testing Testování v místě péče o pacienta ECLIA Electro-chemiluminiscence immunoassay Elektrochemiluminiscenční imunoanalýza SOFA Sepsis-related organ failure assessment
Obsah 1. Cíle a hypotéza... 11 1.1 Cíle práce... 11 1.2 Hypotéza... 11 2. Sepse... 12 2.1 Definice sepse... 12 2.2 SIRS... 12 2.3 Stádia sepse... 13 2.4 Etiologie sepse... 15 2.4.1 Patogeneze sepse... 15 2.4.2 Původci a zdroje sepse... 16 2.5 Markery sepse... 17 2.5.1 C-reaktivní protein... 17 2.5.2 Prokalcitonin... 18 2.5.3 Presepsin... 19 2.5.4 Interleukin-6... 22 2.5.5 Lipopolysacharidy vázající protein... 23 2.6 Diagnostika sepse... 23 2.6.1 Klinické parametry... 23 2.6.2 Laboratorní parametry... 24 2.7 Porovnání parametrů... 26 2.7.1 Porovnání PCT a presepsinu... 26 2.7.2 Porovnání a PCT... 27 3. Praktická část... 29 3.1 Přístrojové vybavení... 29 3.1.1 PATHFAST... 29 3.1.2 Cobas 8000... 30 3.2 Principy stanovení a referenční rozmezí sledovaných parametrů... 30 3.2.1 Stanovení Presepsinu... 30 3.2.2 Stanovení... 31 3.2.3 Stanovení PCT... 31 3.2.4 Referenční rozmezí... 32 3.3 Opakovatelnost a mezilehlá přesnost... 32 3.4 Sběr dat a popis souboru... 34
3.5 Postup stanovení presepsinu... 35 3.5.1 Kalibrace a QC... 35 3.5.2 Postup měření Presepsinu... 36 3.6 Výsledky... 37 3.6.1 Kazuistiky... 37 3.6.2 PCT, a presepsin při přijetí... 45 3.6.3 Statistické vyhodnocení... 47 4. Diskuze... 52 5. Závěr... 54 6. Seznam použité literatury... 55 7. Přílohy... 59
Úvod Septické stavy jsou významnou komplikací velkého množství onemocnění u pacientů v dětském i dospělém věku. Touto problematikou se zabývají lékaři napříč velkým množstvím medicínských oborů a snaží se najít vhodný marker pro diagnostiku a monitorování sepse. V laboratorní diagnostice nejčastěji využíváme stanovení C-reaktivního proteinu a prokalcitoninu, v literatuře se stále popisují nějaké nové parametry. V současné době je velmi diskutovaným parametrem presepsin. Hlavním cílem této bakalářské práce je porovnat běžně stanovované parametry, kterými jsou a PCT s presepsinem. 10
1. Cíle a hypotéza 1.1 Cíle práce: 1. Sumarizovat současné poznatky o septických stavech včetně informací o biochemických parametrech využívaných při diagnostice a prognóze sepse 2. Zvládnout metodiky stanovení presepsinu, prokalcitoninu a 3. U pacientů vybraných z databáze OKB FN Brno stanovit presepsin 4. Získané výsledky statisticky zpracovat, porovnat a vyhodnotit diagnostické a prognostické vlastnosti sledovaných parametrů 1.2 Hypotéza: Na základě výsledků stanovení presepsinu a prokalcitoninu je možné přispět k určení diagnózy a prognózy u pacientů v septickém stavu. 11
Teoretická část 2. Sepse 2.1 Definice sepse Sepse je obranný mechanismus, který má za cíl eliminovat zdroj infekce a zabránit jejímu šíření. V některých případech může dojít k zánětlivému procesu i na nepostižených orgánech. To může vést k rozvoji orgánové dysfunkce a v konečném důsledku k porušení integrity orgánových funkcí s následkem smrti nemocného [2]. Sepse je automaticky spojována s mikroby, ale toto slovo vzniklo ještě dříve, než došlo k porozumění nemocem, které mají mikrobiální původ. Slovo sepse pochází z řeckého slova sepsios, které lze přeložit jako shnilý, prohnilý nebo rozklad [1]. V minulosti vznikla řada definic sepse. To vedlo k terminologické nejednotnosti, která zhoršovala diagnostiku jednotlivých stádií sepse. V roce 1992 dospěla konsenzuální konference v USA k definici SIRS (syndrom systémové zánětlivé odpovědi) a stádií sepse, která jsou uznávána v současné době. Sepse se definuje jako systémová odpověď na infekci [3]. Sepsi je možné definovat i jako specifický typ SIRS (musí být splněna dvě či více níže zmíněných kritérií SIRS), kdy je možné dokázat invazi patogenních nebo potenciálně patogenních mikroorganismů v normálně sterilní tkáni, tekutině nebo tělesné dutině hostitele. Pokud má pacient známky infekce, ale nesplňuje kritéria SIRS, o sepsi se nejedná [1, 32]. 2.2 SIRS SIRS je syndrom systémové zánětlivé odpovědi organismu. SIRS vzniká jako odpověď organismu na různé škodliviny. Tyto škodliviny mohou mít původ vnitřní nebo zevní. Mezi zevní noxy patří faktory fyzikální (mechanické, tepelné, radiační), chemické (toxiny organického a anorganického původu) nebo biologické (bakterie, viry, plísně, houby). Příkladem vnitřních nox jsou tkáňové nekrózy, trombózy, ischemické a hemoragické tkáňové infarzace apod. [1]. Definice SIRS vznikla, aby bylo možné definovat nespecifickou reakci infekčního nebo neinfekčního původu. SIRS je potvrzena, pokud jsou splněna dvě nebo více z následujících proměnných: teplota více než 38 C nebo méně než 36 C tepová frekvence nad 90/min 12
dechová frekvence nad 20/min nebo pco2 pod 32 mmhg množství leukocytů nad 12 000/µl nebo pod 4 000/µl 000/ nebo více jak 10% nezralých forem [4-5] [4 2.3 Stádia sepse Vznikly dva možné způsoby dělení stadií sepse. Starší způsob dělení stádií sepse vznikl v roce 1979. Siegel a Cerra definovali čtyři stádia sepse na základě současného sledování hemodynamických a biochemických změn. Pokud bereme v úvahu především klinické parametry, průběh sepse se dělí na tři stádia. Toto dělení vzniklo v roce 1992 na konsenzuální konsenzuální konferenci v USA. Stádia sepse podle Consensus Conference (1992): (1992) sepse těžká sepse septický šok [3] Sepse je syndrom systémové zánětlivé odpovědi v přítomnosti nebo jako důsledek předpokládané nebo nebo prokázané infekce [6]. Těžká sepse má příznaky znaky jako u sepse (dvě či více výše zmíněná kritéria SIRS a dokázaná invaze mikroorganismů) mikroorganismů) společně se změnami chování a/nebo a/nebo vědomí vědomí.. Dále jsou tu příznaky dysfunkce nebo hypoperfúze orgánů, hypotenze, laktátová acidóza, oligurie, pokles počtu dysfunkce krevních destiček. Obrázek č. 1: SIRS, sepse, těžká sepse, septický šok [6] 13
