HETEROLOBOSEA Diverzita a evoluce

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra zoologie HETEROLOBOSEA Diverzita a evoluce Bakalářská práce Tomáš Pánek Školitel: RNDr. Ivan Čepička, Ph.D. Praha 2009

Na tomto místě bych chtěl poděkovat všem citovaným autorům, neboť věnovali svůj čas a energii, aby rozšířili poznání heteroloboseí a podali tak o významu a zajímavosti této skupiny jasné důkazy, které ve své práci předkládám. Děkuji i svému školiteli, Ivanu Čepičkovi. Mé poděkování není pouze formální, vděčím mu totiž nejen za vedení této práce, ale i za uvedení do biologického výzkumu jako takového. V neposlední řadě vyjadřuji svou vděčnost také rodičům, neboť mé vzdělání a čas strávený v laboratoři financují a podporují. Díky vám! Obr. 1. Naegleria fowleri s amoebastomy (Převzato z Khan 2007) Prohlášení o původnosti práce Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně pod vedením RNDr. Ivana Čepičky, Ph.D. a že jsem uvedl veškeré použité prameny. V Praze, 29. 4. 2009.... Tomáš Pánek 1

OBSAH ABSTRAKT... 3 ABSTRACT... 3 I. ÚVOD... 4 II. MORFOLOGICKÁ DIVERZITA A FYLOGENEZE......4 2.1. MORFOLOGICKÁ A DRUHOVÁ DIVERZITA KMENE... 4 2.2. FYLOGENEZE KMENE... 13 2.3. TAXONOMIE KMENE (KRITICKÉ ZHODNOCENÍ)... 14 2.4. DRUHOVÝ KONCEPT KMENE... 18 III. EXTREMOFILNÍ HETEROLOBOSEA... 19 3.1. HETEROLOBOSEA V EXTRÉMNĚ ZASOLENÉM PROSTŘEDÍ... 19 3.2. ACIDOFILNÍ HETEROLOBOSEA... 20 3.3. HETEROLOBOSEA S NEOBVYKLÝMI NÁROKY NA TEPLOTU... 21 3.4. HETEROLOBOSEA ŽIJÍCÍ V PROSTŘEDÍ S NEDOSTATKEM KYSLÍKU... 22 IV. ACRASIDA, MNOHOBUNĚČNÁ HETEROLOBOSEA... 25 V. ENDOBIOTICKÁ A PATOGENNÍ HETEROLOBOSEA... 28 5.1. NAEGLERIA JAKO PŮVODCE PAM... 28 5.2. OSTATNÍ PARAZITICKÁ A ENDOBIOTICKÁ HETEROLOBOSEA... 29 5.3. HETEROLOBÓZNÍ MĚŇAVKY JAKO REZERVOÁROVÍ HOSTITELÉ... 30 VI. ZÁVĚR... 31 VII. POUŽITÁ LITERATURA... 31 2

Abstrakt Heterolobosea jsou malým (asi 100 popsaných druhů), ale morfologicky a ekologicky značně diverzifikovaným kmenem, který spadá do příbuzenstva euglen a jakobidů (říše Excavata). Zahrnují převážně volně žijící améby, bičíkovce a améboflageláty, z nichž někteří se přizpůsobili životu v extrémně kyselých či zasolených prostředích, jiní redukovali své mitochondrie nebo vytvořili mnohobuněčné formy. Mnozí zástupci heteroloboseí si osvojili schopnost příležitostně žít uvnitř jiných tvorů. Naegleria fowleri se dokonce stala krutým zabijákem člověka. Heterolobosea také vykazují řadu podobností s jinými říšemi eukaryot. Například akrasie nápadně připomínají buněčné hlenky skupiny Dictyosteliida (říše Amoebozoa), Stephanopogon byl naopak dlouho považován za primitivního nálevníka (říše Chromalveolata). Donedávna se pozornost vědců soustředila téměř výhradně na rod Naegleria, v poslední době ale značně vzrůstá počet prací věnujících se i neparazitickým zástupcům heteroloboseí. Klíčová slova: Heterolobosea; Percolozoa; Excavata; améby; bičíkovci Abstract Heterolobosea is a diverse group of mainly free-living amoebae, flagellates and amoeboflagellates, which is closely related to Euglenozoa and Jakobida (supergroup Excavata). Though only approximately 100 species have been described, ecological and morphological diversity of Heterolobosea is unusually vast. Some heteroloboseans are able to flourish in hypersaline or extremely acidic habitats, while some others reduced their mitochondria and live in low concentrations of oxygen. Some species are facultative endobionts of both vertebrates and invertebrates. Naegleria fowleri causes an acute fulminating meningoencephalitis in humans. On the other hand, couple of examples of convergent evolution were recognized between Heterolobosea and other eukaryotic lineages. For instance, acrasids form multicellular fruiting bodies similar to those of Dictyosteliida (supergroup Amoebozoa), Stephanopogon was originally described as a member of ciliates (supergroup Chromalveolata). Scientists were focused mainly on the genus Naegleria, until recently. Nowadays, the number of publications on the non-pathogenic species of Heterolobosea is increasing. Key words: Heterolobosea; Percolozoa; Excavata; amoebae; flagellates 3

I. Úvod Když se na konci 80. let minulého století na základě sekvencí SSU rdna ukázalo, že skupina améb a améboflagelátů kolem druhu Naegleria gruberi není blízce příbuzná ostatním amébám, ale má fylogeneticky blíž spíše k trypanosomám a krásnoočkům (Clark a Cross 1988a), započala se trnitá cesta poznávání evoluce a diverzity této podivné skupiny, nazvané Heterolobosea Page a Blanton, 1985. Zmiňovaný objev zároveň ukázal, jak zavádějící mohou být závěry založené na morfologických datech. Od té doby poznání kmene Heterolobosea sice v mnohém značně pokročilo, přesto ale nedosáhlo úrovně běžné u jiných eukaryotických kmenů. Pakliže si odmyslíme data získaná studiem rodu Naegleria, můžeme toho o nich skutečně říci jen velmi málo. V této práci přesto shrnu a zhodnotím dosud získané poznatky, neboť se v posledních letech ukazuje, jak je tento druhově nepočetný a opomíjený eukaryotický kmen morfologicky a ekologicky rozmanitý. Jeho význam proto začíná vzrůstat i v jiných oblastech, než je výzkum primární amébové meningoencefalitidy. Přestože vnitřní fylogeneze heteroloboseí je prozkoumána jen velmi nedostatečně, víme díky několika multigenovým a fylogenomickým analýzám poměrně přesně, jaké je postavení tohoto kmene na stromu života (Hampl et al. 2009; Rodríguez-Ezpeleta et al. 2007; Simpson et al. 2006). Z provedených analýz je zřejmé, že Heterolobosea patří do říše Excavata, konkrétně do blízkosti skupin Euglenozoa a Jakobida. Společně tvoří taxon nazvaný Discoba Simpson, 2009, v němž mají jakobidi bazální postavení. Monofylie taxonu Discoba je potvrzena například unikátní aminokyselinovou inzercí v jednom proteinu velké podjednotky ribozomu (Rodríguez-Ezpeleta et al. 2007). II. Morfologická diverzita a fylogeneze 2.1. Morfologická a druhová diverzita kmene Celý kmen Heterolobosea zahrnuje podle odhadu Adla et al. (2007) okolo osmdesáti druhů organismů. Stejní autoři pak předpokládají, že celkový počet druhů heteroloboseí se pohybuje kolem dvou set. Můj odhad popsaných druhů se pohybuje okolo stovky. Domnívám se, že zejména diverzita volně žijících heterolobózních měňavek je z větší části stále neobjevena. Jsem přesvědčen, že odhad skutečného počtu druhů heteroloboseí nelze v současnosti zodpovědně vyslovit, protože chybí akceptovatelný druhový koncept kmene. Pokud bychom ale pro tento účel podmínečně přijali De Jonckheereův druhový koncept (viz kap. 2.4.), odhad 4

