Teoretický úvod: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Praktikum fyziologie rostlin 1
Teoretický úvod: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Forward a reverse genetika, T-DNA inzerční mutanti Zajisté jste už slyšeli pojmy forward - přímá a reverze - zpětná genetika. Tyto pojmy odrážejí pracovní strategie, kterými se dopracujeme k poznatku, resp. teorii. Forward genetika zahrnuje strategie mnohem starší. Při jejím uplatňování nás zajímá konkrétní děj (resp. fenotyp) a cílem je odhalení genů, které jsou pro tento děj důležité. Vycházíme z velkého počtu semen s náhodně vnesenými mutacemi, ze kterých vybereme semena s mutacemi pro nás zajímavými 1. Tato fáze se nazývá forward screen. Pokud by nás například zajímala skotomorfogeneze (vývoj rostliny v tmě), vysejeme statisíce semen a budeme je pěstovat ve tmě. Za zajímavé budeme považovat ty, které rostou stejně, jako kdyby byly na světle. V další, komplikované fázi budeme hledat, ve kterém genu je naše zajímavá mutace (dělá se to třeba křížením s již popsanými mutacemi a počítáním genetické vazby). Pak osekvenujeme (přečteme sekvenci celého úseku pomocí sekvenační PCR a sekvenátoru) místo, ve kterém by se mutace měla nacházet. Pro kontrolu pak zjištěný gen naklonujeme (bez mutace) a natransformujeme do mutantní rostliny, která ztratí fenotypový projev této mutace. Takto byly třeba popsané mutanty COP a DET (od COnstitutive Photomorphogenesis a DE-eTiolated). Reverzní genetika je celá opravdu naruby. Již nehledáme geny odpovědné za fenotyp, ale obráceně ptáme se, jakých dějů se účastní produkt našeho genu (tj. genu, který nám z nejrůznějších důvodů nedá spát)? Pro tento přístup se užívá tzv. T-DNA inzerčních mutantů. T-DNA je tzv. transferová DNA, vnášená Agrobakteriem víceméně náhodně do genomu hostitelské rostliny. Po jejím začlenění do genomu T-DNA rozruší původní sekvenci. T-DNA je pečlivě navržená a často obsahuje další geny, třeba geny kódující rezistenci k herbicidu. Lokalizovat T-DNA inzerci v genomu není tak obtížné jako při bodových mutacích, a to pomocí sekvenace z oligonukleotidu nasedajícího přímo na T-DNA. Dnes existují laboratoře specializující se na masivní produkci popsaných T-DNA inzerčních linií Arabidopsis, a proto není problém najít a objednat si i několik T-DNA inzerčních linií v genu, 1 asi vám zcela správně vrtá hlavou, jak to, že mutace je najednou v obou chromozomálních sadách. Trik spočívá v použití haploidních rostlin odvozených z pylu, které zaručí, že v další generaci bude mutace v obou chromozomálních sadách. 2
který nás zajímá 2. Práce se tak hodně urychluje původní otázku jakých dějů se účastní náš gen, tedy začneme řešit tak, že si prostě mutanta objednáme a zkoumáme fenotypový projev mutace. Fenotypový projev se ovšem projeví pouze u rostlin, nesoucích mutaci v obou chromozomálních sadách. Proto je zapotřebí metody, kterou rychle a nenáročně zjistíme přítomnost T-DNA inzerce v každé chromozomální sadě. Obecně se tento postup nazývá genotypování. Anthokyanové vakuolární inkluze (AVIs) Na těchto praktikách budeme genotypovat mutanta s poruchou v glykosylaci anthokyanů, proto si v zkratce anthokyany představme. Anthokyany jsou přírodní barviva, která jsou produktem fenylpropanoidní dráhy sekundárního metabolismu rostlin a řadíme je mezi flavonoidy. Existuje řada druhů anthokyanů různých barev od sytě červené až po modrou.. Obrázek 1 - příklady anthokyanů a jejich zbarvení (Falcone Ferreyra, Rius, and Casati 2012) Syntéza anthokyanů probíhá v cytoplasmě na povrchu endoplasmatického retikula, následně jsou ale transportovány do vakuoly, kde se hromadí. U Arabidopsis thaliana převládají 3,5-Odiglukosidy cyanidinu. Struktura3,5-O-diglukosidů cyanidinu. R1-R3 označuje místa dalších modifikací (obvykle kys. malonová, sinapová, kumarová a xylóza (Shi and Xie 2014)) 2 souhrn dat z různých databází najdete na http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress. Zkuste si třeba najít gen s kódem At5g64850 (zadejte do políčka query a zmáčkněte search). Kolik T-DNA inzercí vidíte? 3
