o zjišťujeme u DN nalýza DN enetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální) Polymorfismy konkrétní mutace, které se vyskytují v populaci s frekvencí vyšší než 1% Podobnost DN mezi druhy Vlastnosti - koncentraci, čistotu, chemické vazby s proteiny, funkci DN izolace detekce DN specifické analýzy DN struktury hlavní metody pro práci s DN: PR sekvenace RFLP DN hybridizace - blotting PR polymerase chain reaction Nobelova cena za její objev v roce 1984 obdoba DN replikace, která se odehrává v buňkách amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DN u oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí cyklické střídání těchto teplotních kroků: denaturace dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (teplota; chemická činidla) annealing (anýlink) ke koncové oblasti vybraného úseku se naváží primery (oligonukleotidy jednovláknové řetězce; cca 20bp ) elongace prodloužení primeru vkládáním jednotlivých dnp (,,,) na základě komplementarity k templátové DN primer Princip PR PRINIP MEODY PR eplotní denaturace (1 MOLEKUL) DENURE 1. YKLUS PRIMERY nnealing primerů aq POLYMERÁZ Elongace (2 MOLEKULY) DENURE PRIMERY eplotní denaturace 2. YKLUS aq POLYMERÁZ nnealing primerů Elongace 3. YKLUS (4 MOLEKULY) DENURE PRIMERY aq POLYMERÁZ (8 MOLEKUL) 4. YKLUS (16 MOLEKUL) 5. YKLUS (32 MOLEKUL) 1
PR v reakci: templát (DN), aqpolymeráza (teplotně stabilní), primery, dnp (jednotlivé nukleotidy) a vhodný pufr z jednoho cílového lokusu pro dané primery vznikne po 1 cyklu denaturace, annealingu a elongace vždy dvojnásobek DN fragmentů (velikost fragmentu je dána primery) možno vyjádřit matematicky 2 n kde n je počet cyklů Kolik bude DN fragmentů po 8 PR cyklech? 2 8 = 256 Elektroforéza metoda, která slouží k rozdělení amplifikovaných DN fragmentů o nestejné délce DN má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě rychlost putování je závislá na její celkové délce gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody v gelu u záporné elektrody jsou jamky, do kterých se dává vzorek DN pustí se elektrický proud po čase se fragmenty rozdílných délek rozdělí vizualizace fragmentů se provádí například ethidiumbromidem (interkalačního činidla), které svítí v UV světle Sekvenace 3' 5' nalyzovaná DN (jednovláknová) 5' 3' Značený primer DN-polymerasa, primer, nukleotidy - rozdělení do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddnp: ddp, ddp, ddp, ddp Zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DN řetězce Při vhodných podmínkách sekvenační PR se syntetizují řetězce všech možných velikostí Fragmenty (řetězce) mají rozlišení ve své délce i o jeden nukleotid Sangerova metoda - chemicky modifikované dnp (deoxyribonukleosidtrifosfátů) na ddnp (dideoxyribonukleosidtrifosfáty), které postrádají 3'-OH skupinu; za ddnp si při elongaci už nemůže přisednout žádný normální nukleotid a dojde tedy k terminaci elongace PR syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddnp) ve směru 5' 3' Elektroforéza - Pro sekvenaci se do PR reakce dá: zkoumaný fragment DN, primer pro jedno vlákno DN, pufr, polymeráza a mix normálních dnp a odlišně fluorescenčně značených ddnp (detekce laserem) Elektroforetická detekce - sekvenace se odehrává ve 4 reakčních směsích (ddp; ddp; ddp; ddp); obvykle bývá radioaktivně značený primer, rozlišení fragmentů v gelu Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně: 5'- - 3' + Sekvence analyzované DN (komplementarita párování basí): 3'- - 5' Sekvenace - Sanger Restrikční endonukleázy - restriktázy začne probíhat sekvenační PR s mixem dnp a fluoresčenčně značenými ddnp Enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DN uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu (restrikční místo) např. Eco R1 restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci ^ nejkratší fragment ve schématu bude svítit červenou barvou a nejdelší také červenou speciální elektroforéza s laserovou detekcí fluorescenčně barvených ddnp 2
