Základní přednáška Doc.RNDr. Pavel Coufal, Ph.D. RNDr. Radomír Čabala, Dr. Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie
GC - Definice fyzikálně-chemická metoda separace směsi látek na základě jejich rozdělování mezi dvě fáze, z nichž jedna je plynná a pohybuje se a druhá je pevná nebo kapalná a je nepohyblivá lze ji použít na separaci plynných látek nebo látek, které lze definovaným způsobem převést do plynného stavu
Výhody GC nízké nároky na provedení konstantní průtok/tlak mobilní fáze stlačený nosný plyn tlakové regulátory ventily vysoká robustnost a citlivost první komerčně vyvinutá přístrojová chromatografická technika
: podíl na trhu Univerzity, státní instituce 19% Chemie, petrochemie, plyn, ropa 18% Zemědělské, potravinářské 14% Nezávislé testovací 7% Ostatní 9% Farmaceutické 33% Zdroj: The Column, February 2008, www.thecolumn.com
Chromatografie Rozdělení chromatografických metod podle fází a technik Mobilní fáze Stacionární fáze Technika Zkratka Tuhá látka Plynová adsorpční chromatografie GSC Plyn Kapalina Plynová rozdělovací chromatografie GLC Superkritická kapalina Tuhá látka Superkritická fluidní chromatografie SFC Adsorpční kapalinová chromatografie LSC Vylučovací chromatografie SEC Iontově výměnná chromatografie IEC Kapalina Tuhá látka Afinitní chromatografie AC Reverzní chromatografie RPC Kapilární elektrochromatografie CEC Kapalina Chromatografie kapalina-kapalina Micelární elektrokinetická chromatografie LLC MEKC
Blokové schéma plynového chromatografu tok nosného plynu signál řídící signály Zdroj nosného plynu Regulace průtoku nosného plynu Dávkovač Kolona Detektor Termostaty Vzorek dělič toku Regulace teploty Vyhodnocovací a řídící zařízení analytická informace
Plynový chromatograf GC 0,8 CHROMATOGRAM signál detektoru, mv 0,6 0,4 0,2 N2 O2 CH4 CO 0,0 0 2 4 6 8 10 retenční čas, min TERMOSTAT
Separace - definice Separace operace, při které se vzorek rozdělí alespoň na dva podíly odlišného složení dochází ke zvyšování molárního zlomku alespoň jedné složky původního vzorku oproti ostatním odlišují se selektivitou rozsahem použitelnosti frakcionační kapacitou
Separace v GC probíhá v kapilární nebo náplňové separační koloně, která obsahuje nepohyblivou fázi (sorbent) a pohyblivou fázi (nosný plyn, inertní plyn či eluent). vzorek nosný plyn sorbent analyt eluát Rozdílné analyty mají rozdílnou afinitu k sorbentu. Různé analyty vykazují různou distribuci mezi sorbentem a eluentem. Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány).
Struktura chromatografické kolony Termodynamické fáze Mobilní (mf) Stacionární Sektory Proudící mf (v prostoru mezi zrny) Stagnantní (uvnitř pórů částic náplně) Stacionární (na povrchu nosiče) Nosič -stěna kolony Kinetické zóny Pohyblivá Statická
Lineární rychlost nosného plynu p x 6 5 4 3 2 1 p i = 5 atm p = 1 atm o u u x o 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 p p i o =5 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 x / L L 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 x / L p p p i x u u u i x o o
Regulace a měření průtoku nosného plynu P i Dávkovač (Injektor) F i Dělič (Splitter) Fi = Fc + Fspl F spl F i -průtok injektorem F spl -průtok děličem F c -průtok kolonou F d -průtok detektorem F mg -průtok pomocného plynu P i - tlak na vstupu - tlak na výstupu P 0 F c Kolona Množství vzorku na koloně, m c Fc F mc = ma = ma F + F F c spl i m a - dávkované množství analytu c Fd = Fc + Fmg F mg Detektor P 0 F d