Septický šok má příznaky uvedené v předchozích dvou skupinách. Je považován za součást těžké sepse a vzniká její další progresí. Hypotenze však nereaguje zvýšením krevního tlaku na vybalancované doplnění objemu kolující tekutiny a příznaky hypoperfúze orgánů trvají [3, 32]. Při rozhodování, o které stádium sepse se jedná, můžeme použít následující tabulku: Tabulka 1: Stadia sepse podle Consensus Conference, USA 1992, [3] Příznak sepse těžká sepse septický šok alterace chování/vědomí - + + horečka > 38,3 C nebo hypotermie < 36 C + + + tachypnoe > 20/min nebo pco 2 < 4,3 kpa + + + tachykardie > 90/min + + + leukocyty > 12x10 9 /l nebo < 4x10 9 /l nebo + + + > 10% tyčkových forem dysfunkce nebo hypoperfúze orgánů - + + hypotenze - + + reakce hypotenze na doplnění objemu tekutin + - Stádia sepse podle Siegela a Cerry: stadium A stadium B stadium C stadium D Pro stadium A je charakteristický zvýšený příjem kyslíku a tvorba laktátu. Ke zvýšené tvorbě laktátu přispívá blok glykolýzy na úrovni pyruvátu, i když je kyslík dostupný. Laktát je játry využíván ke glukoneogenezi, a proto nedochází k laktátémii. Lipolýza zatím probíhá, organismus využívá jako zdroj energie β-oxidaci a produkci ketolátek. Tvorba močoviny je zvýšená, ale katabolismus a negativita dusíkové bilance je v normě. Acidobazická rovnováha je víceméně normální. Množství triacylglycerolů nestoupá, ale preventivně můžeme podávat tukové emulze, které pak můžou být energeticky využity. Ve stadiu B je snížený příjem kyslíku tkáněmi. Díky nedostatečnému zpracování laktátu játry dochází k hyperlaktátémii. Klesá lipolýza, snižuje se produkce ketolátek i β-oxidace a tuky nemůžeme využít jako zdroj energie. Přívod tukových emulzí není možní kvůli zvýšenému množství triacylglycerolů. Pro glukoneogenezi jsou využívány aminokyseliny vzniklé při katabolismu bílkovin z tkání. Tento proces se nazývá septický autokanibalismus. Stoupá množství vylučované urey až na 800-1100 mmol/den, je zvýšená negativita dusíkové bilance. Pokud dojde ke zkatabolizování 40% bílkovin myokardu, hrozí srdeční selhání. Vzniká metabolická acidóza a respirační alkalóza, která přechází v respirační acidózu, není-li pacient uměle ventilován. Srdeční frekvence, kontraktilita myokardu i srdeční minutový objem se zvyšuje, ale klesá odpor v periferním cévním řečišti. 14
Ve stadiu C a stadiu D dochází k poklesu středního arteriálního tlaku a tento pokles vede až k multiorgánové dysfunkci a selhání organismu [3]. Tabulka 2: Dělení sepse (podle Siegela a Cerry) [3] Stadium A kompenzovaná sepse Stadium B metabolická insuficience Stadium C respirační insuficience Stadium D kardiální insuficience Stresová odpověď jako po traumatu nebo po větší operaci. Zvýšený srdeční výdej, frekvence a kontraktilita. Zvýšená spotřeba kyslíku. Bez metabolických abnormalit. Hyperdynamický oběh zvýrazněn. Klesá extrakce kyslíku, není pokryta potřeba periferie. Metabolická acidóza. Vývoj hypotenze při normálním či zvýšeném srdečním výdeji. Další pokles arteriálního vaskulárního tonu. Respirační insuficience. Hypotenze se prohlubuje. Klesá srdeční výdej a kontraktilita. Městnání v malém oběhu. Krytí potřeb periferie dále zhoršeno. 2.4 Etiologie sepse Sepse je reakce organismu na infekci. V případě normální reakce imunitního systému dochází ke zničení patogenů, ale sepse vzniká právě díky tomu, že jsou tyto běžné reakce nevhodně regulovány [26]. 2.4.1 Patogeneze sepse Na počátku infekce, kdy se mikroby začínají množit, jsou zánětlivé změny jen lokální a aktivují se imunitní mechanismy. To, jak se bude infekce dále rozvíjet, závisí na mnoha okolnostech, např. genetických faktorech (ovlivňují tvorbu a hladinu cytokinů IL-1, IL-6, IL- 10 a TNF), léčbě (steroidy, cyklosporinem A), věku pacienta a dietě. Pokud se v časné fázi zánětu objeví silná odpověď v podobě tvorby cytokinů, aktivují se dostatečně rychle a intenzivně makrofágy a granulocyty, které mikroby z větší části fagocytují a zničí. V pozdní fázi zánětu je pak v krevním systému jen malé množství mikrobů, hladina cytokinů se snižuje a k sepsi nedochází. Mikroby jsou z cirkulace postupně odstraněny systémem mononukleárních fagocytů. Pokud nedojde k dostatečně silné cytokinové reakci na počátku infekce, aktivace makrofágů a stimulace granulocytů je nedostatečná, značná část mikrobů v cirkulaci zůstává a dochází k jejich pomnožení. V pozdní fázi zánětu koluje v krvi velké množství mikrobů, organismus na to reaguje zvyšujícími se hladinami cytokinů a objevuje se syndrom systémové odpovědi na zánět [28]. Zánětlivá odpověď je blízce spjatá s koagulačním systémem. Oba systémy se spojují na endoteliální buňce. Působením prozánětlivých cytokinů na endoteliální buňky dojde k uvolnění tkáňového faktoru. Tkáňový faktor aktivuje faktor VII a dojde k uvolňování destičky aktivujícího faktoru. Faktor VII je spouštěč koagulace zevní cestou. Za normálních okolností je koagulace regulována, ale u sepse jsou hladiny látek, které inhibují prokoagulační 15
enzymy sníženy. Tyto inhibitory se starají o to, aby koagulace probíhala jen v místě poranění endotelu. Inaktivace nebo nedostatečný účinek inhibitorů koagulace vede ke vzniku mikrotrombů, které se mohou šířit do vzdálených orgánů a způsobit jejich dysfunkci až selhání [1]. Obrázek č. 2: Vztahy SIRS, infekce a sepse a jejich hlavní příčiny [3] 2.4.2 Původci a zdroje sepse To, jak se bude infekce rozvíjet, závisí na původci infekce a jeho množství v organismu, na místě, kde infekce pronikla a na stavu obranyschopnosti organismu. Mezi nejčastější původce sepse ze skupiny gramnegativních bakterií patří: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiela pneumoniae, salmonely, enterobaktery, meningokoky a bakterie rodu Proteus. Z grampozitivních bakterií jsou nejčastějšími původci koaguláza negativní stafylokoky a enterokoky. Méně častými původci jsou viry, houby, prvoci a spirochety. Někteří pacienti léčení cytostatiky a imunosupresivy mohou také být ohroženi kandidovou sepsí [29, 33]. Nejčastější zdroje sepse jsou: centrální žilní katétr, plíce, břicho (tlusté střevo), močový trakt, měkké tkáně, rány a další. Plíce jsou ohroženy vznikem VAP (s ventilátorem asociovaná pneumonie), riziko vzniku stoupá s délkou intubace. Po chirurgickém zákroku hrozí infekce ran povrchových (kůže a podkoží), hlubokých a infekce tkání nebo orgánů při přítomnosti implantátů [33]. 16
