MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2009 JANA MARTOCHOVÁ 1
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Mykotoxiny a zdraví člověka Bakalářská práce Vedoucí práce: MVDr. Olga Cwiková Vypracovala: Jana Martochová Brno 2009 2
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma... vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis bakaláře. 3
Motto Zdraví je předpokladem všeho. Kopecký Miloš Poděkování Touto cestou bych ráda poděkovala MVDr. Olze Cwikové za cenné rady a vstřícnou pomoc při vedení bakalářské práce. Také bych chtěla poděkovat své rodině a přátelům za trpělivost a podporu během mého studia. V Brně 4
Abstrakt V mé bakalářské práci se zabývám historií i novými poznatky z oblasti negativního vlivu mykotoxinů pro zdraví člověka. V jednotlivých kapitolách jsem se zaměřila na charakteristiku nejčastějších mykotoxinů - aflatoxiny, ochratoxin A, patulin, fumonisiny, zearalenony, deoxynivalenol a kyselinu cyklopiazonovou, na jejich producenty, kteří se v potravinách nejběžněji vyskytují rod Aspergillus Penicillium a Fusarium a na potraviny, které jsou z hlediska výskytu mykotoxinů rizikové chléb, pečivo, masné výrobky, sýry, koření, rýže, ovoce a zelenina. Klíčová slova: mykotoxin, zdraví člověka, axlatoxiny, ochratoxin A, patulin, fumonisiny, zearalenony, deoxynivalenol, kyselina cyklopiazonová, Aspergillus, Penicillium, Fusarium. 5
Abstract In my dissertation I inquire into history and acquired knowledge of the mycotoxins negative impact on human health. In separate chapters, I focused on the characteristics of the most common mycotoxins - aflatoxins, ochratoxin A, patulin, fumonisins, zearalenone, deoxynivalenol and cyklopiazon acid, then on their producers most commonly found in food - the genus Aspergillus, Penicillium and Fusarium, and then the foods that are hazardous in terms of occurrence of mycotoxins - bread, pastry, meat products, cheeses, spices, rice, fruit and vegetables. Keywords: mycotoxin, human health, aflatoxins, ochratoxin A, patulin, fumonisins, zearalenone, deoxynivalenol, cyklopiazon acid, Aspergillus, Penicillium, Fusarium. 6
Obsah 1. ÚVOD....8 2. CÍL PRÁCE...9 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED...10 3.1 Mikromycety......10 3.1.1 Významní producenti mykotoxinů....13 3.1.2 Faktory ovlivňující produkci mykotoxinů....14 3.1.3 Limity mykotoxinů v potravinách.17 3.2 Mykotoxiny...18 3.2.1 Významné mykotoxiny..21 3.2.1.1 Aflatoxiny......21 3.2.1.2 Ochratoxin A......22 3.2.1.3 Patulin 22 3.2.1.4 Fumonisiny....23 3.2.1.5 Zearalenony....24 3.2.1.6 Deoxynivalenol.. 24 3.2.1.7 Kyselina cyklopiazonová...25 3.2.2 Významné mykotoxikózy..25 3.2.3 Stanovení obsahu mykotoxinů v potravinách a krmivech.29 3.2.3.1 Fyzikálně-chemické metody 31 3.2.3.2 Biologické metody...32 3.2.4 Stanovení toxicity.33 4. ZÁVĚR 34 5. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY. 35 7
1. ÚVOD Mykotoxiny jsou produkovány vláknitými mikromycetami, neboli vláknitými mikroskopickými houbami, obyčejně řečeno plísněmi. Jejich výskyt i koncentrace jsou rok od roku proměnlivé. Ve vlhkých rocích bývá hromadně ohrožena úroda zemědělských plodin, obsah mykotoxinů se mění v závislosti na uchování a skladování potravin. Název mykotoxiny poprvé použili Forgacz a Carll roku 1955. Lidstvo se od prvopočátků své existence setkávalo s mykotoxiny a jimi vyvolanými chorobami, zejména když v období neolitu začal člověk cíleně obdělávat půdu, pěstovat plodiny, skladovat je a chovat užitková zvířata. Je nepochybné, že jednoduchá společenství v minulosti, zápasící o vlastní přežití, se nemohla při tehdejší úrovni znalostí a technických možnostech účinně bránit kontaminaci a znehodnocování potravin patogenními a toxinogenními mikromycetami (plísněmi), a ani si nemohla dovolit, např. v době hladomorů vyloučit ze své diety kontaminované potraviny. Ale jsou známy i pozitivní vlastnosti, kdy se ve středověku kvasinky a mikroskopické vláknité houby uplatňovaly např. k přípravě chleba, alkoholických nápojů, sýrů i různých fermentovaných orientálních pokrmů. Překonání tohoto nepříznivého období nastalo až mnohem později, s nástupem moderní doby, s vědeckotechnickou revolucí a zemědělskou produkcí. Moderní biotechnologie využívají kvasinky a houby i na přípravu krmiv, enzymů, organických kyselin, ethanolu, vitamínů, antibiotik, steroidů a stimulátorů růstu rostlin, apod. Sledování toxických látek vstupujících do potravního řetězce člověka je nedílnou součástí každé moderní společnosti. Kontrola nezávadnosti konzumovaných potravin je naprosto nezbytnou součástí ochrany lidského zdraví. Ke sledovaným látkám, zejména pokud jde o hygienicko-toxikologickou nezávadnost potravin, patří i mykotoxiny. V České republice není mnoho literatury zabývající se touto problematikou, ale za každým, i tím nejmenším poznatkem o mykotoxinech je však člověk výzkumník a jeho tvořivá práce. 8
2. CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce bylo vypracovat literární rešerši na téma Mykotoxiny a zdraví člověka. Zejména jsem se zaměřila na charakteristiku mykotoxinů a jejich producentů, kteří se v potravinách nejběžněji vyskytují a na potraviny, které jsou z hlediska výskytu mykotoxinů rizikové. 9
3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mikromycety Jsou mikroskopické vláknité houby a plísně, které netvoří velké jedlé plodnice. Na napadených potravinách mikromycety vypadají jako různě zbarvené porosty. Jednotlivé druhy můžeme od sebe vzájemně rozlišit, až když se na ně podíváme pod mikroskopem. Základem jejich těla jsou vlákna (hyfy), která se složitě větví v podhoubí. Z podhoubí také vyrůstají rozmnožovací orgány, z nichž se uvolňují výtrusy tzv. spory (Němcová, 2006). Velká morfologická rozmanitost a schopnost mikromycetů přizpůsobit se nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje jejich výskyt všude tam, kde existuje organická hmota. Spory mikromycetů jsou jednobuněčné či vícebuněčné výtrusy sloužící k jejich rozmnožování a přežívání. Jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých a odumřelých organizmů, na různých předmětech, v krmivech apod. Velmi vhodným substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování toxinogenních mikromycetů jsou potraviny, kde rozkládají živiny a zapříčiňují tak kažení potravin. Platí, že čím víc vody potraviny obsahuje, tím hlouběji plísně rostou (Ostrý, 1998). Rizikové potraviny a jejich mykotoxiny jsou uvedeny v Tab. 1. Tab. 1 Rizikové potraviny a jejich mykotoxiny (Ostrý, Škarková, 2003) Potraviny chléb, pečivo masné výrobky, trvanlivé salámy tvrdé a tavené sýry plísňové sýry ovoce, zelenina, konz. ovocné a zeleninové potraviny, kompoty, džemy marmelády koření sušené plody např. fíky hrozinky rýže kojenecká výživa Mykotoxiny aflatoxiny, ochratoxin A aflatoxiny, ochratoxin A aflatoxiny, ochratoxin A, sterigmatocystin kyselina cyklopiazonová aflatoxiny, ochratoxin A, patulin Aflatoxiny Aflatoxiny, ochratoxin A aflatoxiny, citrinin, luteoskyrin Aflatoxiny Mikromycety pronikají do hloubky potraviny a tomu odpovídají koncentrace mykotoxinů, zjištěné v hlubokých vzorcích potravin (Ostrý, 2009). 10
