Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Autorský kolektiv ústavu 402 VŠCHT Praha Část 1, Úvod Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) Moderní separační techniky musí vynikají schopností rozdělit složité multikomponentní směsi s vysokou efektivitou a v krátkém čase. Technika HPLC a její novější verze označovaná jako UHPLC (Ultra-High-Performance Liquid Chromatography) jsou velmi účinné metody schopné poskytovat vynikající dělení látek v krátkém čase. Zakladatelé metody, Martin a Synge 1, si byli vědomi již v roce 1941, že pro dosažení vysoké separační účinnosti je třeba používat sorbenty s malou velikostí částic, což ve svém důsledku vede k nutnosti použití vysokých tlaků mobilní fáze k dosažení dostatečného průtoku mobilní fáze na koloně. K bouřlivému rozvoji HPLC proto došlo až poté, kdy se podařilo zvládnout čerpání mobilních fázích pod vysokým tlakem pomocí spolehlivých vysokotlakých čerpadel, což bylo až v sedmdesátých letech dvacátého století. 1 A.J.P. Martin and R.L.M. Synge, Biochem. J., 35, 1358 (1941). 5
Mody/typy kapalinové chromatografie V dnešní době rozlišujeme řadu různých variant provedení HPLC. Podle podstaty interakce analytu se stacionární fází pak techniky HPLC můžemě třídit podle tzv. chromatografických modů do následujících skupin. Adsorpční chromatografie (Adsorption/normal chromatography) Princip adsorpční chromatografie (označuje se také jako chromatografie na normální fázi) je znám z klasické kolonové a tenkovrstvé chromatografie. Jako stacionární fáze je užit relativně polární materiál s vysokým měrným povrchem, nejběžnější je silikagel, ale používá se také alumina (oxid hlinitý) a oxid hořečnatý. Mobilní fáze je většinou nepolární (např. heptan). K separaci analytů většinou dochází na základě dipól-dipól, indukovaný dipól-dipól interakcí a dalčích interakcí se stacionární fází. Nepolární rozpouštědla jako hexan mají menší eluční sílu než středně polární rozpouštědla, jako např. ether, a polární rozpouštědla. Polární látky se eluují později než látky nepolární. Chromatografie na obrácených (reverzních) fázích (Reversed-phase chromatography, RP) Separace na obrácených (reverzních) fázích je naopak založena na užití nepolárních stacionárních fází a polárních fází mobilních. Jako mobilní fáze se nejčastěji používají směsi vodných půfrů s organickými rozpouštědly, především methanolem a acetonitrilem. Podstatou interakce analytu na stacionární fázi je hydrofobní interakce. Nepolární látky se eluují později než látky polární. Iontově-výměnná chromatografie (Ion-exchange chromatography) Stacionární fáze obsahuje kovalentně imobilizované iontovýměnné skupiny (např. NR + 3 nebo SO - 3 ), které interagují s iontovými skupinami analytu. Metoda je vhodná pro dělení ionizovatelných látek. Jako mobilní fáze se užívají roztoky pufrů často s gradientovém uspořádaní, kdy během analýzy roste koncentrace soli v mobilní fázi nebo se mění její ph. 6
Iontově-párová chromatografie (Ion-pair chromatography, IPC) Iontově-párová chromatografie bývá používána pro podobné aplikace jako technika iontověvýměnné chromatografie. Do mobilní fáze je přidáván ionogenní detergent, který se jednak naváže na stacionární fázi (především hydrofobní interakcí, protože jako sorbenty se používají různé reverzní fáze), zároveň ale může v roztoku tvořit s analytem opačného náboje hydrofobní iontový pár, který následně interaguje se stacionární fází hydrofobní interakcí. Během jednoho separačního experimentu je možno současně dělit látky kyselé, zásadité i neutrální. Iontová chromatografie (Ion chromatography, IC) Iontová chromatografie je speciální variantou iontově-výměnné chromatografie. Byla vyvinuta především pro separaci nízkomolekulárních iontových analytů. Protože používá odlišné stacionární fáze než IEC a liší se i hardwarově, reprezentuje samostatný mod. Vylučovací chromatografie (Size-exclusion chromatography, SEC) Někdy