Základy hmotnostní spektrometrie Lenka Hernychová e-mail: hernychova@pmfhk.cz Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové
Historie Koichi Tanaka vyvinul MALDI techniku Tanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., Yoshida T.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151 Tanaka K. JB Fenn vyvinul ionizaci elektrosprejem Fenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64 Fenn J.B. Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie
Princip Hmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, která určuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty Přístroj se nazývá hmotnostní spektrometr Výsledkem je hmotnostní spektrum, které graficky znázorňuje závislost četnosti iontů na hodnotě m/z (efektivní hmotnost, m hmotnost iontu, z náboj iontu)
Princip MS vypovídá o primární struktuře analyzované látky (určuje aminokyselinovou sekvenci) Fragmentace iontů umožňuje získat podrobnější informace o struktuře látek Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace.) a může určit i místo modifikace Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13 C/ 12 C, 34 S/ 32 S, 18 O/ 16 O - kvantifikace
Princip Umožňuje analýzu komplexních směsí Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality Identifikaci proteinů Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby Možnost analýzy nekovalentních komplexů
Vlastnosti hmotnostní spektrometrie Citlivá Specifická Rychlá Jednoduchá interpretace dat
Popis přístroje Experimentální uspořádání 1. Iontový zdroj 2. Hmotnostní analyzátor 3. Detektor 4. Řídící počítač
Součásti MS systému Atmosphere Vacuum System Sample Inlet Ionisation Method Mass Analyser Detector Data System
MALDI-TOF hmotnostní spektrometry MALDI-TOF Voyager (Applied Biosystems) 4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems) Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)
Princip Ionizace 1.Měkké techniky ionizace Energetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá. 2. Tvrdé techniky ionizace Dodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.
Typy ionizace - nárazem elektronů (EI) -působením elektrostatického pole (FI, FD) - chemickou ionizací (CI) - nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB) - ionizací fotony - ionizací 252 Cf - elektrosprejem, termosprejem (ESI) - ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)
Hmotnostní analyzátory Umožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech. Typy analyzátorů Průletový analyzátor (TOF) Kvadrupólový analyzátor (jednoduché, trojnásobné) Iontová past Hybridní (Q-TOF, Q-trap, trap-tof, trap-icr, ) Tandemové (TOF-TOF, QQQ) FT- ICR MS, ORBITRAP
Detektor Poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Dělí se do dvou skupin 1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů (měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin) 2. Násobičové detektory využívají efekt násobení elektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)
Ionizace
MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Metoda využívá ionizace laserem pulsní technika -------- UV (N 2 ) IR (CO 2 ) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns) dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých) jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)
MALDI-TOF MS - ionizace MALDI destička Laser 1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) ausušen (vykrystalizován) na MALDI destičce AH 2. Laserový výstřel ionizuje molekuly matrice. 3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice: MH A M AH 20 kv Ground Variable Grid Grid
MALDI ionizace Měkká ionizace Malá nebo žádná fragmentace Jednou nabité ionty [MH] ; [M-H] - Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery Analýza komplexních sloučenin Rychlá příprava vzorku & analýza Tolerantní k detergentům a solím Jednoduchá interpretace dat Spojený s TOF analyzátorem
ESI - ionizace elektrosprejem Měkká ionizace Technika pro disperzi kapalin a aerosolů On-line spojení HPLC a hmotnostního spektrometru Vznik vícenásobně nabitých iontů [MzH] z,[mzh] z- Pro jeden analyt se ve spektru objevují série píků, které odpovídají iontům téže látky, o stejné molekulové hmotnosti M, s rozdílným počtem nábojů z. Výskyt iontů - aduktů analytu se sodnými ionty [MzNa] z a draselnými ionty [MzK] z (pokud je vzorek zasolený) Není tolerantní k detergentům a solím (před analýzou je nutné přečištění a odsolení vzorku) Spojení s různými typy analyzátorů
ESI MS intaktního proteinu
ESI - ionizace elektrosprejem Výhody Díky přítomnosti analytu ve více iontech srůzným nábojem lze snadno určit náboj iontů Nevýhody Snížení citlivosti díky rozdělení signálu mezi více píků a menší přehlednost spekter složitějších směsí.