Chléb, pečivo Chléb pokusně kontaminovaný toxinogenní plísní Aspergillus flavus obsahoval aflatoxiny. Produkce aflatoxinů v chlebu byla zahájena mezi 48 a 72 hodinou uchování. Koncentrace aflatoxinů dosáhla takové hodnoty, že došlo k několikanásobnému překročení hygienického limitu a chléb byl posouzen jako zdravotně závadný. Největší produkce aflatoxinu B 1 a aflatoxinu G 1 byla zjištěna při sedmidenním uchování chleba v mikrotenovém sáčku při pokojové teplotě. Aflatoxiny byly stanoveny i v topinkách připravených ze zaplesnivělého chleba, protože jsou vysoce odolné teplotě a běžné teploty i přes 100 C používané při kuchyňské úpravě je nerozkládají. Chléb kontaminovaný spórami toxinogenní plísně Penicillium viridicatum uchovaný v mikrotenovém sáčku při pokojové teplotě obsahoval ochratoxin A. Produkce ochratoxinu A v chlebu byla zahájena po 48 hodinách uchování. Po 64 hodinách dosáhla takové koncentrace, která překračila hygienický limit a chléb by byl posouzen jako zdravotně závadný. Ochratoxin A byl stanoven i v topinkách připravených ze zaplesnivělého chleba (Anonym, 2009, Ostrý, 2009). Masné výrobky, trvanlivé salámy Nesprávné rozvěšení salámů při uzení vede k tomu, že kouř, jehož složky mají fungicidní (protiplísňový) účinek, nemá přístup k celému povrchu salámu - právě v místě dotyku dvou salámů rostou plísně nejčastěji Trvanlivé tepelně neopracované i opracované masné výrobky byly kontaminovány toxinogenní plísní Aspergillus flavus, obsahovaly po uchování aflatoxiny (Anonym, 2009, Ostrý, 2009). Tvrdé a tavené sýry Tvrdé a tavené sýry kontaminované spórami toxinogenní plísně Aspergillus flavus obsahovaly po uchování aflatoxiny. Tvrdé a tavené sýry pokusně kontaminované spórami toxinogenní plísně Aspergillus melleus obsahovaly po uchování mykotoxin ochratoxin A. Plísňové sýry Plísňové sýry camembertského typu, které byly uchované v domácnosti při pokojové teplotě, obsahovaly mykotoxin kyselinu cyklopiazonovou. Kyselina 11
cyklopiazonová je produkována ve vyšších koncentracích "kulturní plísní" Penicillium camemberti při teplotě nad 10 C (Ostrý, 2009). Ovoce, zelenina Jablko kontaminované spórami toxinogenní plísně Penicillium expansum obsahovalo vysoké koncentrace mykotoxinu patulinu jak v nahnilé, tak i ve zdravé vykrájené části. Ovocné a zeleninové výrobky, kompoty, džemy, marmelády Spóry plísní kontaminují povrch ovoce a zeleniny z okolního prostředí z půdy, trávy, apod. Plesnivý jablečný mošt osídlený spórami plísně rodu Byssochlamys, které přečkaly konzervační záhřev 85 C po dobu 20 minut, obsahoval mykotoxin patulin. Meruňková marmeláda a meruňkový džem light, které byly po otevření víčka pokusně kontaminované spórami toxinogenní plísně Aspergillus flavus, obsahovaly aflatoxiny po sedmidenním uchování při pokojové teplotě i v chladničce. Meruňkový džem light s obsahem 20 % sacharidů, který byl doslazen sladidlem aspartamem, obsahoval vyšší koncentraci aflatoxinů než meruňková marmeláda s obsahem 60 % sacharidů. Je známo, že vyšší koncentrace sacharidů brání plísni Aspergillus flavus v produkci aflatoxinů (Ostrý, 2009). Sušené plody Z hlediska možné kontaminace toxinogenními plísněmi a mykotoxiny jsou významné zejména: vlašské a lískové ořechy, mandle, pistáciové oříšky, kešu oříšky, arašídy, para ořechy a sušené ovoce - fíky, rozinky, datle, křížaly, sušené meruňky atd. Čím méně vody obsahují sušené plody, tím více je znemožněno rozvoji plísní.je znám ochratoxin A v rozinkách a fazolích, a to ve velmi vysokém procentu vzorku a v množství, které překračovalo normu (Ostrý 2009, Anonym, 2009). Rýže Spóry plísní kontaminují povrch rýžového zrna hlavně z okolního prostředí a půdy. Rýže patří z hlediska výživy člověka k nejdůležitějším obilninám. Obsahuje vitamíny a minerálie, které přejdou ze slupky do oloupané rýže. Spóry plísní kontaminují obilku rýže z okolního prostředí. Nejčastěji obsahuje mykotoxiny aflatoxin, citrinin, luteoskyrin (Ostrý, 2009). 12
Kojenecká výživa Mykotoxiny jsou pro uvedenou populační skupinu vysoce nebezpečné chemické látky, známé svými toxickými účinky. Toxický vliv mykotoxinů nemusí být bezprostřední, ale může se projevit v pozdějším věku a ovlivnit tak zdravotní stav dospělé populace. V sušené mléčné výživě kontaminované spórami toxinogenní plísně Aspergillus flavus byly prokázány aflatoxiny. Produkce aflatoxinů dosáhla po 7 dnech uchování při pokojové teplotě 3,4 mg aflatoxinu B 1 /kg a 2,8 mg aflatoxinu G 1 /kg. Ve vyhlášce 132/2004 sb. MZdr. byl stanoven pro aflatoxin B1 v dětské a kojenecké výživě hygienický limit 0,5 mg / kg. Pro sumu aflatoxinů (B 1, B 2, G 1, G 2 ) je stanoven hygienický limit 1 mg / kg výživy (Ostrý, 1998, Malíř, Ostrý, 2004, Anonym, 2008). 3.1.1 Významní producenti mykotoxinů Rod Aspergillus Pod českým názvem je znám jako Kropidlák, z latinského slova aspergo = kropiti. Je známo víc jak 221 druhů rodu Aspergillus. K významným zástupcům patří Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. ochraceuos. Aspergillus flavus se rozmnožuje nepohlavně konidiemi. Pouze asi polovina kmenů tohoto druhu produkuje aflatoxiny, avšak pokud již k produkci dochází může dosahovat množství až 10 6 µg/kg (Bennett, Klich, 2003). Optimální teplota je 33 C, může však růst v rozmezí teplot od 10-12 do 43-48 C. Tvoří rychle rostoucí žlutozelené kolonie. Morfologicky velmi podobný je druh Aspergillus parasiticus, který má poněkud tmavší kolonie a Aspergillus nomius. Všechny tři druhy se liší produkcí odlišného spektra sekundárních metabolitů (včetně mykotoxinů). Jejich identifikace je na základě morfologických znaků velmi obtížná. Vyskytuje se na celém světě, a to na různých substrátech rostlinného původu a v půdě. Velmi často bývá izolován z burských oříšků a z cereálií. Může produkovat hepatotoxické a kancerogenní aflatoxiny B a kyselinu cyklopiazonovou. Ne všechni zástupci rodu Aspergillus jsou škodlivé. Enzymy této plísně se využívají například při fermentaci potravin, například Aspergillus niger se používá při výrobě kyseliny citronové, Aspergillus sojae se používá pro výrobu kóji, což je výchozí materiál pro řadu fermentovaných sojových výrobků (Sweeney, Dobson, 1998, Ostrý, Škarková, 2003). 13