celkového počtu druhů by výrazně přesáhl 200. Stačí si totiž uvědomit, že podle něj se v současnosti jen samotný rod Naegleria rozpadá do 47 druhů (De Jonckheere 2008). Mezi Heterolobosea patří měňavky bez známek mastigontu (např. Monopylocystis, Vahlkampfia, Paravahlkampfia, Neovahlkampfia), ale i bičíkovci s různým počtem bičíků, nejčastěji však se čtyřmi bičíky a zachovanou exkavátní rýhou (Percolomonas, Pharyngomonas, Pleurostomum, Lyromonas). Řada druhů jsou tzv. améboflageláti, mají totiž jak stádium měňavky, tak bičíkovce (např. Naegleria, Tetramitus, Psalteriomonas, Heteramoeba). Bičíkaté stádium rodu Psalteriomonas má přitom dokonce čtyři exkavátní rýhy, jádra i mastigonty (Broers et al. 1990). Je zajímavé, že některé druhy améboflagelátů při kultivaci ztrácí bičíkatá stádia. Toto chování bylo zaznamenáno např. u rodů Tetramitus, Tetramastigamoeba a Willaertia (Page 1988). Je tedy možné, že řada druhů, u kterých se předpokládá absence bičíkatého stádia, ve skutečnosti v přírodě bičíkovce tvoří. Heterolobózní měňavkovitá stádia se obecně vyznačují poměrně unikátní morfologií. Nejsou ploché, nýbrž válcovité a jejich pohyb je poměrně rychlý. V literatuře se pro tyto améby používá pojem limax améba, protože připomínají slimáka (obr.2-5). Další význačnou charakteristikou je přítomnost eruptivních lobopodií, které se obvykle tvoří na přední části buňky (viz obr. 2). Někdy je vytvářena jediná eruptivní lobopodie na předním konci těla (obr. 4), jindy se mohou vytvářet kromě ní i lobopodie postranní. U některých druhů může být klasická forma limax améby doprovázena i zploštělým, tzv. flabelátním morfotypem (např. Stachyamoeba lipophora), u čeledi Guttulinopsidae (Rosculus, Guttulinopsis) tato zploštělá forma dokonce zcela převládá (Page 1988). Zatímco amébovité formy heteroloboseí jsou morfologicky velmi stejnorodé, morfologie bičíkatých stádií je mnohem rozmanitější (obr. 24-40). Mezi Heterolobosea patří třeba i mnohobičíkatý a značně odvozený rod Stephanopogon, jenž nápadně připomíná nálevníky, ke kterým byl v minulosti nesprávně řazen (viz Lipscomb a Corliss 1982; Yubuki a Leander 2008). U řady rodů jsou popsány cysty (obr. 6), jejichž struktury se často využívá při popisu nových druhů. Značně variabilní jsou cysty například u rodu Tetramitus (De Jonckheere 2008). Komenzální endobiotická améba rodu Pseudovahlkampfia je zajímavá tvorbou mnohojaderných obřích forem, které se v mořské vodě rozpadají na jednojaderné limax améby (Sawyer 1980; viz kap. 5.2.). Mnozí příslušníci řádu Acrasida dokonce vytváří mnohobuněčné plodničky (obr. 42-48; viz kap. IV). Zajímavé je, že některé druhy heteroloboseí mají růžovou barvu (Acrasis rosea, Pocheina rosea, Euplaesiobystra 5

hypersalinica a další). U druhu Naegleria fowleri byly popsány zvláštní pohárkovité útvary pro příjímání potravy, tzv. amoebastomy (John et al. 1984). Vnitřní stavbu těla heteroloboseí nám pomáhají poznat ultrastrukturní studie. Vyplývá z nich, že mitochondrie příslušníků tohoto kmene mají ploché (často diskovité) kristy, mnohdy je patrná jejich těsná asociace s drsným endoplasmatickým retikulem (obr. 22). Klasicky vyvinutý Golgiho komplex chybí a jaderné dělení je uzavřená intranukleární ortomitóza (Page a Blanton 1985). Bičíkatá stádia heteroloboseí mají oproti měňavkám zachován mastigont a často i exkavátní rýhu. Jejich ultrastruktura je proto z hlediska fylogenetiky mnohem důležitější a lze ji využít například při rekonstrukci fylogeneze říše Excavata (Simpson 2003). Dnes známe ultrastrukturu heterolobózních bičíkatých stádií z druhů Tetramitus rostratus (Outka a Kluss 1967; Balamuth et al. 1983; Brugerolle a Simpson 2004), Naegleria gruberi (Dingle a Fulton 1966; Dingle 1970; Larson and Dingle 1981; Brugerolle a Simpson 2004), Naegleria fowleri (Patterson et al. 1981), Percolomonas cosmopolitus (Fenchel a Patterson 1986), Percolomonas descissus (Brugerolle a Simpson 2004), Percolomonas sulcatus (Brugerolle a Simpson 2004), Psalteriomonas lanterna (Broers et al. 1990), Lyromonas vulgaris (Broers et al. 1993 1 ), Pleurostomum flabellatum (Park et al. 2007), Willaertia magna (Michel et al. 1987 2 ) a z velmi odvozených bičíkovců druhu Stephanopogon minuta (Yubuki a Leander 2008) a Stephanopogon apogon (Lipscomb a Corliss 1982; Patterson a Brugerolle 1988). Z těchto studií vyplývá, že Heterolobosea mají zachovány nejméně 3 z 8 ultrastrukturních exkavátních znaků definovaných Simpsonem (2003). Konkrétně jde o vlastní exkavátní rýhu (obr. 11, 15), fibrilu I (obr. 23) a R1 rozdělené na vnitřní a vnější část (např. obr. 15). R1 (syn. MTOR) je přitom páska organizující mikrotubuly podpírající exkavátní rýhu a vycházející z báze prvního bičíku. Fibrila I je obvykle přiložena na vnitřní straně R1, a to v jeho nejpřednější části. Simpson (2003) dále uvažuje, že dvojice mikrotubulů vycházející z báze 2. bičíku u Psalteriomonas lanterna by mohla být homologická se strukturou R4, která je vytvořena u mnoha konzervativních exkavátních linií (např. Jakobida, Carpediemonas, Trimastix). Brugerolle a Simpson (2004) spekulují také o tom, že s fibrilou B, která je jedním ze zmiňovaných 8 unikátních ultrastrukturních exkavátních znaků, je ve skutečnosti homologická mikrotubulární fibrila S nalezená u někerých heteroloboseí. Např. u Percolomonas descissus vychází tato fibrila z R1l blízko předního konce exkavátní rýhy 1 Publikována ještě pod názvem Psalteriomonas vulgaris, rod Lyromonas založil později Cavalier Smith 2 Připomínám, že Robinson et al. (1989) ukázali, že název Protonaegleria westphali, pod kterým je tato ultrastruktura publikována, je mladší synonymum právě pro druh W. magna. 6