2.5 Markery sepse Mezi biochemické markery, které se v současnosti nejvíce využívají při diagnostice sepse patří: C-reaktivní protein, prokalcitonin, presepsin, interleukin-6 a lipopolysacharidy vázající protein. 2.5.1 C-reaktivní protein C-reaktivní protein patří mezi reaktanty akutní fáze. Poprvé byl objeven Tilletem a Francisem v roce 1930 v séru nemocných s pneumokokovou pneumonií. Jeho název vznikl právě díky schopnosti precipitace s tzv. C-polysacharidem pneumokoků [9]. Molekula má cyklickou strukturu, skládá se z pěti podjednotek a 206 aminokyselin. Molekulová hmotnost je 118 kda. Pozice v elektroforeogramu je v β-globulinové frakci. Gen pro se nachází na dlouhém raménku 1. chromosomu. Syntéza probíhá v játrech (hepatocytech) i na jiných místech organismu např. v endotelu nebo v lymfocytech, kde je důležitá stimulace prozánětlivými cytokiny, zejména interleukinem 6 za spolu působení interleukinu 1 [10]. Biologickou funkcí je odstranění látek, které by mohly působit jako alergeny. Váže se na endogenní i exogenní ligandy (např. mikroorganismy), na vlastní poškozené buňky a jejich produkty, aby mohlo dojít k jejich odstranění. Eliminaci těchto látek, po opsonizaci, zajistí komplement a fagocytóza [35]. Referenční rozmezí: 0,0-5,0 mg/l. Vzestup od 6 hodin po zánětlivém stimulu, v průběhu 24-48 hodin dochází k maximální reakci na zátěž. Jeho hodnota může dosáhnout až mnoha set mg/l. K nejvýraznějším změnám hladiny dochází při bakteriální infekci, u virových infekcí je vzestup hladiny relativně malý. reaguje i na jiné typy zátěže např.: chirurgický zákrok, poranění, infarkt myokardu apod. [8]. K indikacím stanovení patří např.: včasná diagnostika bakteriálních infekcí novorozence sledování průběhu bakteriální infekce odlišení bakteriálního a virového zánětu včasný záchyt hnisavých komplikací po operaci odlišení bakteriálního zánětu močových cest od pyelonefritidy sledování průběhu a aktivity revmatických chorob a maligních onemocnění změna antibiotik při přetrvávajících vysokých hladinách [7] 17
V diagnostice se využívá dynamika změn v závislosti na stavu, rozsahu a průběhu zánětlivé reakce. Hladina odráží aktivaci cytokinové kaskády. Je to citlivý, ale nespecifický marker, ke stimulaci stačí malá zánětlivá reakce. Hladiny 3. a 5. den po operaci jsou považovány za prognostický faktor z hlediska ohrožení septickou komplikací. Očekává se pokles hladiny 5. den po operaci [11]. splňuje požadavky kladené na biomarker díky těmto jeho vlastnostem: je stabilní a snadno stanovitelný s možností automatizace jsou definovány jeho biologické vlastnosti-senzitivita a specifičnost rychlý nárůst hladiny při vzniku a rychlý pokles při útlumu zánětu [10] Nevýhodou je jeho nízká specifita. Informuje pouze o přítomnosti infekce, ne o stupni orgánového zatížení [9]. 2.5.2 Prokalcitonin Prokalcitonin se v poslední době začíná využívat ve výzkumu i klinické praxi jako reaktant akutní fáze. Je to bílkovina složená ze 116 aminokyselin a jeho molekulová hmotnost je 13 kda [13]. Obrázek č. 3: Prokalcitonin [16] V roce 1975 byly objeveny intracelulární prekurzory kalcitoninu a jeho štěpné produkty, kam patří i PCT. Struktura PCT jako glykoproteinu byla objasněna až v roce 1981. První zmínka o využití PCT v akutní medicíně je z roku 1993, kdy byly zaznamenány jeho vysoké hodnoty u septického pacienta. V roce 1994 byl za hlavního stimulátora sekrece označen bakteriální endotoxin. V roce 2000 byl nalezen zdroj syntézy v játrech [12]. 18
Rozlišujeme zánětlivý a nezánětlivý PCT. Oba kóduje stejný gen a mají i stejnou strukturu, ale liší se místem vzniku. Prokalcitonin, který vzniká v těle fyziologicky a je prekurzorem kalcitoninu je tvořený v C buňkách štítné žlázy. Není detekovatelný v krvi. Zánětlivý prokalcitonin je tvořen extratyroidálně (játra, plíce, ledviny ) a není konvertován na kalcitonin. I když je zánětlivý PCT tvořen v játrech nebo ledvinách, jeho hladina nekoreluje s biochemickými ukazateli jaterní nebo ledvinné insuficience. Syntéze je stimulována zejména bakteriálním endotoxinem, pravděpodobně prostřednictvím cytokinů (IL-6, IL-1, TNF-α) [14, 16]. Referenční rozmezí PCT je do 0,5 ng/ml. Hladina PCT reaguje na zánětlivé agens během 2-3 hodin a maxima dosahuje za 6-12 hodin po reakci na endotoxin [12, 15]. Tabulka 3: Rozsah hodnot PCT a jejich vztah ke klinickému stavu [14] Koncentrace PCT [ng/ml] do 0,5 Interpretace pro dospělé a děti starší 48 hodin Zdravá populace 0,5-2,0 Lokalizovaná infekce, virová, mykotická infekce, chronický zánět, SIRS 2,0-10 Systémová bakteriální infekce, intenzivní nebakteriální SIRS nad 10 Těžká sepse, multiorgánové selhání V diagnostice se PCT využívá při diferenciální diagnostice zánětlivých onemocnění a horeček neznámého původu. Využíváme ho k monitorování kriticky nemocných. Kontrolujeme terapii a průběh bakteriálních infekcí, hodnotíme prognózu pacientů. Pomáhá při rozhodování, zda pokračovat nebo nepokračovat v podávání antibiotik. U novorozenců dochází po porodu k vzestupu PCT s maximem za 24 hodin a během 48 hodin hladina klesá na obvyklé hodnoty [11]. 2.5.3 Presepsin Presepsin je fragment CD14 (viz pozn. 1), který se nachází na N-terminální sekvenci CD14. Je to polypeptid s molekulovou hmotností 13 kda. Poprvé byl definován v roce 2005. Provedené studie ukazují, že se hladina presepsinu zvyšuje v plazmě s bakteriální infekcí. Vysoké hladiny presepsinu se nacházejí u septických pacientů i pacientů s těžkou sepsí [17;24]. Poznámka 1: Zkratka CD neboli cluster of differentiation je označení pro transmembránové bílkoviny, které produkují vysoce specifické protilátky proti některým proteinům. Nazývají se CD znaky. V diagnostice se využívá toho, že některé CD znaky jsou natolik specifické pro jednotlivé typy buněk, že je můžeme využít k vyhledávání a značení těchto buněk [18]. 19