Identifikace restrikčních míst Na uvedeném vlákně najděte restrikční místa pro nabídnuté enzymy restrikční místo lu I / Sau 3I / Msp I / RFLP restriction fragment length polymorphism charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DN restriktázami jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty (variabilita restrikčních míst) každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy) Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů EcoRI štípání fragmentů 2 jedinců... 8 na elektroforéze bude mít druhý jedinec delší fragment RFLP restriction fragment length polymorphism Southern - blotting Jméno po objeviteli Southernovi; umožňuje z velkého množství fragmentů (např. po štěpení celkové DN restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DN fragment V doslovném překladu pijákování tzn. nasátí PR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza Hybridizace = spojení dvou jednovláknových DN podle pravidla komplementarity el se denaturuje v chemickém činidlu tím se denaturuje i dvouvláknová DN a na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna a to v takovém uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu Následuje hybridizace s radioaktivně značenou próbou membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DN Na základě komplementarity basí buď dojde/nedojde k hybridizaci Nenavázaná próba je odmyta V případě úspěšné hybridizace svítí na membráně fragment tvořený jedním vláknem DN a jedním vláknem próby Southern - blotting Southern blot hybridizace sondy DN Sonda Zahřátí (denaturace) Ochlazení (renaturace) 12 3
Fenylketonurie PH gen Fenylketonurie defekt genu pro fenylalanin hydroxylázu (PH) R onemocnění PH 13 exonů mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000) defekt genu pro fenylalanin hydroxylázu (PH) R onemocnění PH 13 exonů mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000) Fenylketonurie Mutace - např. delece v 2. exonu; detekce systémem restrikční endonukleázy (viz obrázek) Při negativním výsledku vyšetření jednoho exonu vyšetření mutací v dalších exonech RFLP metoda utosomálně recesivní onemocnění (např. cystická fibróza, fenylketonurie) RFLP prenatální vyšetření Fenylketonurie - R ) B) Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp a Vyšetření je informativní Plod heterozygot - zdravý RFLP metoda Polycystická choroba ledvin - D RFLP metoda R onemocnění hemofilie (obdobné pro barvoslepost) Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp aa Dcera zdravá enotyp X + X h Přenašečka 4
Polymorfismy lidské DN - vazebná analýza v přímé a nepřímé diagnostice Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) SR short tandem repeats, SSR simple sequence repeats Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude možné jej využít i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění: vazba polymorfismu s mutovanou alelou. V závislosti na frekvenci crossing-overu bude současně s mutací předáván z rodičů na potomky kosegregace markeru s mutovanou alelou. 3 ři rodokmeny rodin s dětmi postiženými Downovým syndromem (prostá trisomie). Výsledek analýzy DN tetranukleotidového polymorfismu na chromozómu 21 - je znázorněn pod rodokmeny. Od kterého z rodičů zdědilo dítě třetí kopii chromozómu 21? V kterém meiotickém dělení došlo k nondisjunkci? 1?? Meióza I u otce nebo u matky 2 Meióza I u otce nebo u matky Meióza I u matky 3 Polymorfismy lidské DN využívané v přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP)? Meióza I u otce nebo u matky Meióza I u matky Meióza II u matky 4 SNP / N 1 5
Polymorfismy lidské DN využívané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP) V 99.9% sekvence DN se lidé od sebe vzájemně neliší. Ze zbývajícího 0.1% rozdílu tvoří SNP přes 80%. Projekt lidského genomu nyní pokračuje mj. ve formě identifikace miliónů SNP, které jsou shromažďovány ve veřejně přístupných databázích. Možnost typizace mnoha set tisíc SNP v jednom vzorku pomocí DN čipů by měla usnadnit identifikaci alel, zodpovědných za řadu prevalentních onemocnění. DN čipy - microarrays Moderní metoda analýzy DN v několika lokusech současně enové čipy obsahují velké množství sond, které hybridizují s různými oblastmi genomu Rovněž využívá hybridizace Využití nanotechnologií manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové 2 6