Mechanismy transportu anthokyanů do vakuoly nejsou dosud plně prostudované. Známe zatím 2 druhy přenosu anthokyanů přes membránu - anthomate TT12, který je flavonoid/h+ antiportér (Marinova et al. 2007) a TT19, který ko-transportuje antokyany s glutathionem za účasti ABC přenašečů (Sun et al. 2012). Kromě těchto přenašečů existuje nejspíše i další dráha přenosu anthokyanů, a to membránovými váčky. Tato teorie vychází z toho, že uvnitř vakuoly se často nacházejí tzv. anthokyanové vakuolární inkluze (AVI) a z toho, že po indukci lze anthokyany pozorovat v řadě menších váčků. Navíc, pokud specificky inhibujeme transmembránové přenašeče anthokyanů, množství AVI vzroste. Toto pozorování naznačuje, že v buňce paralelně běží transport váčky i přenašeči, které se vzájemně kompenzují (Poustka et al. 2007). Naopak poruchy v autofagickém váčkovém transportu mají za následek snížení počtu AVI (Pourcel et al. 2010). Zajímavým pozorováním je, že porušení funkce cyanidin 5-O-glykosyltransferázy (5-GT) vede k dramatickému nárůstu počtu AVI. V takovéto rostlině se pak nacházejí pouze 3-glukosidy anthokyanů. Dosud se neví, proč přesně k tomuto fenoménu dochází. Jedno z pravděpodobných vysvětlení je, že přenašeče nemají afinitu k takto pozměněným molekulám anthokyanů a ty jsou následně transportovány pouze váčky, což způsobuje akumulaci AVI ve vakuole (Pourcel et al. 2010). Model váčkového transportu zahrnujícího mikroautofagii (Kulich and Žárský 2014) Anthokyany volně ve vakuole v divokém typu Arabidopsis (Col) a v 5-GT mutantovi (5gt) (Pourcel et al. 2010). 4
Zadání praktických úloh k tématu: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Přehled úloh k vypracování: Úkol 1: Porovnejte genotyp a fenotyp kontrolních a mutantních rostlin Arabidopsis thaliana 1a) Ověřte přítomnost normální nebo mutantní alely genu 5-GT rostlin Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR 5
Praktické úlohy: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Úkol č. 1: Porovnejte genotyp a fenotyp kontrolních a mutantních rostlin Arabidopsis thaliana Cíl: Seznámit se s technikou genotypování rostlinného materiálu, odlišit přítomnost mutantní alely v homozygotní příp. heterozygotní linii a následně ověřit, zda stanovený genotyp odpovídá fenotypu Hypotéza, kterou v průběhu práce ověříme: Vedle možnosti odlišit transgenní rostliny na základě fenotypového projevu lze prokázat přítomnost vnesené alely pomocí metody genotypování. Dílčí úlohy: 1a) Ověřte přítomnost normální nebo mutantní alely genu 5-GT u rostlin Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR Princip: Náš mutant nese T-DNA inzerci v kódující oblasti genu 5-GT, o které(m) jste se dozvěděli víc v předchozí kapitole. Pro zjištění genotypu experimentálních rostlin budeme používat detekční PCR 3. Celkově budeme dělat pro každý vzorek 2 reakce a použijeme 3 primery (Obr.4). V první reakci použijeme 2 z těchto primerů zelená (levý primer - LP) a modrá šipka (pravý primer - RP) na obrázku, nasedají (jsou plně komplementární) na místa v genomu, mezi kterými očekáváme mutaci. Bez inzerce jsou tato místa od sebe vzdálená cca 1000 bazí. V případě, že T-DNA inzerce na místě není, reakce vyprodukuje PCR produkt o této velikosti (A). Přítomnost T-DNA inzerce způsobí, že tyto primery se od sebe vzdálí až na cca 8000 bazí (z grafických důvodů je nakreslena kratší). Tento PCR produkt je tak velký, že Taq DNA polymeráza ho nestihne dokončit v 1 cyklu. Proto tato reakce zůstane bez produktu (B). 3 princip metody PCR zde nebudeme vysvětlovat do podrobností, jelikož jde o obecné znalosti studenta biologie. Pro toto praktikum nám bude stačit zjednodušení, že pomocí PCR lze pomnožit (do takového množství, které lze snadno detekovat) libovolný úsek DNA, který je definovaný alespoň dvěma oligonukleotidy (cca 20-30 bazí). Tyto oligonukleotidy se nazývají primery. 6