CD14 je glykoprotein, který je vyjádřený na membránovém povrchu monocytů a makrofágů. Slouží jako receptor pro komplexy lipopolysacharidů (LPS) a LPS vazebného proteinu (LBP) [19]. V případě produkce presepsinu in vivo je mnoho aspektů, které zůstávají neznámé a jsou založené na výsledcích pokusů na zvířatech [24]. Ke vzniku presepsinu dochází po navázání komplexu LPS a LBP na CD14. Tím se aktivuje toll-like receptor 4 (TLR4). Po aktivaci TLR4 se spouští specifická prozánětlivá signalizační kaskáda, která spouští zánětlivou reakci proti infekčnímu agens. Zároveň po aktivaci prozánětlivé signalizační kaskády je komplex LPS-LBP-CD14 uvolněn do krevního oběhu. CD14, který je uvolněn do krevního oběhu, je označován jako rozpustný CD14 (scd14). V krevním oběhu dochází ke štěpení komplexu LPS-LBP-CD14 plazmatickými proteázami (například cathepsinem D) a vzniká rozpustný CD14 podtyp (scd14-st) což je presepsin, který stanovujeme [21]. Obrázek č. 4: Mechanismus sekrece presepsinu [20] Hladina presepsinu se zvyšuje během 2 hodin a maxima dle autora dosahuje za 3 hodiny. Doporučuje se, aby si každá laboratoř určila své vlastní referenční hodnoty. Hodnoty presepsinu se zvyšují podle individuální imunitní odpovědi organismu a různé klinické situace, a proto by se měly pro hodnocení stavu pacienta používat i ostatní laboratorní nálezy. Podle studie uvedené v návodu od firmy Mitsubishi Chemical Medience Corporation je cut-off hodnota pro rozlišení zdravého pacienta od pacienta se sepsí 337 pg/ml. Tyto výsledky 20
byly získány z analýzy provedené u 119 vzorků EDTA plazmy zdravých jedinců. Hodnoty presepsinu byly v rozmezí 60-365 pg/ml (viz. obrázek 5) [22]. Obrázek č. 5: Distribuce presepsinu u normálních jedinců [22] Tabulka 4: Hodnoty presepsinu a diagnóza [23] Presepsin pg/ml Diagnóza < 200 vyloučení sepse 200-300 nepravděpodobná systémová infekce 300-500 možná systémová infekce (sepse) 500-1000 střední riziko progrese systémové infekce, zvyšující se riziko nepříznivého výsledku 1000 vysoké riziko progrese systémové infekce V diagnostice se presepsin využívá k rozlišení bakteriální a nebakteriální infekce. V případě bakteriální infekce však nelze rozlišit, zda původce patří do skupiny gram negativních nebo gram pozitivních bakterií. U pacientů s virovou infekcí zatím zvýšená hladina presepsinu nebyla prokázána. Měření koncentrace presepsinu je důležité k posouzení závažnosti infekce a monitorování klinické odpovědi organismu [25]. 21
Hodnoty presepsinu můžeme využít k určení prognózy. U pacientů s podezřením na sepsi je nejvyšší riziko úmrtnosti do 30 dnů. Byla provedena Kaplan-Meierova analýza přežití do 30 dnů po přijetí do nemocnice a bylo zjištěno, že pacienti s hodnotou presepsinu >1858 pg/ml mají riziko úmrtnosti >60%. Pokud je hodnota v dolním kvartilu je riziko nižší [22]. Obrázek č. 6: Prognostická váha presepsinu [22] 2.5.4 Interleukin-6 Interleukin-6 patří mezi prozánětlivé cytokiny. Cytokiny jsou různorodá skupina bílkovinných mediátorů zánětlivé odpovědi. Je pro ně charakteristická rychlá tvorba po různých stimulech a krátký poločas [1]. Interleukin-6 je glykoprotein s molekulovu hmotností 22-29 kda. Je produkován více typy buněk, kam patří T-lymfocyty, B-lymfocyty, endoteliální buňky, makrofágy, lymfocyty. Jeho syntéza je stimulována cytokiny (TNF-α, IL-1 ) a virovými nebo bakteriálními součástmi jako jsou například lipopolysacharidy. V případě infekce a poškození tkáně je produkován časně. IL-6 indukuje syntézu proteinů akutní fáze v hepatocytech (, fibrinogen, α 1 - antitrypsin a komplement), proliferaci a aktivaci B- a T-lymfocytů a zvyšuje aktivitu NK-buněk [27]. IL-6 má maximum nástupu syntézy za 1,5-3 hodiny. Uplatňuje se v patogenezi nádorových onemocnění (mnohočetný myelom) a některých chronických zánětlivých onemocnění (revmatoidní artritida). Je to dominantní cytokin z hlediska klinického využití. V diagnostice využíváme toho, že jeho hladiny za 48 hodin korelují s mortalitou pacienta. 22
Je rozhodující pro indukci syntézy a proto o několik hodin předchází vzestup. Jeho hladina u septických stavů stoupá úměrně s vývojem závažnosti sepse. IL-6 má důležitou diagnostickou úlohu při průkazu neonatální infekce a sepse, kdy ještě nemusí být plně rozvinuta odpověď proteinů akutní fáze. Jako ukazatel závažnosti a prognózy SIRS se používá poměr IL-6 a protizánětlivého IL-10. Zvýšené koncentrace IL-6 a naopak snižující se koncentrace IL-10 (stoupající poměr IL-6/IL-10) jsou považovány za parametr rozvoje MODS (syndrom mnohočetného orgánového selhání). To znamená špatnou prognózu vzhledem k přežití. Hladina IL-6 je snížena při léčbě kortikosteroidy [3, 11]. 2.5.5 Lipopolysacharidy vázající protein Lipopolysacharidy vázající protein (LBP) je rozpustný protein akutní fáze o molekulové hmotnosti 65 kda. Pochází převážně z jater a jeho plazmatická koncentrace se zvedá po zánětlivém podnětu, mezi které můžeme zahrnout i bakteriální sepsi. Váže se na lipopolysacharidy (LPS) a prezentuje je receptorům CD14 na monocytárních buňkách. Při přítomnosti LBP se cytokiny uvolňují při nižších koncentracích než při jeho nepřítomnosti. Z toho vyplývá, že funkcí LBP je zvýšit schopnost organismu detekovat LPS již na začátku infekce. I když je LBP potřeba pro indukci zánětlivé odpovědi, není potřeba k odstranění LPS z oběhu. LBP hraje dále roli v opsonizaci gram-negativních bakterií. Vazba LBP na lipid A, který je součástí gram-negativních bakterií, vede k jejich opsonizaci. V séru zdravých jedinců je koncentrace LBP 5-20 µg/ml. Při akutní odpovědi organismu se koncentrace zvyšuje až na hodnoty kolem 200 µg/ml. [31, 38]. 2.6 Diagnostika sepse V diagnostice sepse má kvůli včasnému nasazení antibiotické léčby důležitou roli čas. Podle definice uvedené výše by měla být diagnostika snadná. U sepse by měla být přítomna dvě a více kritérií SIRS a přítomnost infekce. Ne každý pacient má klasické příznaky jako jsou změny v tělesné teplotě, leukocytóza a tachykardie. Příznaky sepse jsou nespecifické a mohou se objevit i u úrazů, popálenin a srdečního selhání [1]. 2.6.1 Klinické parametry Tělesná teplota je snadno dostupný a měřitelný údaj. U sepse může být teplota zvýšená i snížená. Zvýšená teplota je první známkou infekce a je to reakce na uvolňování mikrobiálních produktů nebo průnik živých bakterií do oběhu. Za zvýšenou teplotu u sepse je zodpovědný TNF-α (Tumor necrosis factor- α), který pak stimuluje syntézu IL-6. 23