Kompresibilitní faktor, j j = 3 2 p p p p i o i o 2 3 1 1 p i p o tlak na vstupu do kolny tlak na výstupu z kolony průměrná lineární rychlost mobilní fáze u = Bo Δp η ε L u = B = j o u o ( pi p η ε L o ) B o specifická permeabilita kolony [m 2 ] Δp tlakový spád [Pa] η dynamická viskozita [Pa s] ε vnitřní porozita sorbentu L délka kolony [m]
mrtvý retenční objem retenční objem redukovaný retenční objem Retenční objemy v GC V V M = t R, i = tr,i Fm M V čistý retenční objem je redukovaný retenční objem korigovaný na stlačitelnost nosného plynu V N = t R,i F m specifický retenční objem je čistý retenční objem vztažený na 1 g nebo 1 m 2 stacionární fáze a vztažený na 0 C (tj. 273,15 K) F m R, i = tr,i Fm = VR,i VM j = V R, i j V g = 273,15 V w T L c N V S = 273,15 V S T c N
K D,A (a = (a ( c A(g) + S AS A A A ) ) ) AS AS g = (ca ) = (c ) K D,A R T Henryho adsorpční izoterma ( c A ) AS A AS g p = konst p ( γ ( γ A A Adsorpce A A ) ) g Langmuirova adsorpční izoterma AS (c ) (c 10 8 6 A AS 4 2 c A ) AS = ( A ) max K 1+ K D,A D,A p A p (c ) = 10 mmol/m A max K = 1 D,A 0 0 2 4 6 8 10 p A 2 A
Raoultův zákon p p B γ B = B = p p o B o B x γ B B Henryho zákon Rozpouštění (absorpce) x = γ B ( x B ) B pokud x B << 1, pak γ B je konstantní a platí p B = H B x B p B parciální tlak složky B nad směsí kapalin p o B tlak (tenze) nasycených par složky B x B molární zlomek složky B v kapalné směsi parciální tlak γ > 1 Henryho zákon Raoultův zákon Henryho zákon, γ < 1 molární zlomek
Vliv teploty na separaci teplota nástřikové hlavy, T inj teplota termostatu kolony, T c teplota detektoru, T d T c > T var, T inj T c, T d > T c Vyšší teplota kolony vede k rychlejší analýze. Vyšší teplota kolony vyžaduje vyšší tlak nosného plynu na vstupu do kolony pro zachování jeho lineární rychlosti kolonou. izotermická analýza, T c = konst. analýza s teplotním gradientem, T c,1 T c,2
Derivatizace analytu vede ke snížení jeho bodu varu (T var ) kyselina benzoová (249 C), anilin (184 C), benzanilid (117 C) derivatizace aminokyselin aminokyselina + isopropylalkohol isopropylester + trifluoracetanhydrid trifluoracetamid
Nosný plyn N 2, H 2, He, Ar tlaková láhev s nosným plynem opatřená regulátorem tlaku či regulátorem průtoku bublinkový průtokoměr
Zdroj nosného plynu 3 3 2 1 1 Tlakové láhve Redukční ventily vstupní tlak: 5-220 atm výstupní tlak: 0,5-15 atm Rozvod plynů
Nosný plyn Mobilní fáze v GC - nosný plyn (účastní se přenosu látek kolonou) Kritéria volby nosného plynu typ detektoru inertnost čistota (min. 99,99% až 99,9999%) hustota viskozita Plyn bezpečnost Používané plyny dusík helium vodík argon Hustota Viskozita Tepená vodivost g.cm -3 μpa.s J.m -1.s -1.K -1 Vodík 0,0899 8,44 175,0 Helium 0,178 18,6 143,6 Dusík 1,250 16,58 23,86 Argon 1,784 21,2 16,75
Dávkování vzorků Úkoly reprodukovatelně a rychle převést kapalný či tuhý vzorek do plynné fáze beze změny jeho relativního složení zavedení malého definovaného objemu plynné fáze vzorku do kolony Podmínky nesmí se měnit tlakové a teplotní podmínky v systému dle teorie je pro dosažení maximální účinnosti je nutno dávkovat objem vzorku odpovídající objemu jednoho HETP Dávkovaná množství vzorku náplňové kolony: až 100 µg v 1-10 µl rozpouštědla kapilární kolony: max. 1 µg
Dávkování vzorku se provádí do nástřikové hlavy opatřené septem, která je vyhřívána na zvolenou teplotu a proplachována nosným plynem plynné vzorky injekční stříkačky o objemu 10 až 1000 μl kapalné vzorky injekční stříkačky o objemu 1 až 100 μl tuhé vzorky roztok ve vhodném rozpouštědle split/splitless dávkovač nosný plyn odpad kolona
Separační kolony Seaparační kolona srdce celého GC systému místo průběhu separace parametry separace účinnost selektivita doba analýzy volba kolony druh SF rozměry Špatná volba kolony zaručeně zkazí analýzu!