Při ionizaci elektrosprejem probíhají čtyři základní procesy 1) vznik nabitých kapek na konci sprejovací kapiláry 2) zmenšování nabitých kapek v důsledku odpařování rozpouštědla a jejich opakovaný rozpad (Coulombické štěpení) 3) uvolnění iontů do plynné fáze z malých, vysoce nabitých kapek 4) sekundární děje, kterých se účastní ionty v plynné fázi
ESI - ionizace elektrosprejem - Sprejovací kapilára - - - - - - - - - - - - - - - - Taylorův kužel Coulombické štěpení Elektrony Oxidace - Zdroj vysokého napětí Elektrony Zmenšování kapek v důsledku odpařování rozpouštědel Redukce
Foto ESI Kapilára Vstup do MS
Hmotnostní analyzátory
TOF analyzátor Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu mají rychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu t = k ( m 1 /z - m 2 /z)
TOF analyzátor Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovém a PSD módu Lineární mód měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m) Reflektronový mód měření peptidů (dráha letu je prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m) Post-Source Decay (PSD) kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)
Průletový analyzátor (TOF) 15-25 kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů
Průletový analyzátor (TOF) 15-25 kv Letová trubice Detektor Zdroj iontů Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.
MALDI MS spektrum proteinů
Lineární mód Reflektronový mód
Charakteristika reflektronový mód Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm) Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol) Teoreticky neomezené rozmezí m/z Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra vjednom ionizačním pulsu
Tandemový hmotnostní spektrometr tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS), případně hmotnostní spektrometrie n-tého stupně (MS n ), slouží k bližší charakterizaci analyzované látky, např. určení aminokyselinové sekvence nebo lokalizace posttranslačních modifikací obsahují dva hmotností analyzátory sériově spojené kolizní celou v prvním analyzátoru dojde k rozlišení prekurzorových (mateřských) iontů a k výběru jednoho z nich tento prekurzor je podroben fragmentaci v kolizní cele a vzniklé produktové (dceřinné) ionty jsou rozlišeny v druhém analyzátoru
Příprava vzorků pro MS Předseparační techniky rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, caplc, MudPIT HPLC.) Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí
2D-PAGE a MALDI-TOF Postup přípravy vzorků Peptidové mapování Separovaný Protein Proteasa Proteolytické peptidy MALDI-TOF MS spektrum proteolyt. peptidů
Štěpení proteinů Enzymové proteolýza, nejpoužívanější enzym je trypsin Chemické nejsou běžné, používají se jako doplňkové např. BrCN - bromkyan se používá pro štěpení ve vodě nerozpustných nebo membránových proteinů Molekulová hmotnost vzniklých peptidů se pak měří na hmotnostním spektrometru
Proteolytické enzymy - proteázy Katalyzují exotermní hydrolýzu peptidových vazeb v proteinech a peptidech Výhody jejich použití vysoká specifita minimalizované vedlejší reakce dobrá účinnost štěpení Podmínky použití, důležité je dodržení: ph reakčního pufru poměru enzym/substrát teptoty doby inkubace pokud je to nutné provádí se: redukce disulfidových vazeb (např. DTT) alkylace reaktivních cysteinů (např. jodacetamid)