Tepová frekvence je nespecifický příznak. Tachykardie, která se objevuje u sepse a SIRS se vyskytuje u celé řady dalších nemocí [1]. 2.6.2 Laboratorní parametry Mezi mikrobiologická laboratorní vyšetření patří: hemokultury, sputum, stěr z rány a moč na kultivaci. Hemokultura je považována za zlatý standard mezi diagnostickými metodami sepse. Je to mikrobiologické kultivační vyšetření krve na přítomnost bakterií. Pacientovi se odebírají dva vzorky krve o objemu 10 ml. Jeden vzorek je pro aerobní a druhý pro anaerobní kultivaci. Je důležité, aby odběr proběhl před podáním antibiotik. Vzorky se pak vloží do přístroje, kde je udržována stálá kultivační teplota 37 C. V přístroji vzorky zůstávají obvykle 5 dní. Pokud jsou v krvi bakterie, provedeme následná kultivační vyšetření k určení přesného agens [25, 30, 33]. Mezi hematologická laboratorní vyšetření patří: vyšetření krevního obrazu a koagulace Zvýšení leukocytů je běžným příznakem infekce, ale není pro ni zcela specifické. Při sepsi dochází k aktivaci koagulace. Klesá hladina inhibitorů koagulace, u těžké sepse je v 90% snížená koncentrace proteinu C. Koagulační parametry se spíše než k diagnóze využívají ke sledování závažnosti stavu pacienta [1, 33] Mezi biochemická laboratorní vyšetření patří: C-reaktivní protein, prokalcitonin, Na, K, urea, kreatinin, glykémie, jaterní testy, krevní plyny včetně ph, laktát a v některých laboratořích se stanovuje také IL-6, presepsin a LBP. C-reaktivní protein je dnes nejčastěji využívaným markerem u pacientů s podezřením na sepsi. Bývá zvýšený i u mnoha neinfekčních stavů jako jsou malignity, úrazy, infarkty nebo pooperační stavy. Pro stanovení můžeme využít sérum i plazmu. Dříve se ke stanovení využíval latexový aglutinační test nebo radiální imunodifúze, ale tyto testy jsou již zastaralé, málo citlivé, semikvantitativní a výsledky jsou ovlivněné subjektivním hodnocením. Dnes se nejvíce využívá imunoturbidimetrie, imunonefelometrie a chemiluminiscenční analýza. [1, 34] Prokalcitonin je v současnosti nejspecifičtější rutinně používaný marker pro sepsi. Hodnoty PCT dosahují obrovského rozmezí a korelují se závažností septických stavů. Hladina PCT po úspěšném chirurgickém zákroku nebo změně antibiotik rychle klesá. Stanovení se provádí v séru nebo plazmě. Při stanovení se využívá imunoanalytických principů, kdy spolu reaguje antigen a specifická protilátka za vzniku imunokomplexu. První protilátku používanou ke stanovení PCT připravila firma BRAHMS (Henningsdorf, Německo). PCT bylo možno nejprve stanovit na stolním luminometru, později na analyzátorech KRYPTOR pomocí technologie TRACE (Time-Resolved 24
Amplified Cryptate Emission), za kterou byla v roce 1987 firmě udělena Nobelova cena za chemii. Stanovení PCT můžeme provádět na POCT analyzátorech i na polo- či plně automatizovaných analyzátorech. Dostupným POCT analyzátorem je PCT-Q test od firmy BRAHMS, který provádí semikvantitativní stanovení, kde podle intenzity vzniklého zbarvení určíme množství PCT. Obrázek č. 7: Možnosti stanovení prokalcitoninu [36] Firma BRAHMS protilátku ke stanovení PCT prodala firmě Roche, která se postarala o rozšíření stanovení PCT na automatických imunoanalyzátorech. V současné době existuje řada komerčně dostupných diagnostických souprav. Polo- či plně automatizované analyzátory, na kterých může být stanoveno PCT vyrábí tyto firmy: Roche, Siemens, Brahms, BioMérixeu, DiaSorin, Olympus [1, 36, 37]. Presepsin se stanovuje v plazmě nebo plné krvi. Pro měření využíváme přístroj PATHFAST od firmy Mitsubishi Chemical, který dodává firma Medesa. Principem je enzymová chemiluminiscenční imunoanalýza. Presepsin se využívá v diagnostice a prognóze sepse, k určení stupně ohrožení u septických pacientů [20]. Plazmatické hladiny IL-6 poměrně dobře korelují s výsledkem léčby u kriticky nemocných. Cytokiny mají zvýšené hladiny také u řady jiných onemocnění, jako jsou úrazy, chirurgické výkony, srdeční selhání atd. Na trhu jsou minimálně dva výrobci souprav pro stanovení IL-6 v uzavřených systémech a to firma Siemens Healthcare Diagnostic se soupravou Immulite 2000 a firma Roche se soupravou Elecsys IL-6. Souprava Elecsys IL-6 využívá pro stanovení metodu ECLIA (Electrochemiluminiscence immunoassay), která je založena na elektrochemiluminiscenci s použitím biotinylované monoklonální specifické protilátky, monoklonální specifické protilátky značené rutheniovým komplexem a mikročástic potažených streptavidinem. Immulite 2000 využívá metody chemiluminiscence [1, 8, 11, 34]. 25
Stanovení LBP můžeme provádět ze séra i plazmy. Pro stanovení se používá metoda ELISA (Enzym Linked-Immunosorbent Assay) s jamkami mikrotitrační destičky potaženými monoklonální protilátkou proti lidskému LBP. Napipetujeme vzorek a v průběhu inkubace je LBP (antigen) zachycen protilátkou navázanou na povrchu jamky. Nenavázaný materiál je odstraněn. Poté je přidána enzymově značená protilátka specifická proti LBP a vzorek se opět inkubuje. Enzym ze značené protilátky katalyzuje přeměnu substrátu, který je přítomný v reakční směsi na barevný produkt. Pro zjištění koncentrace měříme spektrofotometrem absorbanci při 450 nm [39]. 