Rod Penicillium Pod českým názvem je znám jako Štětičkovec, z latinského slova penicillus = štěteček. Penicillium notatum, znám jako penicilin, který je používán jako antibiotikum. Za náhodný objev této plísně dostal Alexandr Fleming roku 1945 Nobelovu cenu a zachránil tím miliony životů. Rod Penicillium obsahuje přes 225 druhů, rozmnožují se nepohlavně konidiemi. Rod Penicillium je významný také v potravinářství a to při výrobě sýrů, např. Penicillium camemberti při výrobě Camembertu, Penicillium Glaucum k výrobě Gorgonzoly a další. Tento rod má také druhy které produkují jedovaté mykotoxiny, jejichž účinek může vést k patogenitě lidského organismu, zástupci produkující mykotoxiny jsou Penicillium expansum, Penicillium claviforme, Penicillium nordicum, Penicillium verrucosum a další ( Šimůnek, 2004, Malíř, Ostrý, 2003). Rod Fusarium Pod českým názvem je znám jako Srpovnička, hlavně podle tvaru konidií, které jsou vřetenovitého až srpovitého tvaru. Je to rod plísní, které pracují na principu, že se dostanou jako cizorodé látky do organismu, prostředí si přizpůsobí, a když jim něco vadí, vypustí toxiny, aby přiotrávili organismus a rozmnožují se dál konidiemi. Fusarium je v přírodě velmi rozšířený, najdeme ho hlavně na obilovinách. Významná je řada jejich toxinů, ale za nejvýznamnější považuji zealarenony, které způsobují mutaci zvanou hyperestrogenismus (Ostrý, 1998). Optimální cestou vedoucí ke snížení výskytu mykotoxinů v lidské potravě a krmivech tvoří tři základní preventivní opatření - 1.Omezení infekce zemědělských plodin toxinogenními vláknitými houbami v období růstu plodin 2. Rychlé a správné vysušení sklizených zemědělských plodin a jejich správné skladování 3. Použití účinných fungicidních přípravků (Ježková, Dohnal, 2007). 3.1.2 Faktory ovlivňující produkci mykotoxinů Tvorba mykotoxinů je především závislá na druhu vláknité houby, ale ovlivňuje ji také řada dalších faktorů vedoucích k souhře enzymatických aktivit buňky a z toho 14
vyplývající možnosti produkce mykotoxinů. Mezi podmínky vedoucí k této souhře můžeme zařadit biologické, chemické a fyzikální faktory prostředí (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004). Tyto faktory mohou produkci mykotoxinů ovlivňovat už během pěstování (na poli), před i v průběhu sklizně plodin a také během její přepravy a uskladňování. Obsah mykotoxinu je zas závislý na vlhkosti, teplotě, délce skladování, poškození zrna, přítomnosti kyslíku a oxidu uhličitého, mykologickém profilu toxinogenních vláknitých mikromycetů, sporulaci a přítomnost hmyzu (Malíř, Ostrý, 2003). Biologické faktory A) Přítomnost více druhů toxinogenních mikromycetů v substrátu, antagonistické (protikladně) nebo synergické (spolupůsobení) vztahy mezi nimi: synergismus mezi aflatoxinem B 1 a deoxynivalenolem, ochratoxinem A nebo T-2 toxinem B) Větší množství kultur mikromycetů - obvykle vede k poklesu produkce mykotoxinů C) Přítomnost spor jiného kmene, případně druhu v médiu - pokles produkce aflatoxinů houbami druhu Aspergillus flavus při příměsi spor hub netoxigenního druhu Aspergillus niger; ochrana před kontaminací mikromycetami druhu Aspergillus flavus pokud je na kukuřici přítomna houba druhu Fusarium moniliforme (Malíř a kol., 2003). D) Hmyz narušující povrch rostlinných orgánů následně kontaminovaných sporami narušení vnějšího povrchu zrn např. u kukuřice během vývojové fáze plodiny nejčastěji jedinci druhu Sitophilus zeamais (pilous kukuřičný), Ostrinia nubilalis (zavíječ kukuřičný, Helicoverpa zea (můra šedivka kukuřičná) a stává ideální vstupní branou infekce mikromycetami (Gorman a Kang, 1991). Chemické faktory A) Přísun energie (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004). B) Přísun nezbytných chemických látek, jako vstupy do metabolismu. C) Přísun kyslíku - tzn. aerobní podmínky. Koncentrace O 2 v prostředí pod 1 % a zvýšeni koncentrace oxidu uhličitého je prevence proti rozvoji a růstu mikromycetů a tvorby mykotoxinů. 15
D) Vliv cukrů - produkce mykotoxinů houbami druhu Aspergillus flavus probíhá do 50 % sacharózy v prostředí (Ostrý, 1998). E) Vliv solí - produkce mykotoxinů na substrátu obsahující do 14 % NaCl (Malíř a kol, 2003) F) Vliv dalších chemických látek aktivujících enzymatické systémy mikromycet - polychlorované bifenyly, rozpouštědla, některé mikroelementy přídavek zinku, kadmia, železa a molybdenu vedou ke zvýšené tvorbě aflatoxinů, naopak např. kofein může tvorbu částečně inhibovat (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004). G) ph - nejčastěji probíhá produkce mykotoxinů při ph mezi 3,5-8, s optimem okolo ph 6. Kyselé prostředí mikromycetům nevadí (Sweeney a Dobson, 1998). Fyzikální faktory A) Teplota prostředí - nejvhodnější je obvykle rozmezí 16 až 30 C s optimem okolo 25 C, u hub druhu Aspergillus tvorba mykotoxinu - aflatoxinů při teplotě pod 16 C nebyla prokázána. B) Vlhkost substrátu - k produkci mykotoxinů je optimální vlhkost 20 25 %. C) Relativní vlhkost vzduchu - min.65 %. D) Osmotické vlastnosti substrátu - hlavně vodní aktivita - a w (voda využitelná mikroorganismy): růst většinou ustává při a w pod 0,65, ale tento pokles pod optimální hodnotu neznamená usmrcení kultury, přežívají spory a při návratu k optimálním podmínkám, tj. hodnotě a w minimálně 0,75, mohou znovu vyklíčit a růst kultury pokračuje. E) Struktura substrátu - ovlivňuje prorůstání do média a tím dostupnost chemických látek a kyslíku. F) Čas - např. mikromycety druhu Aspergillus flavus produkují mykotoxin aflatoxin obvykle až po vysporulování kultury (Šimůnek, 2004). G) Ionizující záření - 2,5 kgy padesátkrát zvýší syntézu aflatoxinů B 1 a G 1, dávka 1 kgy vyvolá tvorbu aflatoxinů také v konidiích kmenů hub druhu Aspergillus flavus, které nejsou přirozeně toxigenní (Malíř a kol., 2003). H) Stresové faktory působící na rostlinu během sklizně (Gorman a Kang, 1991). - vodní stres - extrémní sucha mají za následek neobvykle vysoký výskyt mykotoxinů zejména u kukuřice. 16