se ještě jemněji rozlišuje tzv. gelová permeační chromatografie (mobilní fáze je organické rozpouštědlo) a tzv. gelová filtrace (mobilní fáze je vodná). Vylučovací chromatografie dělí látky podle jejich hydrodynamického objemz, který je ve vztahu k jejich molekulové hmotnosti. Objemné anaylyty jsou eluovány nejdříve, malé molekuly nejpozději. Afinitní chromatografie (Affinity chromatography) Tento separační mod je založen na vysoce specifických biochemických interakcích mezi na stacionární fázi zakotveným specifickým selektorem a analytem. Stacionární fáze nese určité funkční skupiny, které interagují velmi selektivně až specificky pouze s jistými analyty/analytem (typickým příkladem je např. interakce typu antigen-protilátka). Afinitní chromatografie např. může být využita pro snadnou izolaci některých bílkovin, enzymů a strukturních proteinů, lipidů, atd., i z velmi složitých směsí. 7
Hydrofobně interakční chromatografie (Hydrophobic interaction chromatography, HIC) Tato technika je určena především pro dělení směsí bílkovin. Jako sorbenty se používají obracené fáze střední polarity, např. modifikace typu C8 nebo fenyl. Mobilní fáze obsahuje velké množství vhodné sole, často síran ammoný o koncentracích několika molů na litr, v pufru. Cílem bývá na nejprve vysolení všech bálkovin na stacionární fízi. Pak následuje aplikace gradientu s postupným snižováním koncentrace síranu amonného, což je doprovázeno postupnou elucí jednotlivých bíklovin. Uvedené technika bývá vhodným alternativním modem vedle RP a IEC při dělení proteinů. Hydrofofilně interakční chromatografie (Hydrophilic interaction chromatography, HIC) Mod HIC byl znovuobjeven na začátku 21. století a dnes se řadí mezi velmi perspektivní techniky zvláště vhodné pro separace vysoce polárních nenabitých látek. Právě tyto látky se mnohdy nedařilo separaovat jinými HPLC technikami. Protože má mnoho analytů právě uvedenou povahu, bylo nutné nalézt vhodnou separační techniku. Zkoušena byla především RP technika, ale retence uvedených analytů byla často příliš nízká i při vysokých množstvích vodny v mobilní fázi. Aplikace poměrně polárních stacionárních fází, jako např. silikagel, středně polární vázavé fáze apod., v kombinaci s mobilními fázemi obsahujícími obvykle vodu a acetonitril často poskytuje dostatečnou retenci, selektivitu a separační účinnost pro řadu problematických analytů, které se nedaří dělit v jiných chromatografických modech. Zvyšování podílu vody v mobilní fízi vede k poklesu retence analytů. Chirální separace (Chiral sepatartion) Chirální separace jsou velmi důležité v mnoha oborech, např. facmacii, biochemii, studiu životního prostředí, výrobě a analýze pesticidů. Mnoho látek může být přítomno ve formě příslušných enantiomerů a ty mohou mít podstatně odlišné vlastnosti v chirálním prostředí. Proto je jedním z čato užívaných typů HPLC separace na chirálních fázích. 8
HPLC instrumentace HPLC systém může být tvořen z jednotlivých modulů nebo může jít o jeden kompaktní celek. Modulární koncept je flexibilnější. Ale i kompaktní HPLC má své přednosti, např. možnost velmi přesné synchronizace nástřiku vzorku s činností čerpadel, apod. HPLC instrument má obvykle několik následujících částí: zásobník(ky) mobilní fáze, odplyňovač mobilní fíze, vysokotlaké čerpadlo, směšovač mobilních fází, nástřikové zařízení (manuální nástřikový ventil nebo autosampler), chromatografickou kolonu, termostat na kolonu, detektor, datastanici pro sběr a vyhodnocení získaných dat. Počítač většinou kromě sběru dat z detektoru současně řídí HPLC instrument. Porovnání HPLC s plynovou chromatografií (Gas chromatography, GC) Podobně jako HPLC je plynová chromatografie 2 (GC) také vysokoúčinná technika, nejpodstatnější rozdíl je v tom, že GC je schopna separaovat jen látky těkavé nebo s takové, které poskytují těkavé deriváty. Jen kolem 20 % známých organických látek je možno analyzovat pomocí