1. ANALÝZA POTRAVIN Kontaminanty 1 1.1. Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) 2 CO JSOU PAU? Organické sloučeniny, které obsahují dvě nebo více benzenových jader spojených do konjugovaných systémů Příklady vzorců PAU Naphthalen Benzo[a]pyren Koronen! Všudypřítomné kontaminanty, které vznikají v průběhu nedokonalého spalování organické hmoty 3 1
CO JSOU PAU?! Významné zdroje PAU: doprava výroba tepelné a elektrické energie spalování fosilních paliv zpracování ropy spalování odpadů domácí topeniště požáry lesů, stepí, kouření! Riziko pro člověka - potenciální karcinogeny (referenční sloučenina benzo[a]pyren) příjem - vzduch, voda, potraviny 4 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ VLASTNOSTI PAU PAU Sumární vzorec Počet arom. jader M (g/mol) Bod tání ( C) Bod varu ( C) Rozpustnost ve vodě (mg/l) Log K OW Henryho konstanta (Pa.m 3 /mol) Naph C 8 H 1 2 128,2 8 218 3 3,37 43,1 Ace C 12 H 1 3 154,2 96 279 3,47 3,92 12,17 Acy C 12 H 8 3 152,2 92 265-275 3,93 4,7 8,4 Fln C 13 H 1 3 166,2 116 293 1,98 4,18 7,87 Phe C 14 H 1 3 178,2 11 34 1,29 4,46 3,24 Ant C 14 H 1 3 178,2 216 34,7 4,45 3,96 Flt C 16 H 1 4 22,3 111 375,26 5,33 1,4 Pyr C 16 H 1 4 22,3 149 36,14 5,32,92 B[a]A C 18 H 12 4 228,3 158 435,14 5,61,581 Chr C 18 H 12 4 228,3 255 448,1 5,61,65 B[a]P C 2 H 12 5 252,3 179 496,38 6,4,46 B[b]F C 2 H 12 5 252,3 167 481,12 6,57 - B[k]F C 2 H 12 5 252,3 217 481,55 6,84,16 DB[ah]A C 22 H 14 5 178,4 262 524,5 5,97 - B[ghi]P C 22 H 12 6 276,3 277 -,26 7,23,75 I[cd]P C 22 H 12 6 276,3 163 -,62 7,66-5 OBECNÉ SCHÉMA METODY STANOVENÍ PAU Homogenizace, sušení Extrakce sonikace, Soxhlet, saponifikace ASE, MAE, Rozetření vzorku s bezvodým Na 2 SO 4 Hexan, aceton, dichlormethan, chloroform Zakoncentrování extraktu rotační vakuová odparka Přečištění Gelová permeační chromatografie, SPE Stacionární fáze gel Bio-Beads S-X3, mobilní fáze- chloroform Zakoncentrování extraktu rotační vakuová odparka Identifikace/kvantifikace HPLC/FLD GC/MS HPLC reverzní fáze, C 18 polymerní kolony, gradientová eluce GC nepolární kolony (typ DB-5MS) 6 2
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (FLD154-4\DATA5\MJ581\24-251.D) LU -235-24 -245-25 -255-26 -265 18 2 22 24 26 28 min Rizika nepřesných výsledků Fotodegradace ochrana vzorků, extraktů a standardů před světlem použití tmavých vialek, hliníkové folie Sekundární kontaminace nutné provádět slepý pokus v každé sérii vzorků použití čistých rozpouštědel a materiálů redestilace rozpouštědel, předextrakce extrakčních patron, speciální postup mytí laboratorního skla 7 UKÁZKA CHROMATOGRAMU STANDARDU PAU - HPLC HPLC/FLD Reverzní polymerní fáze (25 mm x 4 mm, 5μm) Gradientová eluce (acetonitril/voda) LU 3 25 FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\DATAHP~1\FLD154-4\DATA2\MJKOLONY\MNIST2.D) PMP1, Solvent A 1.192 - Ace 21.91 - B[k]F 2 15 1 5 % ACN 7.647 - Naph 1.454 - Fln 11.54 - Phe 12.69 - Ant 13.858 - Flt 14.893 - Pyr 17.762 - B[a]A 18.527 - Chr 2.826 - B]b]F 23.12 - B[a]P 24.474 - DB[ah]A 25.95 - B[ghi]P 26.725 - I[cd]P 5 1 15 2 25 min 8 HPLC/FLD - UKÁZKA CHROMATOGRAMU UZENÉHO SÝRA FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (D:\HPCHEM\FLD154-4\DATA5\MJ581\24-251.D) LU 35 Phe Ant B[a]A 3 Naph Chr 25 Fln 2 B[k]F B[a]P 15 1 B[b]F DB[ah]A B[ghi]P I[1,2,3-cd]P 5 Ace Flt Pyr BaA Chr BbF BkF BaP DBahA BghiP IcdP -5 5 1 15 2 25 min 9 3