a prochází šikmo jejím dnem, aby podložila pravou část exkavátní rýhy (obr. 15). Další zajímavou a unikátní strukturou heteroloboseí je rhizoplast (např. obr. 10), což je velká žíhaná fibrila, která může být výrazně prodloužena (např. u rodu Naegleria, viz obr. 20) nebo dokonce i mnohonásobně rozvětvena (např. Tetramitus rostratus, viz obr. 19). Brugerolle a Simpson (2004) spekulují o její homologii s amorfní fibrilou A, která zaujímá podobnou pozici v buňkách některých jiných skupin exkavát. Kromě těchto struktur se v buňce heteroloboseí nachází i koš dorzálních mikrotubulů (obr. 15), který se podílí na zpevnění boků a dorzální části buňky, popřípadě podpírá nápadné rostrum, jenž je vytvořeno např. u druhu Tetramitus rostratus (obr. 37). Významnou strukturou je i mikrotubulární svazek MB, který je přítomen u různých heteroloboseí (u druhu Percolomonas sulcatus je dokonce zdvojen, viz obr. 18). Zřejmě jen u bičíkatých zástupců anaerobní linie vytváří jeho spojení s kořeny 1. a 4. bičíku na jednom konci a R1 na konci opačném charakteristický harfovitý útvar (obr. 10). Tento útvar je zaznamenán v práci Brugerolla a Simpsona (2004) i u druhu Percolomonas descissus (obr. 17), přesto autory nevedl ke spekulacím o jeho příbuznosti s rody Psalteriomonas a Lyromonas. Velmi důležitá je i struktura R1, která se různou měrou spolupodílí na vyztužování exkavátní rýhy (obr. 8, 15-16). Bylo zjištěno (Brugerolle a Simpson 2004), že R1 je vždy spojeno s bazálním tělískem nejstaršího bičíku a R1 s bazálním tělískem 2. nejstaršího bičíku. U heteroloboseí tedy podobně jako u jiných skupin bikont dochází k ciliární transformaci (role bičíku se mění podle jeho stáří). Po dělení se v každé dceřiné buňce dotváří 3. a 4. bičík de novo. Jedna dceřiná buňka si přitom bere nejstarší (1.) a jeden z nejmladších (3.) bičíků mateřské buňky, které se v ní stávají 1. a 2. bičíkem nové buňky. Druhá dceřiná buňka si z mateřské buňky bere 2. a 4. bičík, jež se v ní transformují na 1. a 2. bičík. Bičíky se přitom u čtyřbičíkatých heteroloboseí (Percolomonas sulcatus) organizují do dvou párů, přičemž jeden pár je tvořen 1. a 4. bičíkem, druhý pár pak 2. a 3. bičíkem. Zajímavé je, že zatímco R1l u heteroloboseí podpírá levý bok exkavátní rýhy, u ostatních exkavát tuto roli plní struktura R2, která u heteroloboseí chybí. R1 naproti tomu u ostatních exkavát probíhá dnem exkavátní rýhy (Brugerolle a Simpson 2004). Brugerolle a Simpson (2004) konečně upozorňují i na to, že mastigont čtyřbičíkatých heteroloboseí má spíše charakter dvojice vývojově propojených dikinetid, nežli jedné tetrakinetidy. Kinetida je přitom obecné označení pro základní jednotku bičíků, která je tvořena bazálními tělísky bičíků a přidruženými kořenovými strukturami. Může být tvořena jediným bazálním tělískem (monokinetida), ale i více propojenými bazálními tělísky (dikinetida, tetrakinetida, polykinetida...). 7

2 3 15µm 4 5 6 20µm 20µm Obr. 2-6. Amébovitá stádia heteroloboseí. 2: Anaerobní améba IND7 (DIC); 3: Paravahlkampfia francinae (SEM); 4: Tetramitus angularis (DIC); 5: Euplaesiobystra hypersalinica (DIC); 6: E. hypersalinica, cysta (DIC). Převzato z Park et al. 2009; Visvesvara et al. 2009 a Robinson et al. 2007; obr. 2 pořízen autorem práce. DIC = diferenční interferenční kontrast; SEM = skenovací elektronový mikroskop. Obr. 7-23. Ultrastruktura mastigontu heteroloboseí: fotografie z TEM a rekonstrukce 7-9: Pleurostomum flabellatum (TEM); 10: Psalteriomonas lanterna (TEM); 11: Percolomonas cosmopolitus, celková 3D rekonstrukce při pohledu z nitra exkavátní rýhy; 12 13: Stephanopogon minuta (TEM), dvojitá šipka ukazuje flagelární kapsu podepřenou mikrotubuly; 14: Stephanopogon apogon, rekonstrukce flagelární kapsy. 15: Percolomonas descissus, celková 3D rekonstrukce; 16: Pleurostomum flabellatum, celková 3D rekonstrukce; 17: Percolomonas descissus (TEM) 18: Percolomonas sulcatus, rekonstrukce; 19: Tetramitus rostratus, rekonstrukce; 20: Naegleria gruberi, rekonstrukce; 21: Percolomonas descissus (TEM). 22: Mitochondrie druhu Naegleria fowleri obalené drsným endoplasmatickým retikulem (TEM); 23: Fibrila I přiložená na nejpřednější část struktury R1 (TEM). Vysvětlivky: df dorzální koš mikrotubulů; G (=Cyt) exkavátní rýha; M (=Mit) mitochondrie; MB mikrotubulární svazek; N jádro; R1 (=MTOR); Rh (=Ŕ) rhizoplast; Ros rostrum; S mikrotubulární fibrila S; označení 1, 2, 3, 4 synonymizuje konkrétní bazální tělíska (pozn. na obrázku 10 zachováno staré značení, ve skutečnosti poloha bičíků přesně odpovídá mastigontu P. descissus). Upraveno podle Schuster 1975; Lipscomb a Corliss 1982; Fenchel a Patterson 1986; Brugerolle a Simpson 2004; Park et al. 2007 a Yubuki a Leander 2008. TEM = transmisní elektronový mikroskop. 8

8 7 9 10 200nm 11 3 R4 2 R1r R4 R1l 4 1 R1r 12 13 500nm 5 14 1µm m 9

15 16 Trojice mikrotubulů podpírající okraj rostra MB MB MB 1µm 17 18 19 20 21 1µm Fibrila I R1 22 23 10

Obr. 24-40. Morfologie bičíkovců a bičíkatých stádií heteroloboseí 24a-b: Tetramitus rostratus v různých polohách (SEM); 25: Stephanopogo n minuta (SEM); 26: Lyromonas sp. PC4 (DIC); 27: Lyromonas sp. PC4, barvení protargolem; 28: nákres druhu Percolomonas descissus (dva morfologické typy); 29: Percolomonas descissuss (DIC); 30: nákres druhu Percolomonas spinosus; 31: nákres druhu Percolomonas sulcatus; 32: nákres druhu Adelphamoeba galeacystis (dnes synonymizována s Didascalus thorntoni pod názvem Tetramitus thorntoni); 33: nákres druhuu Tetramitus jugosus; 34: nákres rodu Naegleria; 35: nákres rodů Tetramastigamoebaa a Willaertia (vypadají stejně, zřejmě patří do stejného rodu, sekvenční data chybí); 36: nákres druhu Pharyngomonas Kirbyi; 37: nákres druhu Tetramitus rostratus; 38: nákres druhu Percolomonas cosmopolitus v různých polohách; 39: nákres druhu Heteramoeba clara v různých polohách; 40: nákres Percolomonas elephas. Vysvětlivky: CV kontraktilní vakuola; Cy exkavátní rýha (cytostom); N jádro; VB ventrální praporky. Převzato z Pasher & Lemmermannn 1914; Kirby 1932; Klug 1936; Droop 1962; Balamuth et al. 1983; Fenchel a Patterson 1986; Page 1988; Yubuki a Leander 2008. Fotografie Percolomonas descissuss a Lyromonas sp. PC4 pořízeny autorem práce. 24a 24b 25 10 µm 26 15 µm 29 15 µm 28 15 µm 27 30 11

31 32 33 36 34 35 37 5µm 38 39 40 12

2.2. Fylogeneze kmene Když v roce 1985 Page a Blanton vytvořili taxon Heterolobosea (tehdy na úrovni třídy), zahrnuli do něj dvě do té doby problematicky zařaditelné skupiny améb a améboflagelátů, řády Acrasida a Schizopyrenida. Monofylii heteroloboseí přitom založili na přítomnosti plochých (často diskovitých) mitochondriálních krist, těsné asociaci hrubého endoplasmatického retikula s mitochondriemi, absenci klasicky vyvinutého Golgiho komplexu a na přítomnosti uzavřené intranukleární ortomitózy. Oba řády od sebe odlišili na základě existence/neexistence mnohobuněčného stádia (Page a Blanton 1985). Od té doby vědci v poznání této skupiny sice značně pokročili, přesto spolehlivá rekonstrukce příbuzenských vztahů mezi popsanými druhy dosud není k dispozici. Vnitřní fylogenetické analýzy heteroloboseí jsou zatím založeny pouze na genu pro SSU rrna (např. Nikolaev et al. 2004; Cavalier-Smith a Nikolaev 2008; Park et al. 2009), jehož sekvence z některých klíčových rodů dosud chybí (např. rody Rosculus, Lyromonas, Guttulinopsis, Fonticula, Pseudovahlkampfia, Pernina a Gruberella). Naopak pozice některých rodů, jejichž sekvence SSU rdna k dispozici již máme, zůstává na fylogenetických stromech nestabilní a je často dosti nečekaná. V mých analýzách se to týká zejména linie kolem rodu Neovahlkampfia, méně silně i kolem rodu Paravahlkampfia. Pozice těchto dvou větví se v analýzách různých autorů od sebe skutečně značně liší (k porovnání Cavalier-Smith a Nikolaev 2008; Park et al. 2009). Je proto zcela nezbytné, aby v budoucnu byly osekvenovány i další geny příslušníků tohoto kmene a provedena multigenová fylogenetická analýza. Je zjevné, že bez ní nebude možné příbuzenské vztahy uvnitř tohoto kmene spolehlivě rozřešit. Celý problém ještě umocňuje fakt, že mnoho druhů kmene Heterolobosea netvoří bičíkatá stádia a neobsahuje žádné výrazné cytoskeletální struktury. Nesou tedy jen velmi omezený soubor morfologických a ultrastrukturních znaků využitelných pro rekonstrukci evoluce této skupiny (týká se to např. rodů Vahlkampfia, Sawyeria, Monopylocystis, Rosculus, Neovahlkampfia, Paravahlkampfia, Acrasis a Gruberella). Jsem přesvědčen, že k rekonstrukci fylogeneze kmene Heterolobosea může přispět kromě multigenové analýzy i srovnávací ultrastrukturní studie bičíkatých stádií, které se pro tyto účely osvědčily u řady jiných skupin. Jako příklad může sloužit např. skupina Parabasala (Brugerolle a Patterson 2001). V současnosti ale u mnoha klíčových taxonů heteroloboseí s bičíkatými stádii ultrastrukturní data chybí (za všechny např. Pharyngomonas, Stachyamoeba sp. ATCC 50324, Pocheina flagellata) nebo je nedoplňují sekvenční data 13