V druhé reakci použijeme opět pravý primer, levý však nahradíme jiným. Tento primer (červená šipka, LB) nasedá přímo na T-DNA inzerci. V její nepřítomnosti reakce pochopitelně nebude fungovat (C). Naopak, když je přítomná inzerce, spolu s pravým primerem vyprodukují produkt velký zhruba 500 bazí (D). A B C D 1000bp produkt 500bp produkt T-DNA inzerce Obr. 4. Schéma fungování různých kombinací primerů na templátové DNA bez inzerce (A,C) a s inzercí (B,D). Reakce, které neproběhnou, jsou označeny křížkem. Produkty PCR těchto dvou reakcí budeme vizualizovat pomocí elektroforézní separace v agarózovém gelu. Z různých kombinací produktů pak usoudíme, jaký genotyp má zkoumaná rosltlina. Přítomnost 1000 bp fragmentu znamená přítomnost nemutované (+) alely v alespoň jedné chromozomální sadě. Stejně tak je to s 500bp fragmentem, jehož přítomnost značí výskyt mutantní alely (-). Pokud tedy vidíme produkty oba, víme, že jde o heterozygota (+/-). Pokud vidíme jen 1000bp produkt, jde o rostlinu bez mutace. Přítomnost pouze 500bp produktu znamená, že rostlina má mutaci v obou sadách chromozomů. Zde tedy lze očekávat fenotypový projev mutace. 1000bp 500bp +/+ +/- -/- Obr. 5. Interpretace výskytu PCR produktů na gelu. + : WT alela, - : mutovaná alela 7
Laboratorní postup: Potřeby: 2 rostliny Arabidopsis thaliana (5 týdnů staré) kontrolní a mutantní s pozměněnou sekvencí v genu 5-GT mikrozkumavky pinzeta a nůžky mikropipety extrakční pufr (200mM Tris-HCl ph 7,5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0,5%SDS) homogenizační tyčinky chloroform centrifuga vortex nádobka s ledem izopropanol roztok 2mM TRIS ph 8,5 PCR cycler sada oligonukleotidů (primerů) pro identifikaci kontrolní a mutantní alely 10x pufr pro PCR reakci (dodáván spolu s polymerázou) 10mM dntp Dream Taq polymeráza agaróza 1x roztok TBE (TRIS, kyselina boritá, EDTA) Roztok GelRed Barvička pro nanášení na gel (loading dye) Elektroforéza se zdrojem napětí, hřeben gelový dokumentační systém (GEN-DOC), případně UV komora pro vizualizaci. Provedení úkolu: Izolace DNA 1. Rostliny si označte (číslo skupiny, datum, vzorek). Pro označení použijte párátka. 2. Připravte si potřeby pro extrakci (nůžky pinzetu, kelímek s vodou, mikrozkumavky, mikropipety se špičkami, extrakční pufr, homogenizační tyčinky, chloroform). 3. Víčkem 1,5 ml mikrozkumavky vyřízněte kolečko ze středně velkého listu anebo odeberte z listu odpovídající plochu. Umístěte do též mikrozkumavky. Mezi odběry omyjte nástroje v připravené vodě, abyste snížili riziko křížové kontaminace. 4. Pokuste se materiál co nejpečlivěji rozmělnit pomocí homogenizační tyčinky. Do mikrozkumavky přidejte 400µl extrakčního pufru a 5. K extrakční směsi přidejte 300 µl chloroformu a umístěte na vortex. Třepejte 5 min. 6. Centrifugujte 3 min při plném výkonu. Mezitím si připravte nové zkumavky o shodném značení. 8
7. Zkumavky opatrně vyjměte, aby nedošlo k promísení fází, a umístěte do stojánku. Do nové zkumavky přeneste cca 300 µl horní fáze. Pracujte opatrně, nesmí dojít k promísení se spodní fází, což by narušilo další postup izolace. 8. K extraktu přidejte 300 µl izopropanolu, promíchejte a umístěte do připravené nádoby s ledem, kde bude 10 min probíhat srážení DNA. 9. Centrifugujte 5 min při maximálních otáčkách. Následně odstraňte všechnu tekutinu slitím, ve zkumavce by měl být patrný opaleskující bezbarvý sediment viditelný při pohledu proti světlu. Sediment často není vidět vůbec! (není to důvod k opakování extrakce). Zkumavku otočte dnem vzhůru a umístěte na buničitou vatu. Izolovanou DNA sušte při pokojové teplotě cca 10 min. Pozor! Je třeba, aby nedošlo k přesušení! (vzorek by se pak špatně rozpouštěl) 10. Sediment rozpusťte ve 100 µl 2mM TRIS ph 8,5. DNA se uvolní do roztoku poklepáváním na zkumavku. 