Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze Základní přednáška pro posluchače studijního oboru Klinická a toxikologická analýza R. Čabala Katedra analytické chemie Přírodovědecká fakulta Univerzita Karlova v Praze Ústav soudního lékařství a toxikologie Oddělení toxikologie VFN v Praze Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 1
Přehled toxikologicky relevantních vzorků 1. Krev jediný vzorek pro kvantitu Plná krev Sérum - nebuněčná složka krve, která vzniká po vysrážení plné krve a následným odstraněním krevního koláče centrifugací Plazma - nebuněčná tekutá složka krve, obsahuje srážlivé faktory; získá se centrifugací plné krve 2. Moč pouze pro screening 3. Žaludeční obsah často původní látky bez metabolitů 4. Novorozenecká smolka 5. Ostatní vše co lze použít k identifikaci nox Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 2
Přehled toxikologicky relevantních látek analyzovatelných GC 1. Plyny a páry a) H 2, N 2, O 2, X 2, CH 4, NH 3, H 2 S, PH 3, AsH 3, HX, CO, CO 2, NO x, SO 2, SO 3, COCl 2, NOCl, HCN b) Methanol, ethanol c) Uhlovodíky a jejich deriváty 2. Pesticidy 3. Glykoly 4. Barbituráty 5. Benzodiazepiny 6. Ostatní hypnotika 7. Těkavá anestetika 8. Stimulanty 9. Designové drogy Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 3
GC aplikace v toxikologii dvojí typ metod GC screeningové systémy detekce širokého spektra předem neznámých různorodých látek a metabolitů kompromisní řešení méně citlivé GC cílené konfirmační nebo kvantitativní metody vyvinuté a optimalizované pro úzkou škálu strukturně blízkých látek nebo pro jednu látku které jsou předem specifikovány, známy. Mohou využívat derivatizační postupy a mají nižší mez detekce M. Balíková: GC v toxikologii 4
Vzorky pro toxikologický screening Vzorek č. Typ vzorku Objem (ml) Určeno pro analýzu Metoda 1 Celá krev (antikoagulovaná) konzervovaná fluoridem 2 Alkoholy, těkavé látky Head-space GC 2 Sérum (z celé krve) 5 10 Screening drog digoxin Li Extrakce, GC-MS screening, immunoassay (digoxin), plamenová fotometrie (Li) 3 Celá krev (konzervovaná heparinem) 2 Karboxyhemoglobin UV/Vis Fotometrie 4 Moč 1-2 20 50 Těkavé látky Screening drog HS-GC, bodové testy (salicyláty), immunoassay (návykové látky), extrakce a GC-MS screening (potvrzení), 5 Žaludeční obsah 20 50 Screening drog Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala Bodové testy (salicyláty), vizuální kontrola (pevné částice), extrakce, GC-MS 5
Přehled analytických metod pro antidopingovou kontrolu Screening I II IIIb IVa IVb Chemické látky Těkavé dusíkaté látky vylučované močí, amfetaminy, efedriny Netěkavé dusíkaté látky vylučované jako konjugáty, fenolalkylaminy, betablokátory, morfiny Kyselé látky, diuretika, maskovací látky, probenecid Anabolika vylučovaná močí, oxandrolon, clenbuterol Anabolika vylučovaná jako konjugáty, nandrolon Příprava vzorků Hydrolýza Extrakce Derivatizace ne ano ne ne ano Diethylether zásadité ph Diethylether/ t-butylalkohol Diethylether kyselé ph XAD-2/ diethylether Analytická metoda Separační metoda Citlivost (ng/ml) ne GC-NPD 100 ne O-TMS-N-TFA nebo TFA Extrakční methylace SPE s SM-7 O-TMS-N-HFB nebo TMS-enol-TMS GC-NPD GC-MS 10 10 GC-MS 100 GC-MS 1 XAD-2/ diethylether TMS-enol-TMS GC-MS 1 XAD-2 = polystyrenový anex, TFA = trifluoroacetyl, TMS = trimethylsilyl, HFB = heptafluorobutyryl Upraveno dle: Analytical Toxicology for Clinical and Pharmaceutical Chemists, H. Brandenberger, R.A.A. Maes eds., Walter de Gruyter, 1997, New York, ISBN 3-11-010731-7 Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 6