(např. Percolomonas sulcatus, Lyromonas vulgaris). Na vysvětlenou dodávám, že Stachyamoeba lipophora Page, 1975 sice bičíkovce netvoří, ale protože její kultura byla ztracena, už se nedovíme její fylogenetickou pozici. Sekvenční data byla naproti tomu získána z uváděného izolátu Stachyamoeba sp. ATCC 50324, u něhož de Jonckheere (2008) nalezl i bičíkaté stádium. Jeho příbuznost s mořskou amébou Stachyamoeba lipophora je však sporná. Přes výše uvedené problémy ale molekulární fylogenetici některé příbuzenské vztahy uvnitř kmene Heterolobosea spolehlivě rozřešili. Výčet spolehlivě rozlišených monofyletických linií: 1) Percolomonas cosmopolitus a Stephanopogon minuta 2) Tetramitus (*) a Vahlkampfia (*) 3) Naegleria (*), Willaertia magna, Tulamoeba peronaphora, Pleurostomum flabellatum a Marinamoeba thermophila 4) Acrasis rosea a environmentální sekvence (AY965862) 5) Neovahlkampfia damariscottae a environmentální sekvence (AY965861; DQ504339) 6) Paravahlkampfia (*) a environmentální sekvence (AY082995) 7) Heteramoeba clara a Euplaesiobystra hypersalinica 8) Sawyeria, Monopylocystis, Psalteriomonas, Lyromonas sp. PC4, Percolomonas descissus (*) a environmentální sekvence (AF011462) 9) Stachyamoeba sp. ATCC 50324 a environmentální sekvence (AM114803) 10) Macropharyngomonas halophila ATCC 50622 Sestaveno na základě výsledků Brown a De Jonckheere 2004; Nikolaev et al. 2004; Garstecki et al. 2005; Cavalier-Smith a Nikolaev 2008; De Jonckheere et al. 2009; Park et al. 2009; Visvesvara et al. 2009 a mých nepublikovaných dat (týká se P. descissus a Lyromonas sp. PC4). Vysvětlivky: symbol (*) označuje větší množství osekvenovaných druhů či izolátů (více než 3). 2.3. Taxonomie kmene (kritické zhodnocení) Současné morfologické, fyziologické, ekologické, etologické a biochemické rozdíly mezi jednotlivými druhy organismů jsou výsledkem jejich postupného vývoje a rozrůzňování ze společného předka. Odhalování příbuzenských vztahů mezi existujícími druhy je bezpochyby jedním z nejdůležitějších úkolů současné biologie, neboť umožňuje pochopit diverzitu života na naší planetě a v budoucnu snad i zákonitosti jeho vývoje. Vyjádření výsledků 14

fylogenetického výzkumu se proto musí jednoznačně odrážet v taxonomii, neboť právě ona je prostředkem, který fylogenetické hypotézy předkládá široké odborné veřejnosti a umožňuje o těchto výsledcích diskutovat a dále je obohacovat. Bylo významným příspěvkem W. Henniga, že zavedl jasná pravidla pro tvorbu fylogenetických hypotéz a propojil je se systematikou a taxonomií. Jasně prohlásil, že jediný důkaz společného předka poskytují sdílené odvozené znaky (synapomorfie) a taxonomie musí být v souladu s rozlišenými příbuzenskými vztahy. Pravidlo monofylie musí být podle něj jednoznačně dodržováno (Hennig 1965). Současná taxonomie kmene Heterolobosea je v příkrém rozporu s výše uvedenými principy. Řada taxonů, které byly uvnitř heteroloboseí vytvořeny a dodnes jsou široce akceptovány, jsou jasně parafyletické (např. Schizopyrenida Singh, 1952; Vahlkampfiidae Jollos, 1917) a nejsou definovány na základě synapomorfií, nýbrž spíše pomocí symplesiomorfií (sdílených primitivních znaků). Jako příklad může sloužit diferenční diagnóza řádu Schizopyrenida založená na absenci mnohobuněčného stádia (Page a Blanton 1985). Další významné zhoršení této situace přinesly práce Prof. Thomase Cavalier-Smithe (např. Cavalier-Smith 1993, 2003; Cavalier-Smith a Nikolaev 2008), které sice nebyly vědeckou komunitou přijaty (až na některé výjimky), ale přesto přispěly k nepřehlednosti taxonomie kmene. Někteří autoři se díky tomu zcela vzdali snahy formálně zařadit jimi popisované rody do určité čeledi (např. O Kelly et al. 2003). Taxonomie heteroloboseí totiž začala komunikaci mezi autory naopak ztěžovat. Nezbývá než dodat, že zatímco některé taxony zavedené Cavalier-Smithem už byly zpochybněny (např. Brugerolle a Simpson 2004), on sám další sporné taxony vytváří (např. Cavalier-Smith a Nikolaev 2008). Jsem přesvědčen, že je zcela nezbytné provést výraznou taxonomickou revizi celého kmene, a to bez ohledu na fakt, že jeho přesnou vnitřní fylogenezi dosud neznáme. Domnívám se, že zavedení jednoduššího systému založeného na taxonech definovaných na základě synapomorfií výrazně usnadní a projasní diskuze o evoluci heteroloboseí. Příslušná revize, o jejímž publikování uvažujeme, bude ale znamenat početné synonymizace čeledí. Doposud byly zavedeny čeledi Acrasidae Van Tieghem, 1880, Vahlkampfiidae Jollos, 1917, Stephanopogonidae Corliss, 1961, Gruberellidae Page a Blanton, 1985, Lyromonadidae Cavalier-Smith, 1993, Psalteriomonadidae Cavalier-Smith, 1993, Percolomonadidae Cavalier- Smith a Nikolaev, 2008 a Pharyngomonadidae Cavalier-Smith a Nikolaev, 2008. Řada z těchto čeledí je přitom založena na znacích, které s vysokou mírou pravděpodobnosti nenesou spolehlivý fylogenetický signál. Mám na mysli zejména charakterizaci čeledí na 15