Proteolytické enzymy - proteázy Klasifikace proteinázy -působí na proteiny (nevyžadují přítomnost volných konců susbstrátů) peptidázy -působí na malé oligopeptidy (vyžadují alespoň jeden konec substrátu volný a to v blízkosti místa štěpení) endopeptidázy - katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb uvnitřřetězce a tvoří peptidy o různé délce exopeptidázy - katalyzují hydrolytické odštěpení koncové aminokyseliny N-koncové (aminopeptidázy) C-koncové (karboxypeptidázy)
Peptidázy Endopeptidázy se získávají: z orgánů trávicího traktu obratlovců (pankreas - chymotrypsin, trypsin, žaludek - pepsin) krve (thrombin) sleziny (kathepsiny) rostlinného materiálu (papain, ficain, bromelain) mikroorganismů (Glu-C, pronase, thermolysin) Exopeptidázy se získávají: pankreatu rostlin mikroorganismů
Tabulka enzymů a chemických látek používaných pro štěpení proteinů
Trypsin v proteomice nejpoužívanější serinová endopeptidáza štěpí v mírně alkalickém prostředí (ph 7.8) štěpí specificky peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, pokud nenásleduje prolin doba štěpení 4-24 hodin teplota při štěpení 37 C methylovaný trypsin štěpí 30 minut při 58 C poskytuje definované peptidové fragmenty dobře se ionizují výhodná velikost pro MS analýzu
Trypsin jeden z možných typů trypsinu je hovězí trypsin má Mw 24 kda, ph 9.4 trypsin je výhodný pro štěpení v polyakrylamidovém gelu, je schopný difundovat póry gelu k proteinu větší molekuly peptidáz nejsou schopny do gelu difundovat ze stérických důvodů vzhledem k vysoké specifitě štěpení jsou tvořeny databáze obsahující proteiny s teoretickými trypsinovými peptidy včetně jejich m/z hmotností využití k identifikaci proteinů metodou peptide mass fingerprinting (peptidové mapování) Nevýhody malá termostabilita (při vyšší teplotě klesá aktivita) autolýza (autolytické peptidy trypsinu ruší MS analýzu) štěpí pouze v optimálním ph Modifikace trypsinu (methylace, acylace) zabraňují jeho autolýze a termolabilitě.
Chymotrypsin serinová endopeptidáza někdy nahrazuje nebo doplňuje trypsin vhodný pro štěpení proteinů v roztoku i gelu specifita štěpení je na rozdíl od trypsinu nízká peptidovou vazbu štěpí na C-konci v místě: F (phenylalanin), Y (tyrosin), W (tryptophan), L (leucin), I (isoleucin), V (valin), M (methionin) pokud nenásleduje prolin
Glu-C serinová endopeptidáza produkt bakterie Staphylococcus aureus štěpí peptidové vazby na C-konci kyseliny glutamové případně kyseliny asparagové (3000x pomaleji) Lys-C serinová endopeptidáza produkt bakterie Lysobacter enzymogenes štěpí peptidové vazby na C-konci lysinu
Enzymatické štěpení vzorku Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidové vazby u kladně nabitých zbytků. Trypsin štěpí peptidové vazby od C-konce v místě argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin. -Phe-Trp -Met -Gly-Ala -Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys - Trypsin
Matrice Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N 2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpací rychlostí vakuového systému) Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, které zajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH 3 CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci
Vzorce a názvy matric
Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541
MALDI-TOF MS Výběr matrice Název matrice α-kyano-4-hydroxyskořicová kys. (CHC) Analyzovaná látka Peptidy, proteiny < 10 kda, karbohydráty, lipidy 3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová kys. (SA) 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) 3-hydroxypikolinová kyselina (3-HPA) Proteiny, peptidy > 10 kda, glykoproteiny Neutrální karbohydráty, syntetické polymery, peptidy, proteiny, glykopeptidy, lipidy, glykoproteiny Oligonukleotidy, glykoproteiny 3,4-dihydroxyskořicová kyselina (CA) Proteiny, oligonukleotidy