UKÁZKA CHROMATOGRAMU STANDARDU PAU - GC GC/MS Kolona DB-5MS Abundance Ion 228. (22 27.7 to 228.7): NSTD D.D 55 Ion 178. (23 33.7 to 234.7): NSTD D.D 5 Ion 192. 77.7 to 278.7): NSTD D.D 7 Ion 22. 15+16 41.7 to 242.7): NSTD 45 22+23 Ion 216. 51.7 to 252.7): NSTD 4 3 6 8 Ion 1 11184. 14 75.7 17+18 to 276.7): 24 NSTD 29 28 27 35 9 13 25 19 2 21 3 5 12 12 26 25 4 3 2 31 15 32 33 1 5 4. 6. 8. 8 1.12. 14.1 16.18.2.22.2 24.26. Time--> 1 2-MeNaph, 2 1-MeNaph, 3 Acy, 4 Ace, 5 Fln, 6 DBT, 7 Phe, 8 Ant, 9 1-MePhe, 1 Flt, 11 Pyr,12 B[c]Fln, 13 1-MePyr, 14 B[b]N[d]T, 15 CP[c,d]P, 16 B[a]A, 17 Tri, 18 Chr, 19 3-MeChr, 2 5-MeChr, 21 1-MeChr, 22 B[b]F, 23 B[j]F, 24 B[k]F, 25 B[e]P, 26 B[a]P, 27 I[1,2,3-c,d]P, 28 DB[a,h]A, 29 B[g,h,i]P, 3 DB[a,l]P, 1 31 DB[a,e]P, 32 DB[a,i]P, 33 DB[a,h]P GC/MS - UKÁZKA CHROMATOGRAMU OLIVOVÉHO OLEJE Abundance 6 55 6 Ion I 184. (183.7 7 to 184.7): NESPOLE2.D Ion I 192. (191.7 7 to 242.7): NESPOLE2.D Ion I 22. (21.7 7 to 252.7): NESPOLE2.D Ion I 216. (215.7 7 to 32.7): NESPOLE2.D Ion I 234. (233.7 7 to 276.7): NESPOLE2.D Ion I 228. (227.7 17+18 7 to 278.7): NESPOLE2.D 5 45 4 11 35 3 25 2 15 1 5 4 12 3 5 1 7 8 9 15+16 12 13 14 19 22+23 2 21 25 26 24 29 27 28 3 31 32 33 4. 6. 8. 1.12.14. 16.18.2.22.24.26.2 Time--> 1 2-MeNaph, 2 1-MeNaph, 3 Acy, 4 Ace, 5 Fln, 6 DBT, 7 Phe, 8 Ant, 9 1-MePhe, 1 Flt, 11 Pyr,12 B[c]Fln, 13 1-MePyr, 14 B[b]N[d]T, 15 CP[c,d]P, 16 B[a]A, 17 Tri, 18 Chr, 19 3-MeChr, 2 5-MeChr, 21 1-MeChr, 22 B[b]F, 23 B[j]F, 24 B[k]F, 25 B[e]P, 26 B[a]P, 27 I[1,2,3-c,d]P, 28 DB[a,h]A, 29 B[g,h,i]P, 3 DB[a,l]P, 31 DB[a,e]P, 32 DB[a,i]P, 33 DB[a,h]P 11 1.2. Polychlorované bifenyly (PCB) a organochlorované pesticidy (OCP) 12 4
Úvod Perzistentní organické polutanty (POPs) Polychlorované bifenyly (PCB), organochlorové pesticidy (OCP) Polychlorované dibenzo-dioxiny (PCDD) a dibenzo-furany (PCDF) Vstup do životního prostředí a potažmo do potravních řetězců prostředí Primární zdroje - přímá aplikace v praxi Sekundární zdroje - likvidace odpadů, požáry, vedlejší produkty při průmyslových operacích, havárie Vlastnosti perzistentních látek nízký stupeň (bio) degradace vysoká perzistence Vysoká lipofilita kumulace v biotických materiálech životního prostředí/potravních řetězců 13 Přehled PCB 29 kongenerů meta ortho ortho meta 3 2 2 3 para 1 1 4 4 para Cl x 5 6 6 5 Cl y meta ortho ortho meta x + y = n = 1 až 1 Kruh 1 2 1 4 non-ortho PCBs 3 2 6 11 4 3 8 13 15 mono-ortho PCBs 23 5 16 2 22 4 24 7 17 25 28 42 47 indikátorové PCBs 25 9 18 26 31 44 49 52 26 1 19 27 32 46 51 53 54 34 12 33 35 37 56 66 7 71 77 35 14 34 36 39 58 68 72 73 79 8 234 21 41 55 6 82 85 87 89 15 18 128 235 23 43 57 63 83 9 92 94 17 111 13 133 236 24 45 59 64 84 91 95 96 11 113 132 135 136 245 29 48 67 74 97 99 11 12 118 12 138 146 149 153 246 3 5 69 75 98 1 13 14 119 121 14 148 15 154 155 345 38 76 78 81 122 123 124 125 126 127 157 162 164 167 168 169 2345 61 86 16 114 129 137 141 143 156 159 17 172 174 18 182 189 194 2346 62 88 19 115 131 139 144 146 158 161 171 175 176 183 184 191 196 197 2356 65 93 112 117 134 147 151 152 163 165 177 178 179 187 188 193 21 2 22 14 23456 116 142 16 166 173 181 185 186 19 192 195 198 199 23 24 25 26 27 28 29 2 3 4 23 24 25 26 34 35 234 235 236 245 246 345 2345 2346 2356 23456 Kruh 2 Indikátorové kongenery PCB Nejčastěji se v technických směsích PCB používaji tzv. indikátorové kongenery Maximální přípustné hodnoty sumy indikátorových kongenerů PCB v potravinách jsou uvedeny ve Vyhlášce č. 35/24 Sb. k Zákonu č. 11/1997 o potravinách, limity se týkají potravin s vyšším obsahem 15 lipidů, tj. ryb a rybích produktů 5