základě osudu jadérka při mitóze. O tyto znaky se opírá diferenční diagnóza čeledí Vahlkampfiidae, Gruberellidae i Acrasidae (Page a Blanton 1985). Přinejmenším některé čeledi založené Cavalier-Smithem byly vytvořeny na míru určitých druhů a jejich definice je proto zcela nepřijatelná. Jako příklad uvádím diagnózu Percolomonadidae Cavalier-Smith, 2008, v níž je jediným unikátním znakem to, že nejdelší bičík může sloužit k přichycení na substrát (Cavalier-Smith a Nikolaev 2008). V takovém případě by ale do této čeledi patřil pouze druh Percolomonas cosmopolitus. Ostatní druhy tohoto rodu, kterým se ovšem Cavalier-Smith vůbec nevěnuje, tuto diferenční diagnózu nesplňují. Pharyngomonadidae Cavalier-Smith a Nikolaev, 2008 je v současnosti jedinou čeledí heteroloboseí, která nepřispívá k parafylii čeledi Vahlkampfiidae. Obsahuje pouze rod Pharyngomonas a je definována na základě plesiomorfií (absence měňavkovitého stádia i pro ostatní heterolobosea unikátního 17_1 helixu v SSU rrna). Jejím apomorfním znakem by mohlo být odlišné směřování předních a zadních bičíků, ultrastrukturní analýza však chybí. Postavení této čeledi ve fylogenezi je založeno na sekvenci SSU rdna získané z izolátu Macropharyngomonas halophila, avšak její diferenční diagnóza (s výjimkou jasně plesiomorfní absence 17_1 helixu) vychází z Kirbyho ilustrace druhu Percolomonas salinus (Kirby 1932), kterého Cavalier-Smith přesouvá do nového rodu Pharyngomonas. Z izolátu Macropharyngomonas halophila přitom nejsou publikována žádná morfologická data. Cavalier-Smith a Nikolaev (2008) ve své práci vychází z ústního sdělení T. Nerada, že jsou si oba organismy velice podobné. Pro definitivní uznání této čeledi bude proto zcela nezbytné provést podrobnou morfologickou (nejlépe ultrastrukturní) analýzu izolátu Macropharyngomonas halophila ATCC 50622. Věřím, že se tím odhalí dostatečné apomorfie, které umožní náležitou diferenční diagnózu čeledi Pharyngomonadidae, neboť izolát Macropharyngomonas halophila je na fylogenetických stromech sesterský všem ostatním heteroloboseím (Nikolaev et al. 2004; Cavalier-Smith a Nikolaev 2008). Čeleď Vahlkampfiidae je ze všech čeledí heteroloboseí největší, ale je také jasně parafyletická. V současnosti ji není možné rozdělit na monofyletické linie (absence spolehlivých znaků a nejasné fylogenetické vztahy). Jejím typovým rodem je rod Vahlkampfia Chatton a Lalung-Bonnaire, 1912, který je definován dvěma nespolehlivými znaky, totiž absencí bičíkatého stádia a pórů v cystě. Není proto divu, že se tento rod ukázal být výrazně polyfyletický (Brown a De Jonckheere 1999; Nikolaev et al. 2004). Některé jeho druhy byly vyčleněny do samostatných rodů Neovahlkampfia a Paravahlkampfia (Brown a De Jonckheere 1999), řada druhů byla na základě molekulárních dat přesunuta do rodu 16

Tetramitus (např. Brown a De Jonckheere 1999; De Jonckheere a Brown 2005a). Druh Vahlkampfia anaerobica je zřejmě příbuzný rodu Monopylocystis (O Kelly et al. 2003). V této souvislosti má své opodstatnění upozornění, že Brownová a De Jonckheere (1999) porušili pravidla ICZN (International Code of Zoological Nomenclature), když za "nový typový druh" rodu Vahlkampfia stanovili druh Vahlkampfia avara. Podle pravidel ICZN má naopak přednost druh Vahlkampfia vahlkampfi (Chatton, 1910), který byl stanoven Pagem (1967). Molekulární data z V. vahlkampfi však chybí a není důvod na základě dostupných morfologických dat předpokládat, že by tento druh měl být členem rodu Vahlkampfia a nikoliv např. rodů Neovahlkampfia či Paravahlkampfia. Fylogenetická pozice druhu V. vahlkampfi je proto nejasná a mohla by způsobit problémy při pozdějším rozdělování této čeledi. Fylogenetické analýzy totiž naznačují, že např. rod Neovahlkampfia se v evoluci odvětvil hned po čeledi Pharyngomonadidae (Park et al. 2007, 2009). S problémy se setkáváme i u vyšších taxonomických stupňů heteroloboseí. Cavalier- Smith a Nikolaev (2008) vytvořili samostatný podkmen Pharyngomonadea. Vyšli přitom z předpokladu, že se amébovitá fáze v evoluci kmene vytvořila až po oddělení čeledi Pharyngomonadidae. Taxon Heterolobosea v jejich pojetí nemá status kmene, nýbrž třídy. Vedle třídy Percolatea (Percolomonas, Stephanopogon) a Lyromonadea (Lyromonas, Psalteriomonas, Sawyeria, Monopylocystis) jde o jednu ze tří tříd podkmene Tetramitia. Podkmeny Tetramitia a Pharyngomonadea pak tito autoři řadí do kmene Percolozoa Cavalier- Smith, 1991. Osobně se nebráním zavedení taxonu Percolozoa, ačkoliv jej v této práci nepoužívám. Jeho základní členění je ale mnohem lépe vést mezi skupinou Pharyngomonadea a Heterolobosea. Není jediný relevantní důvod k tomu, abychom z heteroloboseí udělali parafylum (Percolatea a Lyromonadea jsou ve skutečnosti jen vnitřními odvozenými liniemi heteroloboseí). V mém pojetí skupiny Percolozoa jsou Heterolobosea korunovou skupinou (sdílí 17_1 helix a jejich předek vytvořil měňavkovitou životní fázi). Pharyngomonadea jsou naopak součástí kmenové linie, u níž ještě nedošlo k vytvoření amébovité fáze. Apomorfie skupin Percolozoa a Pharyngomonadea ale bude nutné teprve stanovit. I z toho důvodu je potřeba provést ultrastrukturní analýzu Macropharyngomonas halophila. Věnujme nyní pozornost diagnózám nižších taxonomických úrovní (rod, druh). Často se zde využívá detailní struktury cyst a přítomnosti určitých životních forem (cysta, měňavka, bičíkovec). Je potřeba ale zdůraznit, že k potlačení bičíkaté či amébovité fáze došlo v rámci kmene Heterolobosea evidentně mnohokrát a tento znak se ukázal být nestabilní i v rámci jediného rodu. Jako příklad této nestability mohou posloužit oba nejlépe prozkoumané rody 17

kmene Heterolobosea, tj. rod Tetramitus (De Jonckheere a Brown 2005b) a Naegleria (De Jonckheere et al. 2001). Pokud jsou přítomna bičíkatá stádia, využívá se tvaru exkavátní rýhy a počtu bičíků (i když není u všech druhů zcela stálý). Taxonomický význam mají i ekologická data (život ve slané, respektive sladké vodě). Na rodové úrovni je tento znak dosti stabilní (např. všechny druhy rodů Vahlkampfia a Naegleria jsou sladkovodní), ale na vyšší úrovni již použitelný není. 2.4. Druhový koncept kmene Když se ukázalo, že některé améby a améboflageláti patřící mezi Heterolobosea mohou způsobovat závažná onemocnění nejen zvířat, ale i lidí, bylo nutné najít způsob, jak jasně a jednoduše rozlišit patogenní druhy od jim příbuzných neškodných druhů. Při tomto hledání se ale ukázalo, že morfologická a fyziologická data buď nemají, zejména v případě měňavek, dostatečnou rozlišovací schopnost, nebo je determinace izolátů danými metodami velmi obtížná a zdlouhavá (Brown a De Jonckheere 1999). Zmiňovaná odborná i časová náročnost druhové determinace vyplývá z toho, že např. u parazitologicky významného rodu Naegleria jsou znaky na struktuře cyst a na morfologii bičíkatého stádia nedostačující a musí se proto zjišťovat i teplotní nároky, provádět testy patogenity na myších (např. De Jonckheere 2002), izoenzymová analýza (De Jonckheere 1982), popřípadě i RFLP genomové DNA (McLaughlin et al. 1988). Uvedené problémy se ve svých pracích pokusili překonat De Jonckheere a Brownová, kteří založili druhový koncept heteroloboseí na genových sekvencích. Tito autoři si na základě RFLP genu pro SSU rrna povšimli, že druhy řazené do rodu Vahlkampfia jsou si velice vzdálené (Brown a De Jonckheere 1994). Stejní autoři proto gen pro SSU rrna u příslušných izolátů osekvenovali a provedli fylogenetickou analýzu. Pouze na základě této analýzy a vzájemných distancí jednotlivých druhů vytvořili nové rody Neovahlkampfia a Paravahlkampfia (Brown a De Jonckheere 1999). Stejný přístup pak De Jonckheere uplatnil i u rodu Naegleria (např. De Jonckheere 2002). Kromě genu pro SSU rdna k stanovení hranic mezi druhy tohoto rodu začal De Jonckheere později využívat též sekvence variabilnějších oblastí, konkrétně 5.8 rdna, ITS1 a ITS2 (např. De Jonckheere 2002, 2004). V roce 2005 molekulární koncept druhu založený na ITS rozšířil dokonce na celou čeleď Vahlkampfiidae, neboť přišel s tím, že pro rozlišování mezi rody čeledi Vahlkampfiidae je vhodné porovnávat 5.8 rdna sekvence a mezi druhy též délku a sekvenci ITS1 či ITS2 (De Jonckheere a Brown 2005a). Sám De Jonckheere (2004) ale upozorňuje na to, že ITS oblasti 18