Interpretace spekter Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593] 100 1112.57 4.0E 90 80 70 1508.83 60 % Intensity 50 40 1337.66 1806.97 30 721.40 1032.59 20 1278.70 1718.91 2007.11 2299.22 10 874.52 1204.64 1381.70 1851.91 1095.54 1530.83 2310.25 0 0 700 1260 1820 2380 2940 3500 Mass (m/z)
Jaké hmotnosti můžeme změřit? Průměrná Vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení CH 3 Br = 12.01115 3*1.00797 79.90400 = 94.93906 Monoizotopická Součet přesných hmotností nejlehčích izotopů prvků CH 3 Br = 12.000000 3*1.007825 78.918336 = 93.941011
Jaké hmotnosti můžeme změřit? Průměrná Vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení CH 3 Br = 12.01115 3*1.00797 79.90400 = 94.93906 Monoizotopická Součet přesných hmotností nejlehčích izotopů prvků CH 3 Br = 12.000000 3*1.007825 78.918336 = 93.941011 Monoizotopická vs. Průměrná Mh M mono < M avg
Jaké hmotnosti můžeme změřit? Průměrná Vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení CH 3 Br = 12.01115 3*1.00797 79.90400 = 94.93906 Monoizotopická Součet přesných hmotností nejlehčích izotopů prvků CH 3 Br = 12.000000 3*1.007825 78.918336 = 93.941011 Monoizotopická vs. Průměrná Mh M mono < M avg Glukosa C6H12O6 Peptid: HLKTEAEMK M mono = 180.0633 M mono = 1085.55 M avg = 180.1576 M avg = 1086.28
Peptid: HLKTEAEMK M mono = 1085.55 M avg = 1086.28 Pro peptidy a proteiny je rozdíl mezi průměrnou a monoizotopickou hmotností kolem 0.06% Rozlišení hmotnostního spektrometru bylo 5 000. Pro malé peptidy je obvykle první pík izotopické obálky nejvyšší.
Izotopická obálka proteinu inzulin Izotopická obálka proteinu BSA M mono = 5803.64 M mono = 66 384 M avg = 5807.66 M avg = 66 427
Izotopická obálka proteinu inzulin Izotopická obálka proteinu BSA M mono = 5803.64 M mono = 66 384 M avg = 5807.66 M avg = 66 427 U velkých proteinů má izotopická obálka jiný tvar než u malých peptidů, nejintenzivnější píky jsou uprostřed. Monoizotopická hmotnost se určuje obtížně, je nutné použít přístroje s vysokým rozlišením.
Parametr hmotnostního analyzátoru Rozlišení Může mít hodnoty 1/R = 10 3 10 6 Vyjadřuje schopnost hmotnostního analyzátoru rozlišit blízké hodnoty m/z a) pro dva ionty: RP (resolving power) píky m 1 a m 2 mají 10% překryv při stejné výšce RP = m 1 /(m 1 -m 2 ) kdy z 1 a z 2 se rovnají jedné b) pro jeden ion: m/ m nebo t/2 t (u TOF) FWHM (full width at half maximum)
Iontová past < TOF < FT-ICR analyzátor R = 1 000 (modrá) R = 3 000 (červená) R = 10 000 (zelená) R = 30 000 (černá)
Přesnost určení hmoty Parametr hmotnostního analyzátoru Absolutní udává se v Daltonech (Da), hodnoty 0.1 0.0001 Relativní (mění se podle m/z) udává se v % nebo ppm (parts per million), hodnoty 100 0.1 ppm Vyjadřuje shodu mezi naměřenou m/z měřená a vypočtenou m/z teoretická hodnotou Výpočet: (m/z teoretická -m/z měřená )/m/z teoretická x 10 6
Přesnost určení hmoty Parametr hmotnostního analyzátoru Absolutní udává se v Daltonech (Da), hodnoty 0.1 0.0001 Relativní (mění se podle m/z) udává se v % nebo ppm (parts per million), hodnoty 100 0.1 ppm Vyjadřuje shodu mezi naměřenou m/z měřená a vypočtenou m/z teoretická hodnotou Výpočet: (m/z teoretická -m/z měřená )/m/z teoretická x 10 6 Příklad Naměřená hmotnost: 545.4200 Teoretická hmotnost: 545.3234 Relativní chyba: (545.3234-545.4200)/545.3234 = -0,00017714 Relativní přesnost = 177 ppm