- dusíkový stres - rostliny bez přísunu dusíku vykazovaly v průměru o 27 % vyšší hodnoty výskytu mykotoxinu než rostliny s optimálním přísunem dusíku (Ostrý, 1998) 3.1.3 Limity mykotoxinů v potravinách Pro mykotoxiny v potravinách platí limity ve většině států světa. Protože je Česká republika od 1. května 2004 členem Evropské unie, platí u nás následující směrnice týkající se obsahu mykotoxinů v potravinách. Za nejnovější nařízení týkající se mykotoxinů, uvádí Úřední věstník Evropské unie, je považováno Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách a také Nařízení Komise (ES) č. 2174/2003 ze dne 12. prosince 2003, kterým se mění nařízení (ES) č. 466/2001, pokud jde o aflatoxiny. Dne 26. ledna 2005 vyšlo Nařízení komise (ES) č. 123/2005, kde je nově limitován mykotoxin ochratoxin A. Od 1. července 2006 vstoupilo v platnost nařízení (ES) 856/2005, kterým se mění nařízení (ES) 466/2001, pokud jde o fusariové toxiny. Jeden z největších problémů je nalézt limity přijatelné jak pro konzumenta, tak pro výrobce. Hygienické limity podle legislativy EU jsou uvedeny v Tab. 2 a Tab. 3. Tab. 2 Hygienické limity podle legislativy EU (Malíř, Ostrý, 2003) Potravina Arašídy, ořechy, sušené ovoce - k přímé spotřebě Arašídy - určené k třídění nebo fyzikálnímu ošetření před přímou spotřebou Ořechy a sušené ovoce - určené k třídění nebo fyzikálnímu ošetření před přímou spotřebou Hygienické limity aflatoxinů ( µg/kg ) Aflatoxin B1 B1+B2+G1+G2 M1 2 4 8 15 5 10 Cereálie - k přímé spotřebě 2 4 Cereálie - určené k třídění nebo fyzikálnímu ošetření před přímou spotřebou Paprika, cayenské koření - sušené plody celé i mleté (2) (4) 5 10 17
Pepř - sušené plody 5 10 Muškátový oříšek, zázvor, kurkuma 5 10 Mléko syrové 0,05 Tab. 3 Hygienické limity podle legislativy EU (Malíř, Ostrý, 2003) Toxin Hygienické limity ochratoxinu A, patulinu, deoxynivalenonu ( µg/kg ) obecně v potravinách mléčná kojenecká strava dětská a ostatní kojenecká strava Ochratoxin A 20 1 5 Patulin 50 2 30 Deoxynivalenol 500 200 Limity se vztahují k jedlému podílu surovin (tj. bez slupek, skořápek). Limit se vztahuje i na produkty vyrobené z těchto surovin. Dále je touto směrnicí zakázáno: - míchat produkty přesahující stanovený limit nebo produkty určené k fyzikálnímu ošetření či třídění s produkty určenými pro přímou spotřebu lidmi - použít produkty přesahující stanovený limit k produkci jiných potravin - detoxifikovat produkty chemickým ošetřením 3.2 Mykotoxiny Pojem mykotoxin je odvozen od řeckého slova mycos, což znamená houba a z latinského slova toxicum označující jed (Anonym,1999). Mykotoxiny jsou sekundární toxické metabolity vláknitých mikromycetů (mikroskopické vláknité houby, plísně), které patří mezi významné toxiny přírodního původu. Název mykotoxiny byl poprvé použit Forgaczem a Carllem v roce 1955. Mykotoxiny jsou strukturně odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti (g/mol). Jsou nebílkovinné povahy, toxické pro člověka a živé organismy. Důvod, proč jsou mykotoxiny produkovány je vysvětlován tím, že jsou prostředkem vláknitých mikromycetů v boji o potravu a v boji o přežití. Mykotoxiny nejsou nezbytné při rozvoji vláknitých mikromycetů ve srovnání s aminokyselinami, 18
mastnými a nukleovými kyselinami nebo proteiny (bílkovinami), proto název sekundární metabolity (Malíř, Ostrý, 2003). Mykotoxiny jsou produkovány myceliem mikromycetů a vylučovány do substrátu, mohou však být obsaženy také ve sporách, které kontaminují životní a pracovní prostředí člověka. V současné době je známo přes 290 mykotoxinů. Toxikologický výzkum v oblasti hodnocení zdravotního rizika mykotoxinů na základě současných poznatků prokázal, že lidská populace je vystavena mykotoxinům zejména z potravin, z celkového počtu 114 druhů mikromycetů v potravinách, produkuje 65 druhů mykotoxiny (Ostrý, 2009). Toxin jed, do této kategorie patři všechny látky, které mají výrazný škodlivý účinek na organismus již při malých dávkách, řadíme sem i mykotoxiny. Toxikologie věda o jedech, zabývající se nežádoucími biologickými vlastnostmi látek. Za zakladatele považován Paracelsus, středověký lékař 16. století. Mykotoxiny mohou vyvolávat: - akutní projevy projeví se hned po požití - pozdní projevy projeví se po nějakém čase, látka se do organismu dostává postupně, opakovaně. Pozdní účinky látky mohou být mutagenní, karcinogenní, embryotoxické, teratogenní, imunosupresivní a alergenní. Toxicita toxické účinky se zjišťují dopředu, tzv. biologickým pokusem (ten se bohužel dodnes provádí na zvířatech, jako jsou myši, morčata a opice). Míra toxicity se měří a uvádí v tzv. letální dávce, tj. dávka smrtelná, označuje se LD 50, uvádí se v gramech, nebo miligramech na 1 kilogram živé hmotnosti. Číslo 50 značí, že při požití daného množství látky uhyne 50 % živých organismů a 50 % přežije (Betina, 1990). Toxické účinky se zkoumají pomocí testů na : - subakutní toxicitu do 28 dní - akutní toxicitu do 90 dní - chronickou toxicitu 1-2 roky (Anonym, 1999) Silně toxické (LD50 cca jednotky mg/kg.t.hm) -Aflatoxiny,patulin, ochratoxin A Středně toxické (LD50 cca desítky mg/kg.t.hm) - Kys. cyklopiazonová, Deoxynivalenol, Fumonisin Slabě toxické (LD50 cca stovky mg/kg.t.hm) Zearalenon 19