jsou z nevysvětlených příčin poměrně variabilní i uvnitř druhu Naegleria fowleri. Nejvážnější námitku proti tomuto konceptu ale přinesli Dyková et al. (2006). Připravili klonální kultury několika izolátů rodu Naegleria a vyextrahovanou DNA několikrát nezávisle amplifikovali a osekvenovali příslušné ITS oblasti. Zjistili, že se sekvence získané z jedné klonální kultury liší až v 8 bp. Vzhledem k tomu, že De Jonckheere považuje i odlišnost v 1 bp za druhový znak a přes 20 druhů rodu Naegleria je definováno výlučně jen odlišností v sekvenci ITS oblastí, dostává tento De Jonckheereův přístup vážné trhliny (Dyková et al. 2006). Osobně se nebráním molekulárnímu určení druhu heteroloboseí, přijde mi ale vhodnější trochu jiná cesta. Sekvence se totiž dají využít dvojím způsobem, buďto se z nich udělají fylogenetické stromy, nebo se pouze seřadí pod sebou (alignment) a najdou se diagnostické úseky jednoznačně určující daný taxon (DNA barcoding). Právě hledání těchto charakteristických úseků by podle mého názoru mohlo molekulární koncept druhu heteroloboseí oživit. Takové hledání ale nelze provádět, máme-li od každého potenciálního druhu jen jednoho jedince, respektive jedinou klonální kulturu, neboť je nutné odlišit variabilitu uvnitř druhu od variability mezidruhové (DeSalle et al. 2005). III. Extremofilní Heterolobosea 3.1. Heterolobosea v extrémně zasoleném prostředí Průměrná salinita mořské vody je 35. Některé mořské druhy jsou schopny žít také v prostředích, která mají salinitu až 150 (halotolerantní druhy). Extrémně hypersalinní habitaty vyznačující se salinitou vyšší než 150 však obývají pouze organismy, které si vyvinuly řadu zvláštních přizpůsobení a normální hodnotu salinity obvykle v aktivním stavu nepřežijí. Takové organismy označujeme jako halofilní (*Javor 1989; převzato z Gunde- Cimerman et al. 2005). Poměrně výjimečně jsou schopny některé halofilní druhy prvoků obývat i prostředí, jenž má charakter téměř nasyceného solného roztoku (salinita nad 300 ). Toto prostředí je pro bakteriovorní prvoky lákavé, protože jej obývají početné populace prokaryot a jen několik málo druhů eukaryovorních predátorů. Dosud z něj bylo popsáno okolo 40 druhů různých druhů heterotrofních prvoků, mezi Heterolobosea patří 12 z nich. Jmenovitě jde o Pleurostomum flabellatum, P. parvulum, P. gracile, P. turgidum, P. caudatum, P. salinum, Tetramitus cosmopolitus, Tetramitus ovoideus (oba dnes Percolomonas cosmopolitus), Vahlkampfia salina, Hyalodiscus limax, Euplaesiobystra hypersalinica a Tulamoeba peronaphora (příloha k Park et al. 2009). Pleurostomum flabellatum přitom optimálně pro svůj růst potřebuje salinitu 300 a nepřežije salinitu nižší 19

než 150 (Park et al. 2007). E. hypersalinica prosperuje v salinitě 100 300, T. peronaphora je o něco méně extremofilní, v laboratoři přežívá salinitu 75 250, v přírodě zřejmě i vyšší (Park et al. 2009). Dnes víme, že uvnitř skupiny Heterolobosea došlo k přizpůsobení extrémně slanému prostředí (nad 300 ) alespoň dvakrát nezávisle na sobě. Jednou u předka rodů Pleurostomum a Tulamoeba, podruhé u rodu Euplaesiobystra (Park et al. 2007, 2009). V budoucnu se pravděpodobně ukáže, že takových událostí bylo v evoluci kmene Heterolobosea ještě více. Stále totiž chybí molekulární data z extrémně halofilního izolátu jinak mořského druhu Percolomonas cosmopolitus a také z druhů Vahlkampfia salina a Hyalodiscus limax. Na druhou stranu je ale potřeba dodat, že Hyalodiscus limax nápadně připomíná druh Euplaesiobystra hypersalinica. Vahlkampfia salina (syn. Amoeba salina) podle stejných autorů svými vlastnostmi připomíná druh T. peronaphora, ale v některých vlastnostech se přece jen liší (Park et al. 2009). Halofilní je také rod Pharyngomonas, není ale jasné, v jaké salinitě je schopen prosperovat (Park et. al. 2009 na základě studia prací dřívějších autorů hovoří o rozmezí 30 220 ). Z evolučního hlediska je ale fylogenetická pozice rodu Pharyngomonas velmi zajímavá, neboť je zřejmě sesterský všem ostatním heteroloboseím (Nikolaev et al. 2004; Cavalier-Smith a Nikolaev 2008). Předznamenává tak řadu možných preadaptací k životu v hypersalinním prostředí již u společného předka všech heteroloboseí. Je zřejmé, že největším problémem, se kterým se musí organismy v prostředí s vysokou salinitou vyrovnat, je vysoká koncentrace iontů vně buňky, která vede k vylučování vody. O mechanismech, kterými se s tímto problémem vypořádala halofilní Heterolobosea, nevíme vůbec nic. Dosud však známe pouze dvě strategie, kterými to dělají ostatní organismy. Buďto v cytoplasmě kumulují soli ("salt-in" strategie), nebo malé organické látky, konkrétně deriváty aminokyselin a cukrů ("compatible-solute" strategie) (Oren 2002). Salt-in strategie je přitom známa pouze u prokaryotických skupin Halobacteriales a Haloanaerobiales, vyžaduje totiž přizpůsobení struktury proteinů vysoké koncentraci solí v cytoplasmě. Druhá strategie je mezi halofily daleko běžnější, neboť při ní nedochází k inhibici enzymů přizpůsobených na běžnou koncentraci solí (Oren 1999). 3.2. Acidofilní Heterolobosea Přestože extrémně kyselá prostředí (ph nižší než 3) mohou vznikat i zcela přirozenou cestou, jejich plocha se výrazně zvětšila díky činnosti člověka (počínaje průmyslovou revolucí). Časté jsou tyto habitaty zejména v dolech (těžba uhlí a kovů). Jedním z důležitých 20