2.7 Porovnání parametrů Pro diagnostiku sepse v současné době neexistuje ideální marker, proto měříme několik parametrů najednou, abychom získali co nejefektivnější data. Tabulka č. 5: Porovnání v čase [8, 12, 22] Parametr Vzestup Vrchol 6 h 24-48 h PCT 2-3 h 6-12 h Presepsin 2 h 3 h 2.7.1 Porovnání PCT a presepsinu Hodnoty PCT a presepsinu byly změřeny u 140 pacientů, kteří byli přijati na pohotovost a jako kontrolní skupina byla vybrána skupina 119 zdravých osob. Stanovení hladin proběhlo při přijetí, po 24 hodinách a po 72 hodinách. Studie se zaměřila na diagnostickou účinnost parametrů a na monitorování průběhu onemocnění po podání léku. Při studii diagnostické účinnosti PCT a presepsinu byla průměrná hodnota presepsinu u zdravých jedinců 159 pg/ml, u septických pacientů 2563 pg/ml. Hodnoty PCT dosahovaly významného rozdílu mezi pacienty se sepsí, těžkou sepsí a septickým šokem. Rozlišovací schopnost presepsinu byla ještě lepší a více odpovídala klinickému stavu. Studie se zaměřila také na to, zda je u septických pacientů možné určit efektivitu terapie, která byl použita při přijetí, podle hodnot presepsinu a PCT. Všichni pacienti s diagnostikovanou sepsí dostali mikrobiální léčbu. U 104 pacientů (z celkového počtu 140 pacientů) došlo ke snížení hodnot obou parametrů (modrá linie) a terapie tedy byla správná. Ve skupině 36 pacientů, u kterých podané léky nezabraly (červená linie), oba parametry stoupaly. Vzestup byl výraznější u presepsinu [19]. 26
Obrázek č. 8: Monitorování onemocnění [19] Popis grafu: Dynamika hodnot presepsinu a PCT po podání léčby skupině 140 pacientů. Správná terapie vedla ke snížení hodnot u 104 pacientů (modrá linie). Při nesprávné terapii došlo ke zvýšení hodnot u 36 pacientů (červená linie) Výsledky studie ukazují, že presepsin je slibný parametr pro monitorování závažnosti onemocnění a stanovení prognózy. Hodnoty PCT se zvyšují i u pacientů se SIRS, ale presepsin se zvyšuje jen u septických stavů [19, 24]. 2.7.2 Porovnání a PCT je parametr citlivý, ale nespecifický. Ke zvýšení dochází při lokalizované infekci, sepsi, virových infekcích i po operaci. Dynamika jeho změn je rychlá. V grafu můžeme vidět, 27
že dosahuje vysokých hodnot i při nízké zátěži. Stav pacientů byl hodnocen podle SOFA skóre (sepsis-related organ failure assessment). SOFA skóre je systém pro odhad a hodnocení orgánové dysfunkce [3, 40]. Obrázek č. 9: Koncentrace dle závažnosti sepse [40] Prokalcitonin se specificky nezvyšuje pouze u systémové infekce, ke zvýšení může dojít i u jiných klinicky významných diagnóz, ale hodnoty jsou jen lehce nad 0,5 ng/ml. Obrázek č. 10: Koncentrace PCT dle závažnosti sepse [40] PCT má lepší rozlišovací schopnost než jiné reaktanty akutní fáze včetně. Podle počtu selhávajících orgánů reaguje na závažnost stavu. Je to vhodný parametr pro zpřesnění diagnózy při nesrovnalostech mezi klinickým stavem a hodnotami. PCT má lepší kinetiku, reaguje rychleji než. Hladina PCT se využívá při rozhodování o antibiotické léčbě [3, 40]. 28
3. Praktická část 3.1 Přístrojové vybavení V rámci zpracování bakalářské práce jsem pracovala s analyzátorem PATHFAST a Cobas 8000. 3.1.1 PATHFAST Stanovení presepsinu jsme prováděli na imunoanalyzátoru PATHFAST od firmy Mitsubishi Chemical. Velikost a hmotnost toho analyzátoru umožňuje jeho využití v laboratořích, ordinacích i nemocnicích. Systém PATHFAST kombinuje přesnost plnohodnotného analyzátoru s flexibilitou POCT (point of cate testing) zařízení. Poskytuje rychlé výsledky a je snadno ovladatelný. Vyšetření můžeme provádět z plné krve, plazmy nebo séra. Na analyzátoru je možné stanovení i jiných parametrů než je presepsin. Je to například stanovení myoglobinu, D-Dimerů, CK-MB, ctni, NTproBNP, hs a HCG. Obrázek č. 11: Přístroj PATHFAST 29
Tabulka č. 6: Technická specifikace přístroje PATHFAST Typ přístroje Stolní imunoanalyzátor Počet vzorků Až 6 vzorků na jedno měření Doba měření 17 minut Typ materiálu Plná krev, plasma Reakční teplota 37,5 C Objem vzorku 100 µl Vlnová délka 300-650 nm Kalibrace 2-bodová, každé 4 týdny Princip Analyzátor PATHFAST pracuje na principu chemiluminiscence s patentovanou technologií Magitration. Tato technologie umožňuje stanovení malých koncentrací analytu s vysokou přesností. 3.1.2 Cobas 8000 Cobas 8000 je modulární analytický systém od firmy Roche Diagnostics. Podle potřeb jednotlivých laboratoří je možné jednotlivé moduly variabilně skládat a měnit. Důležitým prvkem každého systému je tzv. Core modul, jehož součástí je vstupní jednotka, výstupní jednotka a obslužný systém pro dopravu stojánků k modulům. Dále jsou k dispozici ISE moduly, 3 druhy modulů pro klinickou biochemii (c 701, c 702, c 502) a modul pro heterogenní imunoanalýzu e 602. ISE jednotka má 3 indikační elektrody Na, K a CL. Výkon ISE jednotky je až 300 vzorků/hod. (900 testů/hod). 3.2 Principy stanovení a referenční rozmezí sledovaných parametrů 3.2.1 Stanovení Presepsinu Princip testu je založen na nekompetitivní chemiluminiscenční enzymové imunoanalýze (CLEIA) s MAGITRATION technologií. MAGITRATION je technologie separace, při které jsou magnetické kuličky promývány v pipetovací špičce. Vzorek se inkubuje s polyklonální protilátkou proti presepsinu, která je značená alkalickou fosfatázou (ALP) a magnetickými kuličkami, které jsou potažené monoklonální protilátkou proti presepsinu. Presepsin ze vzorku vytvoří imunokomplex s enzymově značenou protilátkou a protilátkou na magnetických kuličkách. Pomocí MAGITRATION technologie se odstraní nenavázané protilátky a přidá se chemiluminiscenční substrát. Po krátké inkubaci dojde k enzymové reakci, která generuje luminiscenční záření. Intenzita luminiscence se měří při 461 nm. Intenzita luminiscence odpovídá koncentraci presepsinu ve vzorku. 30