Riziko akutní toxicity se považuje v České republice za málo závažné a to vede až k podceňování nebezpečnosti mykotoxinů vůbec. Onemocnění vyvolané metabolity mikromycetů se nazývají mykotoxikózy. Při nichž dochází k poškození vnitřních orgánu (Malíř, Ostrý, 2003). Významné mykotoxiny a jejich producenti jsou uvedeny v Tab. 4, v Tab. 5 jsou uvedeny toxické účinky mykotoxinů na cílové orgány. Tab. 4Významné mykotoxiny a jejich producenti (Ostrý, 1998) Mykotoxin Aflatoxiny Deoxynivalenol Fumonisin B1 Ochratoxin A Patulin Sterigmatocystin Zearalenon Producenti A. flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. argentinicus Fusarium graminearum, F. culmorum, F. poae Fusarium proliferatum, F. moniliforme, aj. Penicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus, aj. Penicillium expansum, Byssochlamys spp., aj. Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. versicolor, aj. Fusarium graminearum, F. culmorum, aj. Tab. 5 Toxické účinky mykotoxinů na cílové orgány (Ostrý, 1998) Dermatotoxiny (kůže) Estrogeny (hormony) Genotoxiny (geny DNA, RNA) Hematotoxiny (krev) Hepatotoxiny (játra) Imunotoxiny (imunitní systém) Nefrotoxiny Neurotoxiny Toxiny působící na orgány trávicího traktu Dělení mykotoxinů podle toxických účinků Psolareny, sporidesminy, trichotheceny, verrucariny Zearalenony Aflatoxiny, citrinin, fumonisiny, fusarin C, griseofulvin, ochratoxin A, patulin, sterigmatocystin, trichotheceny, zearalenony Aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny, zearalenony Aflatoxiny, luteoskyrin, sterigmatocystin Aflatoxiny, gliotoxin, ochratoxin A, patulin, sporidesmin, trichotheceny Citrinin, ochratoxin A Fumitremorgeny, fumonisiny, penitrem A, verruculogeny Trichotheceny 20
3.2.1 Významné mykotoxiny 3.2.1.1 Aflatoxiny Aflatoxiny jsou nejčastěji se vyskytující skupinou mykotoxinů. Jsou to polycyklické, nesaturované, vysoce substituované kumariny, produkované toxigenními kmeny Aspergillus flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř 100 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G). Nejvyšší nálezy aflatoxinu byly zaznamenány u kukuřice, podzemnice olejné, pistácii, paraořechu, bavlníkových semen a kopry (Velíšek, 2002). Tyto látky působí jako hepatotoxiny a hepatokancerogeny. Byly identifikovány začátkem 60. let ve spojitosti s epidemií označovanou jako krůtí onemocnění X, při které zahynulo na 100 000 krůtích mláďat v okolí Londýna po zkonzumování krmiva s obsahem toxické arašídové mouky. Postupně byly identifikovány 4 přirozené typy aflatoxinů: AFB 1, AFB 2, AFG 1 a AFG 2. Nejčastěji se vyskytuje AFB 1 (obr. 1), s největší akutní toxicitou. V dnešní době známe asi 20 druhů dosud identifikovaných aflatoxinů (např. AFB 1, AFB 2, AFB 3, AFD 1, AFG 1, AFM 1 a další). Obr.1 Aflatoxin AFB 1 (Ostrý, 1999) Absorpce aflatoxinu se uskutečňuje jak orální tak i inhalační cestou, což bylo prokázáno u mlynářů, v mísírnách krmiv a kukuřičném prachu během sklizně. Aflatoxiny se v játrech hromadí a od různých menších či větších jaterních potíží, přes záněty, může dojít až ke karcinogenezi. Aflatoxiny jsou nejen iniciátory, ale také promotory karcinogeneze, průběh je pomalý a chronický. Tyto sloučeniny jsou primárně metabolizovány v játrech mikrozomálními oxidázami a cytozolickými enzymy. Většina primárních metabolitů je dále detoxikována konjugací s kyselinou glukuronovou nebo sírovou a eliminována močí nebo stolicí. Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC/WHO), která kategorizuje vybrané mykotoxiny z hlediska karcinogenních účinků, hodnotí jako prokázaný silný karcinogen pro člověka zatím pouze AFB 1 (Ostrý, Škarková, 2003). 21
3.2.1.2 Ochratoxin A Ochratoxin A je nebezpečný mykotoxin produkovaný především dvěma rody, a to rodem Aspergillus ochraceuos a také Penicillium, vyskytující se především na obilovinách typu ječmen, žito, oves, pšenice, rýže a kukuřice. Lze ho charakterizovat jako 7-izokumarin vázaný na aminoskupinu L-β-fenylalaninu (obr. 2). Obr. 2 Ochratoxin A (Ostrý, 1999) Ochratoxin A, způsobuje poškození cytoplasmatických organel a přímo zasahuje do základních metabolických funkcí buněk jako jsou tvorba energie a syntéza proteinů (Ostrý, 1998). U ochratoxinu A byly potvrzeny imunotoxické, teratogenní (vznik vrozených vývojových vad) a karcinogenní účinky. Při ochratoxikóze dochází k výraznému podráždění sliznice trávicího ústrojí a k rozvoji akutní gastroenteritidy. Resorbované mykotoxiny vyvolávají toxickou nefropatii (poškození ledvin), která je provázena nechutenstvím, depresí, průjmy, horečkou, žíznivostí a častým a vydatným močením a postupnou dehydratací organismu. Ochratoxin A přechází z krve zvířat do masa zvířat a kontaminované živočišné produkty mohou být rizikové pro zdraví lidí. Přežvýkavci jsou vůči ochratoxinům rezistentní, protože v bachoru zvířat dochází k jejich detoxikaci (Suchý, Herzig, 2004). 3.2.1.3 Patulin Patulin (obr. 3) je nenasycený lakton obvykle izolovaný z jablek a jejich produktů, jako metabolit rodu Penicillium expansum, Penicillium claviforme, dále pak Aspergillus clavatus, Aspergillus giganteus, a Byssochlamys nivea. Patulin vykazuje širokospektrální antibiotické vlastnosti, proto se ověřovalo jeho možné využití k léčbě, ale brzo se od toho upustilo. V pokusech na myších se zjistilo, že dráždí trávicí trakt (překrvení a krvácení, tvorbu vředů), prokázaly se i jeho karcinogenní účinky (Sweeney, Dobson, 1998). 22
Obr. 3 Patulin (Ostrý,1999) Je středně toxický, v potravinách je spíše indikátorem špatných výrobních postupů, používání "plesnivých" vstupních surovin. Pokud se použije v ovocné šťávě nebo jiných potravinách jako konzervační prostředek oxid siřičitý, patulin se ničí. (Šimůnek, 2004)Bezprostřední vážná hrozba zdraví dospělého člověka či zvířete nehrozí, ale u dětí je nebezpečí překročení limitu, pro častou konzumaci ovocných přesnídávek. Patulin se váže na SH skupiny bílkovin a zhoršuje tak funkčnost enzymů a proteinů, zvyšuje permeabilitu buněčných membrán (vlastnost biomembrány určující pronikání rozpuštěných látek do buňky;malíř; Ostrý, 2003). 3.2.1.4 Fumonisiny Fumonisin (obr. 4) je nejrozšířenější zástupce skupiny mykotoxinů, které produkují toxinogenní kmeny rodu Fusarium (např. F. moniliforme a F. proliferatum) vyskytující se hlavně na kukuřici. Teplé a vlhké počasí představuje příznivé podmínky pro tvorbu fumonisinů. Fumonisiny je možno chemicky charakterizovat jako složité alifatické sloučeniny. Dosud bylo izolováno 7 fumonisinů: A 1, A 2, B 1, B 2, B 3, B 4, C 1. Nejvýznamnější z nich je fumonisin B 1 (Malíř, Ostrý, 2003). Prekursorem biosyntézy fumonisinu B 1 mikroskopickou houbou Fusarium moniliforme je aminokyselina alanin. Obr. 4 Fumonisin (Ostrý, 1999) Fumonisiny se projevují u člověka i zvířat řadou účinků. Ukázalo se, že u všech testovaných zvířat působí fumonisin B1 toxicky na játra a ledviny. U prasat způsobují 23