doprovodných faktorů, se kterými se musí acidofilní organismy vyrovnat, je vysoká koncentrace rozpuštěných kovů. Kovy se zde mohou uvolňovat přímo oxidací sulfidových minerálů nebo zvětráváním hornin v důsledku působení extrémně kyselé vody, jíž jsou tyto horniny vystaveny (Johnson 1998). Pro heterotrofní prvoky je extrémně kyselé prostředí velmi lákavé, protože je zde nízká konkurence a obrovské množství potravy. Primární produkce je zajišťována zejména bakteriemi oxidujícími síru a železo. Chudé osídlení eukaryoty je typické obzvláště pro ty extrémně kyselé habitaty, které mají teplotu vyšší než 35 o C (Johnson 1998). Kupodivu i extrémně kyselému prostředí se Heterolobosea přizpůsobila opakovaně, minimálně třikrát nezávisle na sobě. Linii heteroloboseí blízce příbuznou rodu Paravahlkampfia nalezli Amaral-Zettler et al. (2002) v Rio Tinto (Španělsko) při ph 2. Extrémně acidofilního příslušníka rodu Naegleria identifikovali Sheehan et al. (2003) v oblasti Nymph Creek (USA). Hodnota ph na studované lokalitě byla 2,7. V obou zmiňovaných případech šlo ale pouze o zachycení sekvencí (přístupová čísla databáze GenBank AY082995 a AY268958). Naproti tomu druh Tetramitus thermacidophilus byl z extrémně kyselého prostředí dokonce vykultivován a nejen molekulárně, ale i morfologicky a fyziologicky charakterizován (Baumgartner et al. 2009). Jeho ph optimum je na hodnotě 3, ale přežívá ph 1,2 5. Autoři ho zachytili na dvou geograficky vzdálených lokalitách (Itálie, Kamčatka). 3.3. Heterolobosea s neobvyklými nároky na teplotu Mezi příslušníky kmene Heterolobosea nacházíme poměrně bohaté spektrum druhů s neobvyklými (byť ne přímo extrémními) nároky na teplotu prostředí. Z dostupných dat je zřejmé, že k přizpůsobení teplotám nižším než 15 o C a vyšším než 40 o C došlo u heteroloboseí opakovaně. Nejtermofilnější Eukaryota mají maximální růstovou teplotu kolem 60 o C (Rothschild a Mancinelli 2001). Tetramitus thermacidophilus, snad nejtermofilnější známý zástupce heteroloboseí, dosahuje zhruba o 6 o C méně (Baumgartner et al. 2009). V současnosti jsou teplotní nároky, pokud jde o kmen Heterolobosea, velmi podrobně zpracovány zejména u rodů Naegleria a Tetramitus (Guzmán-Fierros et al. 2008; Robinson et al. 2007). Bylo zjištěno, že jednotlivé druhy těchto dvou rodů se od sebe svými teplotními nikami často nápadně odlišují a jsou součástí mikrobiálních společenstev od polárních oblastí po tropy. Díky cystám jsou zřejmě schopny se rychle šířit na vhodné lokality. Objevuje se 21

proto snaha využít těchto druhů pro monitoring dopadu klimatických změn ve složení společenstev polárních oblastí (Robinson et al. 2007). V tomto textu není prostor a ani důvod pro rozsáhlý výčet teplotních nároků jednotlivých druhů heteroloboseí, spokojíme se proto s několika dobře prozkoumanými příklady. Tulamoeba peronaphora a jí příbuzná Marinamoeba thermophila roste i při 50 o C, Euplaesiobystra hypersalinica při 43 o C (Park et al. 2009; De Jonckheere et al. 2009). Příslušníci rodu Naegleria prosperují maximálně při teplotě 45 o C. Při této teplotě roste ale hned 6 druhů tohoto rodu, které zřejmě nejsou bezprostředně příbuzné. Hranici 40 o C je přitom schopno přežít 20 ze 47 molekulárně charakterizovaných druhů rodu Naegleria, u nichž byly teplotní nároky studovány (Guzmán-Fierros et al. 2008). Při teplotě 42 o C dosahuje maximálního růstu Paravalkampfia sp. V453 nalezená v trávicím traktu plazů (Schuster et al. 2003). Pleurostomum flabellatum vyžaduje pro svůj růst optimální teplotu 40 o C, ale je schopno přežít i při teplotě 45 o C (Park et al. 2007). Vahlkampfia signyensis, izolovaná na území Jižních Orknejí, je příkladem opačného pólu teplotních nároků heteroloboseí, neboť má růstové optimum při 10 o C, neroste při 30 o C a prosperuje i ve 4 o C (Garstecki 2005). Psychrofilní je i Tetramitus vestfoldii, který byl izolován z bentosu slaného jezera v Antarktidě a pěstován při 5 o C (Murtagh 2002). Některé druhy rodu Naegleria jsou také přizpůsobeny životu v chladných a polárních oblastech (De Jonckheere 2006). a v extrémním případě (Naegleria antarctica) nepřežijí teplotu vyšší než 28 o C (De Jonckheere 2004). 3.4. Heterolobosea žijící v prostředí s nedostatkem kyslíku Není tomu tak dávno, kdy existovalo silné přesvědčení o tom, že nejprimitivnější dnes žijící Eukaryota se oddělila dříve, než došlo k endosymbióze α-proteobakterie a vzniku mitochondrie. Toto přesvědčení bylo podepřeno analýzami sekvencí genu pro SSU rrna a absencí mitochondrií u druhů, které si v nich sedaly na bázi eukaryot. Řada vědců se v těchto vzrušujících dobách probírala bahnem vodních nádrží i sedimentem oceánů, aby našla další zástupce bazální eukaryotické linie nazvané Archezoa (např. Cavalier-Smith a Chao 1996). Když bylo odhaleno, že tyto analýzy založené na sekvencích SSU rdna jsou zatíženy artefakty (Morin 2000) a absence mitochondrií u těchto linií je pouze domnělá (např. Tovar et al. 1999; Hampl et al. 2008), hypotéza Archezoa definitivně padla. V moderních analýzách, ve kterých byly příslušné artefakty odstíněny, se ukázalo, že už předek všech dnes známých eukaryot mitochondrii obsahoval. K její redukci 22

a přizpůsobení k životu v prostředí s nízkým obsahem kyslíku došlo v evoluci eukaryot mnohokrát nezávisle na sobě (souhrn např. Roger a Simpson 2009). Nejvíce linií s redukovanými mitochondriemi nacházíme v říši Excavata. Přestože taxon Discoba je převážně aerobní a má klasické mitochondrie, i zde bylo objeveno několik takových linií. Také uvnitř heteroloboseí existuje celkem významná, byť opomíjená skupina několika rodů, které obývají kyslíkem chudá prostředí a redukovaly své mitochondrie do podoby tzv. hydrogenosomů, které mimo jiné ztratili mitochondriální kristy. O jejich biochemii se neví téměř nic, podrobněji byly studovány pouze hydrogenosomy druhu Psalteriomonas lanterna. Zjistilo se například, že obsahují ferrodoxin, který je charakteristickým donorem elektronů pro enzym hydrogenázu (Brul et al. 1994). Hydrogenosom Psalteriomonas lanterna je obklopen jednou či dvěma cisternami drsného endoplasmatického retikula (Hackstein et al. 2001). Do této anaerobní linie heteroloboseí jsou kromě zmiňovaného améboflageláta druhu Psalteriomonas lanterna řazeny i měňavky Monopylocystis visvesvarai a Sawyeria marylandensis (O Kelly et al. 2003). Patří sem také bičíkovec Lyromonas vulgaris a překvapivě i Percolomonas descissus, který byl dosud považován za příslušníka rodu Percolomonas. Při mém výzkumu heteroloboseí jsem získal sekvence SSU rdna jak z Lyromonas sp. PC4, tak z Percolomonas descissus (14 izolátů z celého světa). Když jsem provedl detailní fylogenetickou analýzu anaerobní linie (viz. obr. 41), čekalo mě další překvapení. Zatímco améboflagelát Psalteriomonas lanterna je příbuzný amébě druhu Sawyeria marylandensis (O Kelly et al. 2003), Lyromonas sp. PC4 se ukázal být téměř identický s amébou Monopylocystis visvesvarai. Sladkovodní bičíkovec Percolomonas descissus se usadil na bázi skupiny Lyromonas sp. PC4 + Monopylocystis. Toto rozložení tedy dále podporuje hypotézu, že předek anaerobní linie měl schopnost tvořit stádium améby i bičíkovce, ba dokonce umožňuje rekonstruovat strukturu jeho mastigontu (Psalteriomonas i Percolomonas descissus mají téměř identický mastigont, čehož si, kupodivu, nikdo dosud nevšiml obr. 10 a 21). Pokud se jedná o ekologii anaerobní linie, parsimonnější je hypotéza, že nejbližší společný předek byl sladkovodní (Percolomonas descissus, Psalteriomonas lanterna a Sawyeria a Lyromonas vulgaris jsou pouze sladkovodní, Lyromonas sp. PC4 a Monopylocystis visvesvarai jsou naproti tomu mořské druhy). Kromě zmiňovaných druhů je známa ještě environmentální sekvence uložená v databázi GenBank pod označením AF011462, ta si v mé analýze stabilně sedá na bázi linie Lyromonas sp. PC4 a Monopylocystis visvesvarai. 23