Příklady reakcí: Chemická derivatizace analytů pro GC 1) acetylace aminů, fenolů (2,5-DMA) 2) tvorba perfluorderivátů (2,5-DMA) 3) silylace kyselin, fenolů (morfin) M. Balíková: GC v toxikologii 7
Příklady reakcí: 4) alkylace kyselin (Diethylkyanurová kyselina) Chemická derivatizace analytů pro GC (1,5-pentandiová k.) 5) tvorba cyklických etherů (ethylenglykol) M. Balíková: GC v toxikologii 8
GC aplikace v toxikologii screening unknowns M. Balíková: GC v toxikologii 9
GC - Head Space Analýza Stanovení oxidu uhelnatého v krvi Metoda stanovení COHb v krvi ante-mortem i postmortem s použitím redukčního činidla dithionitu-na pro eliminaci MetHb. Oxid uhelnatý je uvolněn v kyselém prostředí Kolona: molekulové síto 5 A Detektor: TCD Pozn. Jiným způsobem lze uvolnit HCN z krve a použít princip Head Space analýzy (M. Odoul et al., JAT 18, 205, 1994) M. Balíková: GC v toxikologii 10
GC-HS aplikace - příklad analýzy krve Diagnostika příčiny úmrtí těkavé látky M. Balíková: GC v toxikologii 11
GC - Head Space Analýza Specifické stanovení alkoholů v krvi Primární analýza Konfirmační analýza M. Balíková: GC v toxikologii 12
Konfirmační analýza Primární analýza HS-GC Analýza těkavých látek v krvi Rtx-BAC Plus 2 M. Balíková: GC v toxikologii 13
Screening těkavých látek HS-GC Směs standardů Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 14
Screening těkavých látek HS-GC Krev pacienta, který zemřel n otravu plynem do zapalovače Krev pacienta, který zemřel na otravu ředidlem korekční kapaliny Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 15
HS-GC Analýza glykolů v krvi M. Balíková: GC v toxikologii 16
Carbowax 20M Relativní retenční časy důležitých rozpouštědel na 2 různých GC kolonách Porapak Q Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 17
Sekvence měření nutná kontrolní opatření pro zabezpečení správnosti výsledků (QA) Důležitost pořadí v sekvenci vzorků a kontrol v sérii měření toxikologické vzorky obsahují analyty o neznámé koncentraci v širokém rozsahu několika řádů Vkládání kontrol pro zjištění správné funkce operačního postupu, např. extrakce, dodržení separačních a detekčních podmínek na přístroji v daný moment, kontrola dostatečné odezvy eliminace potencionální falešné negativity Vkládání blank kontrol, rozpouštědel pro eliminaci případných tzv. carry over efektů tj. přenos analytů ze silně koncentrovaného vzorku do vzorků s mnohem menší koncentrací nebo i s absencí analytu eliminace potencionální falešné pozitivity M. Balíková: GC v toxikologii 18
HS-GC analýza alkoholů carry-over efekt 3 1 2 1 2 3 Vzorek Blank 1 Methanol, 2 Ethanol, 3 Isopropanol (IS) Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 19
GC analýza TCA a TCE interference matrice 1 methyl-tca, 2 1,4 dichiorbenzen (IS), 3 2,2,2 trichlorethanol (TCE) a hovězí plazma s TCA/TCE, b blank lidské plasma, c - pacient Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 20
GC-MS screening netěkavých léčiv Waters et al., Forensic Toxicology (2013) 31:67-39 Kolona 1: 1,3 m x 0,25 mm x 0,5 µm + Kolona 2: 4 m x 0,15 mm x 0,25 µm He, 200 cm/s, T.p.: 110 200 C, 70 C/min, 200 370 C, 50 C/min Plynová chromatografie v klinické a toxikologické analýze - R.Čabala 21