Kolony a) náplňové kolony: skleněné nebo z nerezové oceli o průměru 1 až 6 mm a délce 0,5 až 5 m s adsorbentem (GSC) nebo se stacionární fází na inertním nosiči (GLC) b) kapilární kolony: dříve skleněné nebo z nerezové oceli, dnes výhradně křemenné s polyimidem o průměru 0,1 až 0,5 mm o délce 10 až 100 m WCOT wall coated open tubular SCOT support coated open tubular PLOT porous layer open tubular s chemicky vázanou stacionární fází WCOT SCOT PLOT stacionární fáze nosič a stacionární fáze sorbent
Adsorbenty v GC aktivní uhlí, grafitizované uhlí dělení plynů a lehkých uhlovodíků silikagel dělení anorganických plynů a nízkovroucích kapalin molekulová síta (krystalické hlinitokřemičitany) 5A dělení plynů a lehčích uhlovodíků 4A jako sušidla porézní polymery (vinylbenzenové kopolymery) komerčně tzv. Porapaky dělení nízkomolekulárních uhlovodíků, anorganických plynů, alkoholů, esterů a ketonů
Kapalné stacionární fáze v GC Carbowaxy (polyethylenglykoly) Ucony (polypropylenglykoly) polární stacionární fáze, s rostoucí M r klesá polarita Polyestery (např. polyethylenglykoladipáty, polypropylenglykoladipáty, polyethylenglykolsukcináty) polární stacionární fáze Silikonové stacionární fáze (polysiloxany) (např. methylpolysiloxan SE-30, fenylmethylpolysiloxan OV-17, fenylpolysiloxan SE-54, kyanopropylpolysiloxan SP-2340) často používané, široký rozsah polarity
Detektory Úkoly detegovat v nosném plynu složky opouštějící kolonu Požadavky rychlá odezva velká citlivost stabilita základní linie velký lineární dynamický rozsah nulová odezva na MF zanedbatelný šum
Detektory - charakteristika Charakteristika měřícího zařízení LOD, LOQ Šum Citlivost Linearita Selektivita RMR Koeficient linearity Lineární dynamický rozsah Chyba linearity
Detektory Signál analytu 0 LOD LOQ Analyt není detegován S/N < 3 Analyt je detegován nelze ho stanovit 3 < S/N <10 Analyt lze stanovit S/N > 10 0 S bc S bc + 3σ S bc + 10σ Signál měřícího zařízení
Tepelně vodivostní detektor, TCD univerzální, nedestruktivní, středně citlivý odporové vlákno
Plamenový ionizační detektor, FID selektivní, destruktivní, velmi citlivý zapalování + elektrody vzduch vodík eluát
Detektor elektronového záchytu, ECD selektivní, nedestruktivní, středně citlivý + anoda Ni 63 28 zářč i katoda eluát
Hmotnostní spektrometr, MS vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý Detektory pro GC TCD: všechny látky lišící se tepelnou vodivostí od nosného plynu FID: uhlovodíky ECD: halogenderiváty (pesticidy) a nitroderiváty MS: téměř všechny organické látky
Charakterizace detektorů základní linie, šum a drift, pík odezva detektoru (signál detektoru), R diferenciální veličina (výška píku) citlivost detektoru, S plocha pod eluční křivkou, A integrální veličina (plocha píku) t A = 1R 2 dt = t R = S c S Mh m F m R = S t dm dt A = 2 dt = S m 1R t časová konstanta, τ (3τ 95 %) R t = R (1 e t/ τ ) lineární dynamický rozsah A = b c detekční limit, LOD 3σ limit stanovení, LOQ 10σ