Kromě této hlavní anaerobní linie kmene Heterolobosea obývá prostředí s nízkým obsahem kyslíku ještě druh Vahlkampfia anaerobica (neznámá fylogenetická pozice) a Pleurostomum flabellatum. V. anaerobica patrně patří do výše popsané anaerobní linie, podobá se totiž rodu Monopylocystis, liší se např. přítomností uroidu a plovoucí formy (Smirnov et al. 1996). Bičíkovec Pleurostomum flabellatum není této linii blízce příbuzný. Obývá hypoxické prostředí s 3x nižší koncentrací kyslíku než má mořská voda a patrně nemá mitochondriální kristy, více se o něm ale neví (Park et al. 2007). AF011462 Percolomonas descissus Obr 41. Fylogeneze hlavní anaerobní linie kmene Heterolobosea Nezakořeněný strom je založen na sekvencích SSU rdna, jeho základní topologie byla konstruována metodou maximální věrohodnosti (ML). Uvedené bootstrapové hodnoty odpovídají po řadě metodám MP/MLdist/ML. Sekvence ostatních heteroloboseí byly v obrázku nahrazeny šedým trojúhelníkem. Naše nepublikované sekvence jsou označeny černě. Červená úsečka označuje odlišnou fylogenetickou pozici Percolomonas cosmopolitus od Percolomonas descissus, který je členem hlavní anaerobní linieheteroloboseí. 24

IV. Acrasida, mnohobuněčná Heterolobosea V současné době je věnována velká pozornost výzkumu vzniku mnohobuněčnosti a spolupráce buněk. Jedním z hlavních modelů je Dictyostelium discoideum, které patří do říše Amoebozoa (viz Shaulsky a Kessin 2007). Do 70. let nebyl důvod pochybovat o tom, že jsou mu blízce příbuzné i akrásie, např. rody Pocheina (syn. Guttulina), Acrasis a Guttulinopsis (dnešní skupina Acrasida). Už na počátku 70. let se ale začaly objevovat indicie, které naznačovaly, že akrásie nejsou ostatním hlenkám vůbec příbuzné. Jedním z hlavních důvodů těchto úvah bylo zjištění, že mají ploché (diskovité) mitochondriální kristy (Dykstra 1977), odlišný průběh tvorby plodniček a lobopodie (Olive 1970). Celý problém pak vyvrcholil prací Page a Blantona (1985), kteří ukázali, že skupina Acrasida je příbuzná améboflagelátům řádu Schizopyrenida a formálně založili novou třídu s názvem Heterolobosea. Příslušnost akrásií (resp. druhu Acrasis rosea) ke skupině Heterolobosea později definitivně potvrdila molekulární fylogenetika (Roger et al. 1996; z nejnovějších fylogenomických analýz např. Hampl et al. 2009). Ačkoliv sekvenční data jsou doposud k dispozici pouze z Acrasis rosea, není důvod pochybovat o blízké příbuznosti rodů Acrasis a Pocheina, neboť jsou si skutečně velice podobné. Méně zřejmá je ale fylogenetická pozice rodu Guttulinopsis. Jednotlivé buňky, respektive malé skupiny buněk v plodničce Guttulinopsis jsou totiž navzájem odděleny sítí extracelulárních filament, zatímco u Acrasis nikoliv (Erdos a Raper 1978). Kromě toho obsahují mitochondrie Guttulinopsis zvláštní helikální inkluze a nejsou obklopeny drsným endoplasmatickým retikulem (Dykstra 1977). V posledních více než 10 letech skupině Acrasida nikdo nevěnoval hlubší pozornost. Podle mého názoru má velký potenciál ve výzkumu komunikace mezi buňkami. Lze ji využít například pro nezávislé ověření některých závěrů, ke kterým došel výzkum spolupráce mezi buňkami u diktyosteliidů, zejména pak skupinového a příbuzenského výběru (např. Strassmann et al. 2000; Mehdiabadi et al. 2006). Podobně jako u rodu Dictyostelium, i u akrasií totiž dochází k nahromaďování dříve samostatně žijících buněk do podoby mnohobuněčného útvaru. Vlastní agregace má ale jedinečný průběh, buňky se k centru pohybují jednotlivě či v malých skupinkách, nikdy ne v proudech. Přinejmenším buňky Acrasis rosea neodpovídají na přítomnost camp, který je signálem pro začátek shlukování a tvorby mnohobuněčné fáze u rodu Dictyostelium. Na rozdíl od něj postrádají i pohyblivé stádium slimáka, které ovšem chybí též u některých jiných dictyosteliidů (Bonner 2003b). U rodů Acrasis a Pocheina nedochází k odumírání buněk při tvorbě plodničky (Olive a Stoianovitch 1960; Olive 1970). Naopak Guttulinopsis má větší plodničky a stejně jako 25

Dictyostelium i více buněčných typů. Rozlišení buněčných typů tedy souvisí zřejmě s velikostí (Bonner 2003b). Předpokládá se, že alespoň za část nápadné konvergence mezi mnohobuněčností skupin Acrasida a Dictyosteliida může suchozemský původ obou těchto mnohobuněčných linií. Vedle nich se v suchozemském prostředí vyvinula i mnohobuněčnost myxobakterií či nálevníka rodu Sorogena (Bonner 1998). Jejich předkové patrně obývali půdu, kde se živili převážně bakteriemi. Ty se ale vyskytují nestejnoměrně, v závislosti na množství hnijících zbytků rostlin a živočichů. Půdní bakteriovorní predátor tak může dlouhodobě přežít pouze tehdy, je-li schopen přejít do klidového stavu, popřípadě se efektivně přemisťovat mezi těmito pomíjivými ostrůvky hojnosti. Vůbec nejjednodušší cestou je prostá encystace solitérní buňky. Schema vzniku mnohobuněčnosti u akrasií a dictyosteliidů se pokusil popsat Bonner (2003a). Představuje si, že nezbytným evolučním krokem vzniku této agregativní formy mnohobuněčnosti bylo shromáždění buněk z blízkého okolí před vlastní encystací do jediného centra. Upozorňuje totiž, že někteří půdní bezobratlí (např. hlístice) aktivně vyhledávají půdní améby a konzumují je. Větší koncentrace améb je pak zárukou vyšší atraktivity pro tyto predátory, kteří ale zároveň nejsou schopni cysty strávit, a proto je pouze roznesou do okolí (experimenty týkající se viability cyst prošlých trávicím traktem Caenorhabditis elegans provedl např. Kessin et al. 1996). Následuje další evoluční krok, rozdělení práce buněk (u druhů s většími plodničkami). Některé buňky zůstanou vespod tvořícího se shluku a budou tvořit stopku plodničky, jiné se na jejím vrcholu budou moci encystovat. Životní cyklus některých dictyosteliidů byl pak doplněn také o pohyblivé a přitom odolné mezistádium slimáka. Z hlediska evoluce kmene Heterolobosea je důležité, jsou-li solitérní buňky druhů patřících mezi Acrasida vždy měňavkovité, nebo jestli i zde existují exkavátní bičíkovci, podobně jako u jiných linií heteroloboseí. Ultrastruktura takových bičíkovců totiž může v budoucnu poskytnout řadu na sekvenčních datech nezávislých znaků odkazující na fylogenetickou pozici akrasií uvnitř heteroloboseí. Z tohoto pohledu vystupuje význam druhu Pocheina flagellata, který je za určitých okolností schopen vytvářet bičíkatou formu se dvěma bičíky a potravní rýhou. Někdy se u něj nejprve vytváří čtyřbičíkaté dvoujaderné buňky (obr. 43), které se poté rozdělí na dva dvoubičíkaté jedince (Olive et al. 1983). Mezi akrasie řadí někteří autoři i další hlenkovité organismy s neznámou fylogenetickou pozicí. Zejména se hovoří o rodu Fonticula (Page a Blanton 1985; Blanton 2001), který je velice podobný rodu Guttulinopsis, ale jeho amébovitá forma netvoří eruptivní lobopodie, nýbrž filopodie (Worley et al. 1979). 26

42 43 44 46 45 47 Obr. 42-48. Acrasida 42: Pocheina flagellata, plodnička (SM); 43: P. flagellata bičíkovec s patrnou exkavátní rýhou (SEM); 44: P. flagellata, dělící se bičíkovec (SEM); 45: P. flagellata, plodnička (SEM); 46: životní cyklus Acrasis rosea; 47: Guttulinopsis nivea, plodničky (SM). 48: Pocheina rosea, plodnička (SEM). Převzato z Olive 1975; Raper et al. 1977; Olive et al. 1983. SM = světelný mikroskop. 48 27