Průnik POPs do potravního řetězce 16 Kumulace v živých organismech Biokoncentrace přímý přestup látek z okolního prostředí do organismu Biomagnifikace příjem látek konzumací kontaminované potraviny a jejím trávením Bioakumulace = Biokoncentrace + Biomagnifikace Faktory ovlivňující bioakumulaci Lipofilita Velikost a tvar molekul Biologická dostupnost Biochemická degradabilita Charakter organismu Environmentální faktory 17 Popis analytické metody 1) Příprava vzorku Homognizace vzorku s bezvodým síranem sodným (desikace) 2) Extrakce Extrakce podle Sohleta (nejčastěji), sonikace, PLE 3) Přečištění extraktu (odstranění lipidů) Gelová permeační chromatografie (GPC) Adsorpční chromatografie (silikagel, florisil ) 4) Identifikace & kvantifikace Plynová chromatografie s detektorem elektronového záchytu (GC/ECD) mńebo s hmotnostním detektorem (GC/MS) 18 6
counts 26 24 22 2 18 ECD1 A, (GC2ECD\JP774\DEL13B.D) 15 2 25 3 35 4 min Eluční profil PCB a rybího tuku na GPC stac. fáze: Bio Beads S-X3 mob. fáze: cyklohexan-ethylacetát Tuk PCB 28 PCB 52 PCB 11 PCB 118 PCB 138 PCB 153 PCB 18 5 4 3 % 2 1 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-1 1-11 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-2 2-21 21-22 22-23 23-24 24-25 25-26 26-27 tuk frakce (ml) analyty 19 Ukázka chromatogramu reálného vzorku mateřského mléka (GC/2ECD) counts 3 25 ECD1 A, (GC2ECD\JP754\M182.D) p,p -DDE Vzorek mateřského mléka PCB 66/95 PCB 11/84 PCB 11 PCB 151 PCB 118 PCB 153 PCB 146 PCB 15 PCB 141 PCB 138 PCB 187 PCB 183 PCB 156 PCB 18 Technická směs PCB - Delor 16 PCB17 PCB 23 2 PCB 153 PCB 18 15 HCB PCB 138 1 5 beta-hch PCB 112 PCB 118 p,p -DDT 1 15 2 25 3 35 4 45 2 min Výřez chromatografických záznamů zgc/ecd pro směsný standard PCB a reálný vzorek rybí svaloviny Směsný standard PCB Vzorek rybí svaloviny (cejn velký, Labe Valy) 21 7
Chromatografický záznam standardu OCP (1 pg v nástřiku), kapilární kolony DB-5 a DB-17 (6 m x.25 mm x.25 µm i.d.) 22 Chromatografický záznam vzorku ryby (Cejn velký, Labe Hřensko) - detail 23 GC/MS-EI spektrum PCB 1 PCB 153 145 Cl Cl 36 Cl Cl 29 19 Cl Cl 5 127 218 74 181 98 61 84 163 325 35 5 78 254 169 193 24 228 24 275 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 (mainlib) 1,1'-Biphenyl, 2,2',4,4',5,5'-hexachloro- 24 8
1.3. PESTICIDY 25 PESTICIDY Všechny sloučeniny nebo jejich směsi určené pro prevenci, ničení, potlačení, odpuzení či kontrolu škodlivých činitelů, to znamená nežádoucích mikroorganismů, rostlin, a živočichů během produkce, skladování, transportu, distribuce, a zpracování potravin, zemědělských komodit a krmiv (definice FAO, Food and Agriculture Organization) široké spektrum fyzikálně chemických vlastností akutní/chronická dietární expozice zdravotní riziko pro konzumenty nutná kontrola výskytu reziduí a jejich koncentračních hladin rostoucí množství