Analytická informace z chromatogramu RESULTS Peak RT(min) Height Area W50% 1 5.723 1.957 8.872 0.023 2 12.561 5.457 96.121 0.048 3 15.887 2.827 73.266 0.073 4 22.975 0.773 6.001 0.102 kvalitativní informace : poloha píku retenční čas retenční faktor - druh látky (metoda standardů nebo MS detekce) kvantitativní informace : plocha píku množství, koncentrace látky a) metoda vnitřní normalizace b) metoda absolutní kalibrace (kalibrační přímky) c) metoda vnitřního standardu d) metoda standardního přídavku
GC plynů ze vzduchu signál detektoru, mv 0.8 0.6 0.4 0.2 O 2 N 2 CH 4 CO 0.0 0 2 4 6 8 10 retenční čas, min kolona: náplňová, z nerezové oceli 6' x 1/8'' (183 cm x 3,2 mm) stacionární fáze: molekulové síto 5A nosný plyn: 30 ml/min He dávkování: 100 μl (35 C) teplota termostatu kolony: 35 C detekce: TCD (140 C)
GC isopropylesteru fenylalaninu (N-TFA) signál detektoru, mv 80 60 40 20 0 1 2 0 2 4 6 8 10 12 retenční čas, min kolona: křemenná kapilární, 25 m x 0,250 mm stacionární fáze: PERMABOND L-CHIRASIL-VAL nosný plyn: 1,2 ml/min H 2 (0,6 bar) dávkování: 0,5 μl (1% roztok v CH 2 Cl 2 ) splitter (dělič): 1:50 teplota termostatu kolony: 150 C detekce: FID (260 C) 1. D-fenylalanin 2. L-fenylalanin
signál detektoru, mv GC polychlorovaných bifenylů (PCB) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 retenční čas, min 1 23 4 5 6 7 9 8 11 10 14 15 16 kolona: FS-SE-54-DF-0,35; 50 m x 0,25 mm ID stacionární fáze: SE-54 (fenylpolysiloxan) nosný plyn: N 2 (1,2 bar) dávkování: 1 μl (200-800 pg/μl v CH 2 Cl 2 ) splitter (dělič): 1:70 teplota kolony: 80 C 280 C, 8 C/min detekce: ECD (260 C) 1. 2-chlorbifenyl, 2. 4-chlorbifenyl, 3. 2,2'-dichlorbifenyl, 4. 2,4-dichlorbifenyl, 5. 4,4'-dichlorbifenyl, 6. 3,5,3'-trichlorbifenyl, 7. 2,4,4'-trichlorbifenyl, 8. 2,5,2',5'-tetrachlorbifenyl, 9. 2,4,6,4'-tetrachlorbifenyl, 10. 3,4,4'-trichlorbifenyl, 11. 2,3,4,6,2'-pentachlorbifenyl, 12. 2,3,4,4'-tetrachlorbifenyl, 13. 2,3,4,5,2'-pentachlorbifenyl, 14. 2,4,5,2',4',5'-hexachlorbifenyl, 15. 2,3,4,2',4',5'- hexachlorbifenyl, 16. 2,3,4,5,2',3'- hexachlorbifenyl 12 13
Superkritická fluidní chromatografie, SFC tlak, bar 120 100 80 60 40 20 0 mobilní fáze je superkritická tekutina CO 2 : kritická teplota, T c = 35 C kritický tlak, P c = 75 bar (7,5 MPa) fázový diagram oxidu uhličitého P c tuhá látka kapalina kritický bod -80-60 -40-20 0 20 40 60 teplota, o C T superkritická tekutina plyn c oxid uhličitý 40 C: 72 bar 0,22 g/ml 400 bar 0,96 g/ml 80 C: 72 bar 0,14 g/ml 400 bar 0,82 g/ml Hustota a rozpouštěcí schopnost superkritické tekutiny se blíží hustotě a rozpouštěcí schopnosti kapalin. Viskozita superkritické tekutiny se blíží viskozitě plynů. Superkritická fluidní chromatografie