11. Před odebíráním DNA templář z jednotlivých zkumavek krátce centrifugujte případné nerozpustné nečistoty. Amplifikace DNA Celou přípravu PCR reakcí provádějte na ledu! DNA polymerázu skladujte ve vymrazovacím bločku! 1. Připravte si označené mikrozkumavky pro PCR reakce (objem 150µl), pro každý vzorek 2 zkumavky. Je nutné uvést označení použitých primerů (viz dále). 2. Z 2 připravených směsí (vody, pufru, deoxynukleozidtrifosfátů dntp, primerů ohraničujících amplifikovanou sekvenci, DreamTaq polymerázy odpipetujte do zkumavek 19 µl. Dbejte na to, aby nedošlo k záměně použité směsi do odpovídajících zkumavek (liší se jen v sekvenci primerů, které ohraničují buď kontrolní, nebo mutantní alelu). Pipetujte přesně, v opačném případě by nemuselo stačit pro kolegy! 3. Do každé zkumavky přidejte 1 µl DNA templátu. Pozor, na každou zkumavku použijte novou špičku, aby se zabránilo případným kontaminacím. 4. Připravené PCR reakce krátce centrifugujte, umístěte zpět na led a vyčkejte, až budou ostatní skupiny hotové. 5. Umístěte společně do PCR cycleru, uzavřete a spusťte nastavený program. 6. Po skončení amplifikace budou vzorky zamraženy a skladovány při -20 C do následujícího praktika. 9
Vizualizace DNA fragmentů pomocí gelové elektroforézy, porovnání s fenotypem 1. Do zkumavek s PCR reakcemi přidejte 4 µl nanášecí barvičky (loading dye). 2. Na připravený elektroforetický gel (1 % agaróza rozpuštěná v 1x TBE pufru s přidaným interkalačním barvivem GelRed (1:10000)) s otvory pro nanášení vzorků naneste v obou řadách úplně vlevo standard molekulových hmotností (směs fragmentů DNA o známé velikosti, která slouží jako měřítko testovaných fragmentů). Do každého otvoru naneste 10 µl směsi tak, že do horní řady umístíte z každé skupiny 2 vzorky s primery pro identifikaci kontrolní alely a do spodní řady 2 vzorky s primery pro identifikaci mutatní alely. Pracujte rychle, aby se minimalizoval vliv difúze vzorků v gelu! 3. Elektroforézu zakryjte víčkem a připojte ke zdroji napětí. Pozor, je nutno pamatovat na to, že vzorek se pohybuje od katody k anodě!! Nastavte napětí 90 V a spusťte. 4. Po cca ½ - ¾ h reakci zastavte, vyjměte gel, přeneste do komory gelového dokumentačního systému a zhotovte fotografii. Porovnejte získaná data z PCR amplifikací DNA a fenotypu vašich rostlin. Tento fenotypový projev je velmi lehké odhalit pomocí světelné mikroskopie. Po určení genotypu pomocí mikroskopu zkontrolujte, jestli váš výsledek genotypování koresponduje s fenotypovým projevem. Otázky: Co by ste stalo, kdyby v důsledku málo pečlivé práce došlo ke kontaminaci DNA polymerázy vaším vzorkem DNA? Jaké by byly důsledky pro váš tým? K jakému pólu se pohybuje DNA v elektroforéze a proč? Kolik kopií DNA fragmentu teoreticky vznikne při reakci, která má 30 cyklů a v templátu se nachází 100 molekul templátu? Literatura Falcone Ferreyra, María L., Sebastián P. Rius, and Paula Casati. 2012. Frontiers in Plant Science 3 (September): 222. Kulich, Ivan, and Viktor Žárský. 2014. International Journal of Molecular Sciences 15 (5): 7462 74. Marinova, Krasimira, Lucille Pourcel, Barbara Weder, Michael Schwarz, Denis Barron, Jean-Marc Routaboul, Isabelle Debeaujon, and Markus Klein. 2007. The Plant Cell 19 (6): 2023 38. Pourcel, Lucille, Niloufer G. Irani, Yuhua Lu, Ken Riedl, Steve Schwartz, and Erich Grotewold. 2010. Molecular Plant 3 (1): 78 90. Poustka, Frantisek, Niloufer G. Irani, Antje Feller, Yuhua Lu, Lucille Pourcel, Kenneth Frame, and Erich Grotewold. 2007. Plant Physiology 145 (4): 1323 35. Shi, Ming-Zhu, and De-Yu Xie. 2014. Recent Patents on Biotechnology 8 (1): 47 60. Sun, Yi, Hong Li, and Ji-Rong Huang. 2012. Molecular Plant 5 (2): 387 400. 10