Obrázek č. 12: Princip stanovení presepsinu [20] 3.2.2 Stanovení Na oddělení klinické biochemie FN Brno je analyzátor Cobas 8000 vybaven dvěma moduly c 702. Jedná se o fotometrický modul s výkonem až 2000 testů/hod. díky zdvojenému pipetování vzorku. Zdroj světla je halogenová lampa a detekce probíhá na detektoru diodového pole s využitím dvanácti vlnových délek. Vzorkové i reagenční pipetory mají detekci hladiny, detekci sraženiny a detektor nárazu do dna. Každý pipetor má svoji mycí stanici. Reakční teplota je 37 ± 0,1 C a je udržována cirkulující vodní lázní. Pro měření je nutný minimální objem 100 µl. Míchání vzorku zajišťují bezkontaktní ultrazvuková míchadla. Stanovení na modulu c 702 probíhá imunoturbidimetricky. Latexové částice jsou potažené protilátkou proti. Tyto částice aglutinují s lidským ze vzorku a vzniknou aglutináty, které stanovujeme turbidimetricky při vlnové délce 800/570 nm. Reakční čas je 10 minut. Obrázek č. 13: Schéma turbidimetru [19] M-monochromátor, D-detektor 3.2.3 Stanovení PCT Stanovení PCT se provádí na modulu e 602 přístroje Cobas 8000. Dvě měřící komory umožňují výkon až 170 testů/hod. Aby nedošlo ke kontaminaci, při pipetování se používají jednorázové špičky. Ty jsou vybaveny detekcí sraženiny, hladinovým senzorem a detekcí pěny. Špičky jsou využívány i k míchání vzorku. Reakční teplota je 37 ± 0,3 C. 31
Ke stanovení se používá elektrochemiluminiscence. Jedná se o sendvičový princip. V průběhu první inkubace se vytvoří sendvičový komplex reakcí antigenu ze vzorku s biotinylovanou monoklonální protilátkou proti PCT a monoklonální protilátkou proti PCT značenou rutheniovým komplexem. Druhá inkubace proběhne po přidání mikročástic potažených streptavidinem. Komplex vzniklý první inkubací se váže na mikročástice. Vzniká interakce mezi biotinem a streptavidinem. Následuje promytí s odstraněním nenavázaných složek reakční směsi. Přidá se tripropylamin (substrát), který reaguje s rutheniovým komplexem značené protilátky z vytvořeného komplexu. Vložením napětí na elektrodu se spustí reakce a dojde k vyzáření fotonu. Signál se změří fotonásobičem. 3.2.4 Referenční rozmezí Pro vyhodnocení výsledků jsme využili následující referenční hodnoty: Tabulka č. 7: Referenční rozmezí Parametr Referenční rozmezí Rozsah měření 0-5 mg/l 0,3-350 mg/l, při vyšších hodnotách ředění 1:2 PCT 0-0,5 ng/ml 0,2-100 ng/ml, při vyšších hodnotách ředění 1:4 Presepsin 0-337 pg/ml 20-20000 pg/ml 3.3 Opakovatelnost a mezilehlá přesnost Vzhledem k tomu, že se stanovení presepsinu ve FN Brno běžně nevyužívá, bylo u této metody nutno změřit opakovatelnost a mezilehlou přesnost. Parametry a PCT jsou rutinně používané metody a proto jsou sledovány v rámci pravidelné verifikace. Pro statistické vyhodnocení je vhodné použít 20 analýz a více. Kvůli omezenému množství a ceně testů, které jsme měli k dispozici, bylo k vyhodnocení opakovatelnosti a mezilehlé přesnosti využito 5 analýz kontroly 1 a 5 analýz kontroly 2. Obě kontroly jsou součástí setu ke stanovení presepsinu. Opakovatelnost se zjišťuje měřením v jedné sérii, jedním pracovníkem. My jsme 5x změřili kontrolu 1. Mezilehlá přesnost se zjišťuje postupným měřením v průběhu několika pracovních dnů. Při měření se střídá několik pracovníků. Pro měření mezilehlé přesnosti jsme použili kontrolu 2. Měření probíhalo po jednom až několika týdnech. 32
Tabulka č. 8: Opakovatelnost a mezilehlá přesnost Měření Kontrola 1 [pg/ml] Měření mezilehlé Kontrola 2 [pg/ml] opakovatelnosti přesnosti 1 669 1 2161 2 653 2 2278 3 664 3 1930 4 686 4 1987 5 659 5 1954 Průměr 666,2 Průměr 2062 Rozmezí 33 Rozmezí 348 Směrodatná odchylka Variační koeficient % 12,56 Směrodatná odchylka 1,89 Variační koeficient % 150,97 7,32 Použité vzorce: Průměr ( ) je součet všech hodnot (x i ) dělený počtem měření (n). = Σ (xi)/n Rozmezí je rozdíl mezi největší a nejmenší hodnotou. Směrodatná odchylka je druhou odmocninou rozptylu. s = (s 2 ) 1/2 Rozptyl je součet čtverců rozdílu naměřených hodnot od průměru dělený počtem měření zmenšený o 1. s 2 = Σ (x i ) 2 /n-1 Variační koeficient (CV) vyjadřuje poměr směrodatné odchylky a aritmetického průměru. Uvádí se v procentech. CV (%) = 100. s/ 33
3..4 Sběr dat a popis souboruu Sběr dat a vzorků probíhal ve FN Brno na Oddělení klinické biochemie. Nejdříve bylo nutno od FN Brno získat souhlas se sběrem dat. Vzorky pacientů jsme sbírali od října do prosince roku 2013. Zpracovávali jsme plasmu s heparinátem lithným, což je materiál vhodný pro presepsin, a PCT. Ze studovaných parametrů se na OKB běžně stanovuje jen a PCT. Jak již bylo zmíněno v teoretické části, pro diagnostiku sepse je vhodnější PCT než a proto jsme i pacienty vybírali podle koncentrace PCT. Koncentrace PCT a byla u většiny vzorků již zanalyzována a doměřovala se jen v několika případech. Celkový soubor tvoří 69 pacientů z FN Brno a díky spolupráci s Klinikou dětské anesteziologie a resuscitace jsme získali výsledky, PCT a presepsinu od 19 dětí. Získaný soubor výsledků z Kliniky dětské anesteziologie a resuscitace obsahoval jen malé množství stanovených PCT, protože se totoo stanovení tak často nevyužívá. Ze všech naměřených hodnoty byla vytvořena tabulka, která je uvedena v příloze 1. Hodnoty presepsinu jsme stanovili u 97 vzorků z FN Brno, z toho 4 vzorky patřily dětským pacientům. U vybraných pacientů jsme sledovali vývoj jejich onemocnění a proto se u nich presepsin stanovoval několikrát v průběhu hospitalizace. Koncentraci presepsinu jsme u některých pacientů změřili jen jednou a to z důvodu ukončení hospitalizace nebo pokud již nebyl ordinován prokalcitonin. V grafu je znázorněno procentuální zastoupení diagnóz, které byly stanoveny při přijetí do nemocnice. Ve sledovaném souboru pacientů bylo nejčastější onemocnění gastrointestinálního traktu. Na druhém místě jsou onkologická onemocnění, jejichž průběh bývá komplikován septickými stavy. Velký podíl dále tvoří onemocnění plic, různá poranění a sepse jako diagnóza při příjmu. Obrázek č. 14: Graf zastoupení diagnóz u pacientů v septickém stavu či s podezřením na sepsi Diagnóza při přijetí 17% 6% 14% 8% poranění, úrazy onemocnění srdce onemocnění GIT 21% 12% 22% septické stavy onkologická onemocnění onemocnění plic jiné 34