GC bez jejich předchozí derivatizace. Pro použitelnost HPLC je na druhou stranu nutnou podmínkou rozpustnost látky v mobilní fázi. Ve srovnání s GC jsou u HPLC tři důležité rozdíly: (a) difúzní koeficient látek v kapalné mobilní fázi je podstatně menší než ve fázi plynné (b) viskozita kapalné mobilní fáze je větší než fáze plynné (c) kompresibilita kapalné fáze je téměř zanedbatelná ve srovnání s fází plynou. (Lze to považovat za výhodu, protože rychlost průtoku kapalné mobilní fáze je po celé délce kolony prakticky konstantní. Následně, celá kolona může pracovat při optimální průtokové rychlosti. Kromě toho, nestlačitelnost kapaliny v důsledku znamená, že kapalina pod vysokým tlakem není nebezpečná) 2 H.M.McNair, J.M.Miller and F.A.Settle, Basic Gas Chromatography, Wiley-Interscience, New York, 2009. 9
Porovnání HPLC s kapilární elektroforézou (Capillary electrophoresis, CE) Kapilární elektroforéza 3 (CE) je určená pro separaci nabitých analytů. Pro separaci je důležitý náboj, velikost a tvar iontu, protože i ten ovlivňuje rychlost migrace a tak lze někdy dosáhnout dělení izomerů a analytů se stejným specifickým nábojem. Dělení je prováděno za vysokého napětí. Napětí vložené na kapiláru může dosahovat až 30 kv. Pufr v kapiláře se obvykle pohybuje směrem k negativně nabité elektrodě, katodě. Kapiláry mívají délku 20-100 cm a vnitřní průměr 50-250 µm. Kapiláry pro CE nejsou obvykle plněny sorbentem na rozdíl od HPLC, ale v některých případech mohou být plněny gelem, který umožňuje separaci látek podle jejich velikosti (podobně jako vylučovací chromatografie v HPLC). Separační účinnost v CE může být řádově vyšší než u HPLC (až 10 7 teoretických pater), i proto se CE frekventovaně užívá pro peptidové mapování a DNA sekvenování. Nicmémě, nízkomolekulární analyty jako aminokyseliny nebo anorganické ionty mohou být také separvovány. Nastřikovaná množství látek jsou velmi malá, protože objem dělící kapiláry je také velmi malý. Největší nevýhodou CE je nižší opakovatelnost analýz ve srovnání s HPLC. Také preparativní dělení pomocí kapilární elektroforézy není prakticky možné. Kapilární elektrochromatografie (Capillary electrochromatography, CEC) představuje hybridní techniku spojující HPLC a CE. Při této technice jsou používány kapiláry plněné sorbentem nebo monolitem a dělení probíhá na základě kombinace dcou separačních principů. Jednotky tlaku, délky a viskozity Jednotky tlaku V oblasti HPLC se běžně používají jednotky bar, ale SI jednotkou tlaku je pascal (Pa): 1 Pa = 1 N m -2. Jednotka atmosfera (atm nebo at) by se neměla používat. Jednotka psi (libra na čtvereční palec) je používána v Americe stále velmi běžně. Je třeba vzít na vědomí rozdíl mezo psia = psi absolutní a psig = psi měřené (tlakoměrem), posledně zmíněné znamená přetlak ve srovnání s tlakem okolním. 3 P.Schmitt-Kopplin, Capillary Electrophoresis, Humana Press, Totowa, 2008; S.Wren, Chromatohraphia Suppl., 54, S-15 (2001). 10
1 bar = 10 5 Pa = 10 5 kg m -1 s -2 = 0,987 atm = 1,02 at = 14,5 lb in -2 (psi) Převody jednotek: 1 MPa = 10 bar (megapascal) 1 atm = 1,012 bar (fyzikální atmosfera) 1 at = 0,981 bar (technická atmosfera, 1 kp cm -2 ) 1 psi = 0,0689 bar Přibližné přepočty: 1000 psi 70 bar, 100 bar = 1450 psi Jednotky délky Pro specifikaci délek a průměrů pro HPLC jsou v USA používány často americké jednotky palce (in). Menší velikosti jsou označovány ve formě zlomků, jako např. ½, ¼, 1/8 nebo 1/16 palce, nebo v násobcích palce. V Evropě se ale používají běžně jednotky SI. Vnější průměry: 1 = 25,40 mm ½ = 12,70 mm 3/8 = 9,525 mm ¼ = 6,35 mm 3/16 = 4.76 mm 1/8 = 3,175 mm 1/16 = 1.59 mm Vnitřní průměry: 0,04 = 1,00 mm 0,02 = 0,51 mm 0,01 = 0,25 mm 0,007 = 0,18 mm Jednotky viskozity SI jednotkou dynamické viskozity je pascal sekunda: 1 Pa s = 1 kg m -1 s -1. Rozpouštědla mívají viskozitu kolem 1*10-3 Pa s = 1 mpa s. Starou jednotkou byl centipoise (cp): 1 mpa s = 1 cp. 11