fumonisiny plicní edém. Má se zato, že fumonisiny mají vliv na vývoj rakoviny jícnu u člověka (Anonym, 2009). 3.2.1.5 Zearalenony Důležitými mykotoxiny produkovanými některými druhy plísní rodu Fusarium jsou laktony kyseliny β-resorcylové zearalenony (obr. 5). V současné době je izolováno 15 derivátů základní struktury zearalenonu (dříve označovaný jako F-2 toxin). Obr.5 Zealarenon (Ostrý, 1999) Jsou méně toxické než jiné mykotoxiny, ale dokážou zvláště působit na nedospělý organismus, jejich efekt je estrogenní, způsobují hyperestrogenismus - předčasná puberta mladých dívek, předčasný vývoj pohlavních sekundárních znaků se týká právě zealarenonů. Způsobuje řadu zánětů, ale karcinogenní není, může však již vzniklý karcinom podpořit v růstu. Zearalenon je velmi stabilní a zůstává nezměněn i po tepelném zpracování mouky či fermentaci (Ostrý, 1998, Malíř, Ostrý, 2003). 3.2.1.6 Deoxynivalenol Deoxynivalenol (DON; obr. 6) je podle Americké asociace pro pšenici (USW) nejběžnějším, a v dováženém obilí nejčastěji se vyskytujícím mykotoxinem. Obr. 6 Deoxynivalenol (Ostrý, 1999) 24
DON je mykotoxin produkovaný plísní rodu Fusarium, která vyvolává běžné onemocnění pšenice a dalších zrnin fuzariózu, která se objevuje u plodin vystavených přílišné vlhkosti v průběhu fáze kvetení. Ve sporadických případech a při mnohonásobně překročené povolené hranici v mouce může DON způsobovat krátkodobé zažívací problémy (Mrtvicová, 2007). 3.2.1.7 Kyselina cyklopiazonová Kyselina cyklopiazonová je mykotoxin střední toxicity, nalezený a izolovaný z metabolitů Penicillium cyclopium. Je produkována řadou mikroskopických hub rodu Aspergillus a Penicillium. Kyselina cyklopiazonová je indoltetramový derivát. Kyselina cyklopiazonová je potencionálním inhibitorem syntézy bílkovin, kdy inhibuje přepis RNA při syntéze bílkovin a poškozuje organely, které se účastní proteosyntézy. Inhibuje transport Ca 2+ do endoplazmatického retikula, kdy tento transport hraje důležitou roli při svalové kontrakci. Poškozuje gastrointestinální trakt, ledviny, játra a další orgány. Byly pozorovány degenerativní změny myokardu a kosterního svalu. Toxicita je v experimentu u jednotlivých zvířat odlišná. Nejcitlivější je pes. Kyselina cyklopiazonová byla zachycena v sýrech camembertského typu, kukuřici, arašídech, v krmných směsích, rýži a kroupách (Anonym, 2009, Malíř,Ostrý, 2003). 3.2.2 Významné mykotoxikózy Aby bylo možné relevantně posoudit podíl určitého mykotoxinu na vzniku mykotoxikózy u člověka, musí být splněno pět následujících podmínek : 1. Musí se zjistit přítomnosti mykotoxinu v potravinách (na základě analýzy obsahu mykotoxinů v potravinách s využitím vhodných analytických metod). 2. Musí se potvrdit že byl člověk vystaven danému mykotoxinu na základě analýzy reziduí mykotoxinů nebo jejich metabolitů ve tkáních a tekutinách s využitím vhodných analytických metod (nepřítomnost tzv. biologických markurů vždy neznamená, že nedošlo k expozici!). 3. Musí se stanovit korelace (vztah, závislost) mezi expozicí (vystavením) a výskytem tzv. incidencí onemocnění (nemusí však být evidována a ověřena pouze epidemiologickými studiemi). 4. Musí se zjistit a potvrdit reprodukovatelnost charakteristických symptomů (příznaků) onemocnění u laboratorních zvířat. 25
5. Musí se potvrdit, že způsob toxického účinku je podobný u člověka i u laboratorních zvířat (Malíř, Ostrý a kolektiv, 2003). Ergotismus Ergotizmus patří mezi první onemocnění člověka, které bylo spojováno s toxickými produkty mikroskopických hub mykotoxiny, které jsou spojované zpravidla s používáním potravin z obilnin (žita) a rýže kontaminované tvrdými tmavě fialovými nebo černými sklerocii = námelem (svatojánské žito, růže, drápek), polní mikroskopické houby rodu Claviceps. Hlavně v severní a střední Evropě byly prokázány epidemie ergotismu spojené s konzumací žita napadeného Claviceps purpurea. Ergotismus je popsán ve dvou formách, a to jako gangrenózní forma oheň sv. Antonína (je typická pro oblast jihozápadní Evropy) a konvulzivní forma se vznikem křečí (typická pro oblast severovýchodní Evropy). Ergotismus postihoval hlavně venkovské obyvatelstvo, byl proto též nazýván nemocí venkovanů. Riziko onemocnění člověka ergotizmem po konzumaci potravin z obilovin je v našich podmínkách, při dodržování zásad správné zemědělské praxe a na základě současných poznatků, minimální. Může k němu však dojít při hrubém porušení správné zemědělské a technologické praxe během pěstování a zpracování obilovin. Vyskytly se případy kontaminace kmínu námelem. Z hlediska možné výživové expozice jsou pak více ohrožena hospodářská zvířata, např. v hospodářstvích s nedostatečnou krmivovou základnou, kde jsou zkrmovány zbytky po čištění zrna, nebo při pastvě, kdy jsou traviny kontaminovány námelem. Dalším potenciálním zdrojem pro člověka by mohly být výrobky z dovozu na bázi žita, a to z oblastí, kde zemědělství a jeho kontrola není na nejlepší úrovni. Proto při dovozu podobných výrobků lze doporučit kontrolu na obsah námelových mykotoxinů (Malíř, Ostrý, 2003, Anonym, 2009). Nejznámější epidemie ergotizmu - 430 př. n. l. - Aténský mor - 944 - onemocnění Mal des Ardents ve Francii, 40 000 lidských životů - 1692 - čarodějnické procesy, z nichž nejznámější byl salemský, na území států Massachusetts a Connecticut v USA 26
- 1954 - zatím poslední popsaná evropská epidemie ergotizmu ve Francii, 200 nemocných, 4 lidé zemřeli - 90. léta - epidemie ergotizmu se vyskytují v současné době v Africe (např. v Etiopii) a v Asii (např. v Indii) (Malíř, Ostrý, 2003). Aflatoxikóza Je to akutní a chronické onemocnění vzniklé po konzumaci potravin, kontaminovaných vysokými dávkami mykotoxinu aflatoxinu. Akutní aflatoxikóza není u lidí častá, a pokud ji člověk onemocní, umírá na selhání jater, u kterých jsou nalezeny ložiskové nekrózy (rakovina; Malíř, Ostrý, 2003). Jedna z nejhorších akutních aflatoxikóz byla zaznamenána v roce 2004 v Keni. Při této epidemii zemřelo více než 125 lidí s příznaky odpovídajícími právě intoxikaci aflatoxiny (Probst a kol., 2007). Klinické příznaky tohoto onemocnění jsou podle Suchého a Herziga (2004) hlavně nažloutlé oční bělmo, zvracení, křeče v žaludku, vysílení, hubnutí a bezvědomí končící až smrtí postiženého. Reyův syndrom Pro onemocnění je jedním z hlavních faktorů, které se na jeho vzniku podílejí, mykotoxin aflatoxin B 1. Onemocnění postihuje převážně dětskou populaci na celém světě, především