3.5 Postup stanovení presepsinu Presepsin jsme stanovovali soupravou PATHFAST Presepsin od firmy Mitsubishi Chemical, která obsahuje reagencie kalibrátory i kontroly kvality. 3.5.1 Kalibrace a QC Před začátkem měření je potřeba ověřit platnost kalibrace. Provedení kalibrace je nutné při použití nového lotu nebo po vypršení lhůty, která je u PATHFAST Presepsin čtyři týdny. Na přístroji si musíme nejprve nastavit analýzu ke kalibraci. 1. Registrace master křivky: Při zavedení nové analýzy nebo nového lotu musí být v přístroji zaregistrována master křivka. Registrace master křivky se provádí načtením čárového kódu z MC ENTRY CARD. Obrázek č. 15: Čárový kód z MC ENTRY CARD nutný k instalaci nové šarže na přístroji PATHFAST 2. Příprava reagencií: Kalibrátor CAL-1 je připraven k použití. Kalibrátor CAL-2 je lyofilizovaný a před použitím se rozpouští diluentem. Rozpuštěný kalibrátor je pak stabilní 24 hodin při 2-8 C a 6 měsíců při teplotě -20 C a nižší. 3. Příprava reagenčních kazet: Do stojanu přístroje se vloží reagenční kazety a do nich se napipetuje 100 µl kalibračního roztoku. Oba kalibrátory se musí stanovit v duplikátu. Společně s kalibrátory se měří i kontrola. K dispozici máme kontrolu 1 pro nižší hladiny a kontrolu 2 pro vyšší hladiny. 35
4. Start kalibrace: Do přístroje vložíme stojan s reagenčními kazetami a jednorázové špičky. Stiskneme tlačítko START. 5. Výsledky: Po dokončení kalibrace proběhne tisk výsledků. 3.5.2 Postup měření Presepsinu Nasbírané vzorky jsme před měřením museli nechat rozmrazit, protože byly skladovány při -20 C. Po rozmražení jsme je promíchali a centrifugovali. 1. Příprava přístroje: Po zapnutí přístroje musíme 30 minut počkat, než se přístroj zahřeje. Zkontrolujeme, zda nejsou v odpadní nádobce použité špičky a případně je vysypeme. Vložíme do přístroje potřebné množství nových špiček. 2. Kontrola: Na začátku měření je potřeba nejprve změřit kontrolu, pokud neměříme vzorky ihned po provedení kalibrace. Kontrolní materiál jsme si předem připravili rozpuštěním v diluentu, rozpipetovali po 100 µl do ependorfek a zamrazili. Postup měření kontrolního materiálu je stejný jako u vzorku. 3. Příprava reagenčních kazet: Reagenční kazeta se zasune do stojanu, je nutné ji pevně přitlačit na místo. Do vzorkové jamky napipetujeme 100 µl vzorku a případně odstraníme bubliny. Po napipetování všech vzorků umístíme stojan do přístroje a uzavřeme přední kryt. 4. Start analýzy: Na přístroji stiskneme tlačítko START. Po spuštění analýzy zadáme do přístroje informace o vzorku. Vzorky můžeme načíst pomocí čtečky čárového kódu nebo je zadáme manuálně. 5. Konec analýzy: Po dokončení analýzy proběhne tisk výsledků. Z přístroje odstraníme použité špičky a reagenční kazety. Obrázek č. 16: Reagenční kazeta pro stanovení presepsinu [20] 36
3.6 Výsledky 3.6.1 Kazuistiky Při zpracování kazuistik jsme využili Laboratorní informační systém (LIS) a Nemocniční informační systém AMIS. Pacient č. 1, ročník 1976, byl hospitalizován s iontovou dysbalancí po úrazu hlavy a levé kyčle. Laboratorně se začaly objevovat známky sepse. Byla nasazena antibiotika a došlo k poklesu zánětlivých parametrů. Kultivace hemokultury byla pozitivní. Pacient byl vyléčen. Obrázek č. 17: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a u pacienta číslo 1 A) Koncentrace presepsinu [pg/ml] 1000 presepsin 800 600 400 200 presepsin 0 0 5 10 15 den hospitalitazace B) Koncentrace PCT [ng/ml] 300 PCT 250 200 150 100 50 PCT 0 0 5 10 15 den hospitalitazace 37
C) Koncentrace [mg/l] 400 300 200 100 0 0 5 10 15 den hospitalizace Pacient č. 2, ročník 1985, byl přijat do FN Brno s klíšťovou encefalitidou, která byla přeléčena antibiotiky. Pak došlo k rozvoji pravostranné hemiparézy a dalšímu zhoršení stavu. Došlo k rozvoji sepse, akutnímu selhání ledvin a bolesti břicha. Sepse vyústila až v septický šok. Opět byla nasazena antibiotika a došlo ke zlepšení stavu, ale ten byl komplikován recidivou těžké sepse, která postupně přešla až do multiorgánové dysfunkce. Pacient zemřel. Obrázek č. 18: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a u pacienta číslo 2 A) Koncentrace presepsinu [pg/ml] 25000 20000 Presepsin 15000 10000 5000 Presepsin 0 0 20 40 60 den hospitalizace B) Koncetrace PCT [ng/ml] 70 60 50 40 30 20 10 0 PCT 0 10 20 30 40 50 PCT den hospitalizace 38
C) Koncentrace [mg/l] 350 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 den hospitalizace Pacient č. 3, ročník 2010, byl přijat do dětské nemocnice po pokousání rotvajlerem. Měl četné rány na krku, prokouslou tracheu a frakturu obratlů. Došlo k masivnímu krvácení, ale nebyly zasaženy velké cévy. Byla nasazena antibiotika a pacient se vyléčil. Obrázek č. 19: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a u pacienta číslo 3 A) Koncentrace presepsinu [pg/ml] 800 600 Presepsin 400 200 Presepsin 0 0 2 4 6 8 den hospitalizace B) Koncentrace [mg/l] 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 den hospitalizace 39
Pacient č. 4, ročník 1953, byl přijat po pádu z výšky. Došlo k rozvoji tetraplegie. Stav pacienta byl velmi závažný. Rozvíjel se septický šok a multiorgánová dysfunkce. Pacient byl postižen kvasinkovou infekcí a musel podstoupit několik operací. Pacient je stále hospitalizován, ale zdravotní stav se zlepšuje. Obrázek č. 20: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a u pacienta číslo 4 A) Koncentrace presepsinu [pg/ml] 5000 Presepsin 4000 3000 2000 1000 Presepsin 0 0 50 100 150 den hospitalizace B) Koncentrace PCT [ng/ml] 350 300 250 200 150 100 50 0 PCT 0 10 20 30 40 PCT den hospitalizace C) Koncentrace [mg/l] 400 300 200 100 0 0 50 100 150 den hospitalizace 40
Pacient č. 5, ročník 1972, byl přijat pro jaterní selhání. Pak se začal rozvíjet septický šok. Dále byla diagnostikována bronchopneumonie a byla pozitivní kultivace hemokultury. Byla nasazena antibiotika. Pacient byl vyléčen. Obrázek č. 21: Vývoj koncentrace presepsinu, PCT a u pacienta číslo 5 A) Koncentrace presepsinu [pg/ml] 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Presepsin 0 5 10 Presepsin den hospitalizace B) Koncentrace PCT [ng/ml] 100 PCT 80 60 40 20 PCT 0 0 2 4 6 8 10 den hospitalizace C) Koncentrace [mg/l] 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 den hospitalizace 41