kojence do 1 roku (respektive do 6 měsíců) života krmených umělou výživou. Má zpravidla dvoufázový průběh. První fáze začíná většinou jako banální respirační onemocnění (dýchací potíže), druhá fáze přichází pak za několik hodin nebo málo dní, nastává zvracení, průjmy a příznaky programující encefalopatie (onemocnění mozku) (Malíř, Ostrý, 2003). Druhá fáze končí většinou křečemi a smrtí. Při pitvě se nachází difúzní malokapénková steatóza (ztukovatění tkáně ) jater, steatóza ledvin, steatóza myokardu a kosterních vláken s jejich hrudkovitým rozpadem. U 60 % dětí zemřelých v bývalém Československu právě na následky tohoto onemocnění byl prokázán aflatoxin B 1 ve vzorcích z jater, žluči a krve (Ostrý, 2009). Primární karcinom jater Toto onemocnění způsobuje mykotoxin aflatoxin B 1, což bylo prokázáno na celé řadě živočišných druhů včetně opic. Karcinogenita aflatoxinu B 1 je zapříčiněna jeho metabolizovanou formou, která způsobuje bodovou mutaci na kodonu 249 (ser) dochází ke změně pořadí bází z AGT na AGG u tumor supresorového genu p53 (Malíř a 27
kol., 2004). Mutace vede ke vzniku primárního karcinomu. Také byl studován vztah mezi virem hepatitidy typu B a zvýšením rizika jaterního karcinomu a bylo zjištěno, že prodělání hepatitidy B zvyšuje přibližně dvacetinásobně riziko vzniku tohoto typu nádoru. Primární jaterní karcinom není příliš častým ve srovnání s jinými nádorovými onemocněními, V ČR je ročně diagnostikováno 2 12 případu na 100 000 obyvatel. Respirační nádorové onemocnění Onemocnění vzniká inhalací kontaminovaného vzduchu aflatoxinem B 1, neboť se ukázalo že i buňky respiračního traktu mají schopnost metabolizovat aflatoxin B 1. Častý výskyt plícního karcinomu byl zpozorován u dělníku v lisovnách oleje v Holandsku, kde byl prokázán aflatoxin B 1 ve výliscích lněných semen, arašídů a v prachu ovzduší. Onemocnění ze žluté rýže, kardiální beri-beri Rýže patří mezi nejdůležitější obilniny, je hlavní složkou potravy pro 60% lidstva na této planetě. Výsledky epidemiologického šetření a experimenty na zvířatech prokázaly, že příčinou onemocnění mohou být mykotoxiny luteoskyrin, citrinin, rugolosin, islandotoxin, citreoviridin. Tyto mykotoxiny jsou produkovány např. plísněmi Penicillium islandicum, Penicillium citronum, Penicillium citreoviride, které jsou častými kontaminanty rýže. Mezi příznaky onemocnění ze žluté rýže patří ochrnutí končetin, hypotenze (nízký krevní tlak) a dušnost, což odpovídá i onemocnění kardinální beri-beri. Na onemocnění kardinální beri-beri zemřelo v roce 1942 v džungli mnoho vojáku po konzumaci plesnivé rýže, ze začátku se myslelo že úmrtí vojáku způsobuje nedostatek vitamínu B 1, ale později bylo prokázáno že je způsobeno mykotoxinem citreoviridinem, neboť vojáci umírali hned na druhý den co zkonzumovali pokrm z plesnivé rýže. V naších podmínkách je výskyt tohoto onemocnění minimální, důležitou prevencí je nakupovat jakostní rýži a skladovat ji v suchu (Malíř, Ostrý 2003). Ochratoxikóza Jedná se o celosvětově se vyskytující onemocnění způsobené mykotoxiny, které je popsáno u lidí i zvířat. Nemoc způsobuje mykotoxin ochratoxin A, který se vyskytuje v zaplísněném krmivu a potravinách, a podílí se na vzniku nádorových onemocnění. Výskyt je závislý na rozličných faktorech, jako jsou roční doba, 28
geografická zóna, klima a konzumační zvyklosti. Příznaky nemoci jsou leze na ledvinách, nepravidelná srdeční činnost, selháni ledvin, většinou toto onemocnění končí smrtí. Onemocnění postihuje nejčastěji populaci mezi 30 50 rokem života, což je nejasné proč. Nemoc se objevuje endemicky (regionálně) a častěji se objevuje u žen (Malíř, Ostrý, 2003). Alimentární toxická aleukie Onemocnění se nejčastěji vyskytovalo ve východní Sibiři u lidí konzumujících ječmen a proso napadené houbami Fusarium spp. Příznaky onemocnění se projevují bolestmi hlavy, třesavkou, závratěmi, zvracením a zrakovými poruchami, zvířata trpěla podobnými příznaky jako lidi. Onemocnění bylo zprvu považováno za epidemii cholery a nedostatek vitamínu, ale v pozdější době bylo prokázáno že se jedná o onemocnění způsobené mykotoxiny produkovanými houbou Fusarium. Onemocnění z 60 % končilo smrtí (Malíř, Ostrý, 2003). 3.2.3 Stanovení obsahu mykotoxinů v potravinách a krmivech V České republice ještě neplatí ucelené evropské normy pro stanovování obsahu mykotoxinů v potravinách a krmivech, a proto je jednotlivými směrnicemi dovoleno použít jakoukoliv z metod (Mrkvicová, 2007). Musí pouze splňovat předpoklady týkající se její reprodukovatelnosti, opakovatelnosti a výtěžnosti (Nařízení ES č. 401/2006). Při stanovování obsahu mykotoxinů (aflatoxin, ochratoxin, patulin a další) v potravinách se využívá především jejich fyzikálních, chemických a také biologických charakteristik: - fyzikální vzhled, pach, hustota, barva. - chemické způsob projevu, do jakých reakcí vstupují, reaktivita, apod. - biologické sledování biologických účinku. Pro každou z analýz podle Šimůnka jsou velmi důležité, i když často podceňované, první kroky předcházející samotné detekci toxinu v potravinách, a to zejména (Šimůnek, 2004; Malíř a kol, 2003). 29
Odběr vzorku - pro některé potraviny je postup upraven speciální normou. Kvalitní odběr vzorku má vliv na přesnost stanovení a je také vhodné používat při kontrole vždy stejnou metodu odběru vzorků pro stejný výrobek. Množství odebraného vzorku se dělá s ohledem na množství produktu, z něhož odebíráme. Měl by být odebrán také takzvaný duplikátní vzorek za účelem potvrzení budoucího výsledku. Pro daný produkt je třeba vystavit protokol o odběru. Pozornost bývá kladena i na transport vzorku, jenž by měl probíhat po uložení daného vzorku do čisté nádoby z inertního materiálu (sklo, PVC), která jej v případě potřeby ochrání před poškozením či případnou kontaminací při přepravě. Důležitým krokem je také dostatečná homogenizace vzorku, ne všechny mykotoxiny jsou rovnoměrně rozloženy v potravině (Mrtvicová, 2007). Extrakce - cílem je především přenesení co největšího množství testované látky do co nejmenšího objemu vhodného rozpouštědla a zajištění co nejnižšího podílu rušících látek. Používá se extrakce vhodným rozpouštědlem na laboratorní třepačce v Erlenmayerově baňce se zábrusem při neutrálním až kyselém ph (Mrtvicová, 2007), okyselení vzorku s provádí kyselinou chlorovodíkovou nebo fosforečnou. K extrakci mykotoxinů se nejčastěji používá metanol, octan etylnatý, chloroform, aceton a acetonitril, popřípadě jejich vodné roztoky (Malíř a kol., 2003). Jako jedna z metod se používá takzvaná superkritická fluidní extrakce, kdy dochází k převedení rozpouštědla do superkritického stavu (za teploty od 25 C do 200 C a tlaku 7-60 MPa) Výhodou jsou malé spotřeby rozpouštědla a vysoká účinnost, nevýhodou je instrumentální náročnost metody. Čištění při čištění se zbavujeme nežádoucích příměsí a nečistot, které by mohly následně ovlivňovat výsledky detekce. Provádí se ve fázi kapalina-kapalina (dnes již málo používané), kapalina-pevná látka nebo imunoafinní. V současnosti se nejčastěji používají imunoafinní kolonky (prostupné gely, na které jsou specificky ukotveny protilátky proti určitým mykotoxinům). Principem je imunologická reakce antigen + protilátka (Mrtvicová, 2007). Extrakt proteče přes kolonku a nežádoucí látky jsou vymyty (Šimůnek, 2004). Následně je kolonka promyta rozpouštědlem, které zruší vazbu mykotoxin - protilátka. Nevýhodou této metody je poměrně vysoká cena kolonek, většinou pouze na jedno použití. Velkou výhodou se jeví především rychlost reakce a malá spotřeba rozpouštědel. 30
Detekce - Dělí se na kvalitativní, semikvantitativní a kvantitativní. Používané metody jsou fyzikálně-chemické a biologické (Mrtvicová, 2007). 3.2.3.1 Fyzikálně-chemické metody: chromatografie Sloupcová chromatografie Látka, která zde působí jako sorbent, je obsažena ve sloupci obklopeném trubicí z vyhovujícího materiálu. Tato metoda se již dnes moc nepoužívá, spíš je používaná k přečišťování vzorků než k celkovému stanovení. Tenkovrstvá chromatografie (TLC) Na povrchu odpovídajícího nosiče dochází ke vzlínání směsi rozpouštědel v tenké vrstvě použitého sorbentu. Po nanesení vzorku postupně dochází k přechodu rozpouštědla přes vzorek a jednotlivé složky jsou takto unášeny po vrstvě sorbentu různou rychlostí. Další analýzu látek je možno provést buď přímo, pod UV nebo postřikem vhodného chemického činidla, jež vzorek vizualizuje. Výhodou TLC je její odolnost vůči balastním látkám, vzorek nemusí být tak důkladně přečištěn. Z toho vyplývají rovněž menší ztráty při čištění. Nevýhodou je především horší a méně přesná kvantifikace metody. Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) Používají se malé speciální desky s velmi jemným sorbentem. Výhodou metody je miniaturizace celého zařízení a snížení množství nanášených látek. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Při této metodě se využívají drobné kolonky ve spojení s pumpou, kterou přes ně dochází k protlačování unášecí směsi. Po průchodu látky přes kolonku se její detekce provádí většinou na základě fyzikálních vlastností roztoku (absorpce viditelného, infračerveného nebo ultrafialového světla). Nespornou výhodou metody je zejména její kvantifikace s vysokou přesností. Nevýhodou je poměrná materiální náročnost, nákladnost a případné ztráty při čištění. 31
Plynová chromatografie (GC) Tato metoda je pro anylýzu plynných vzorků,popřípadě veškerých těkavých látek, které lze separací převést v páru. Do proudu nosného plynu se nadávkuje příslušný vzorek, a v chromatické koloně dochází k separaci vzorku vlivem interakce s náplní kolony,výsledek jde přes detektor a zapíše se ve vyhodnocovacím zařízení. (Malíř a kol.2003). Metoda je především účinná a rychlá, separace složitých směsí a práce s malými množstvími vzorku za použití relativně jednoduché aparatury 3.2.3.2 Biologické metody Z těchto metod jsou nejpoužívanější metody RIA a ELISA založené na principu imunitní reakce námi sledované látky s protilátkou. Mykotoxiny působí jako hapteny, to znamená, že vyvolají tvorbu protilátek po navázání na vhodný nosič, kterým může být například bílkovina. Protilátky vhodné pro tuto reakci získáváme buď přímo ze séra imunizovaného zvířete, nebo jako takzvané monoklonální protilátky (všechny jsou produkovány z jedné buňky a pro jejich výrobu se používá B lymfocytů z imunizovaného zvířete, které se slučují s vhodnou nádorovou nebo leukemickou buňkou, poté splynou a vzniká takzvaná nesmrtelná buňka, jež se neomezeně dělí a produkuje protilátky). Výhodou použití metody ELISA je snadné odečítání vzorku (měření intenzity zbarvení fotometricky). Problémem zůstávají hlavně falešně pozitivní výsledky (mezi aflatoxiny navzájem; Šimůnek, 2004). Mikrobiologické metody Pro stanovení mykotoxinů u různých druhů mikromycet jsou uplatňovány především metody založené na: A) Rozpoznání morfologických znaků hub potenciálně toxigenních druhů B) Identifikaci pomocí fyziologických znaků (specifický růst každá plíseň roste na specifickém agaru, při specifické teplotě, má své specifické ph ) C) Využití biochemických znaků (různě zbarvené pigmenty na diagnostických médiích; Ostrý a Škarková, 2003). 32
Molekulárně-biologické metody - polymerázová řetězová reakce (PCR) - při polymerázové řetězové reakci se využívá především detekce genů kódujících enzymy podílející se na biosyntéze mykotoxinů (Malíř a kol., 2003). 3.2.4 Stanovení toxicity Pro stanovování toxigenity (schopnosti produkovat mykotoxiny) daného druhu mikromycety se využívá vhodných substrátů, na kterých je určitý druh houby schopen toxin produkovat. Nejznámějšími metodami jsou - Testování izolovaného kmene vláknitých hub na karlovarských sucharech Postup - 10g sterilních sucharů se rozdrtí a na Petriho misce se zalije 5ml suspenze testovaného kmene; kultivace 14 dní, 26 C; k vyhodnocení se využívají metody chromatografické (např. HPLC) nebo imunochemické (ELISA). Testování izolovaného kmene na syntetickém živném médiu Postup - smícháme 20g kvasničného extraktu, 150g sacharózy, 20g agaru, 1ml Cu-Zn koncentrátu a 1000ml destilované vody. Vzniklé médium se očkuje suspenzí kmene určeného k testování; kultivace 14 dní, 30 C; zpracování a vyhodnocení pomocí chromatografických nebo imunochemických metod. Přímé testování potraviny Postup - vzorek potraviny, ze které byl izolován potenciálně toxigenní kmen, se umístí na Petriho misku, upraví se jeho vodní aktivita zvlhčením na hodnotu, která je pro produkci každého mykotoxin jiná, kultivace 14 dní, 26 C; vyhodnocení za pomoci chromatografických či imunochemických metod (Mrtvicová, 2007, Malíř, Ostrý, 2003). 33