registrovaných látek pro ošetření zemědělských plodin LEGISLATIVA: Vyhláška Ministerstva Zdravotnictví č. 158/24 Sb., změněná vyhláškou 68/25 Sb. (MRL jednotlivých pesticidů v potravinách a potravinových doplňcích) Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 54/24 Sb., (O potravinách určených pro zvláštní výživu a o způsobu jejich použití). Legislativní limit pro počáteční a pokračovací kojeneckou výživu a obilné a ostatní kojenecké příkrmy: MRL =,1 mg/kg ZVLÁŠŤ NÍZKÉ MRL Commission Directive 23/13/EC of February 1, 23 amending Directive 96/5/EC on processed cereal-based baby foods and baby foods for infants 26 and young children) DĚLENÍ PESTICIDŮ (i) PODLE CÍLOVÉHO ŠKODITELE Skupina pesticidů insekticidy akaricidy fungicidy moluskocidy rodenticidy herbicidy regulátory růstu rostlin Cílový škodlivý činitel hmyz pavoukovití plísně, cizopasné houby měkkýši hlodavci plevelné rostliny kulturní rostliny (ii) PODLE MECHANISMU ÚČINKU systémové - penetrují kutikulou listů a jsou v rostlině dále translokovány kvasisystémové - mají omezenější mobilitu než pesticidy kontaktní, do kutikuly penetrují jen v omezeném rozsahu kontaktní - vykazující lokální účinek v místech, kde se nachází jejich povrchový deposit 27 9
STRATEGIE MULTIREZIDUÁLNÍCH METOD Počet analytů /typy matrice MRM Cena/dostupnost Pracovní charakteristiky metody pro daný pesticid/danou skupinu látek l umožňují stanovení sloučenin širokého spektra fyzikáln lně-chemických vlastnosti princip: (i) homogenizace, (ii( ii) ) extrakce organickým rozpouštědlem, (iii( iii) ) přečištěníp primárn rního extraktu, (iv( iv) ) identifikace/kvantifikace a (v) konfirmace (potvrzení) ) cílových c analytů metodami kapalinové a plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí (LC-MS, GC-MS) 28 MULTIREZIDUÁLNÍ METODY: PRACOVNÍ CHARAKTERISTIKY PŘESNOST: opakovatelnost reprodukovatelnost správnost (zpravidla výtěžnost) CITLIVOST: směrnice kalibrační přímky MEZ DETEKCE a MEZ STANOVITELNOSTI: LOD jaké množství analytu lze ještě spolehlivě prokázat LOQ jaké množství analytu lze s definovanou přesností ještě stanovit LCL nejnižší bod kalibrační křivky PRACOVNÍ ROZSAH a LINEARITA: v jakém koncentračním rozsahu lze měřit/kalibrovat v jakém rozsahu je kalibrační závislost lineární 29 MULTIREZIDUÁLNÍ METODY: OVĚŘENÍ PRACOVNÍCH CHARAKTERISTIK MRM Certifikované referenční materiály Řešení Neexistují pro všechny matrice Drahé Omezená stabilita moderních pesticidů Mezilaboratorní porovnání (Proficiency Testing, FAPAS ) KALIBRACE Matriční efekty ovlivnění signálu analytu koextrakty z matrice GC/MS nadhodnocení výsledků při použití standardů v čistém rozpouštědle (matrix induced response enhacement) Použití matričních standardů pro kalibrace! LC/MS časté podhodnocení výsledků při použití standardů v čisté rozpouštědle (ion suppression) 3 1
PŘÍKLADY ANALYTICKÝCH MRM POSTUPŮ: STANOVENÍ (SEMI)VOLATILNÍCH PESTICIDŮ navážka vzorku, desikant, ethylacetát Ultra Turrax HP GPC (PL gel, mobilní fáze: ethylacetát-cyklohexan, 1:1, v/v) X EXTRAKCE PŘEČIŠTĚNÍ STANOVENÍ POLÁRNÍCH PESTICIDŮ navážka vzorku, acetonitril Ultra Turrax 1. GC NPD, ECD screening 2. GC MS/SIM (kvadrupól, EI) konfirmace pozitivních vzorků Nástřik: pulsní splitless, 1μl Nosný plyn: helium GC kolona: nepolární DB-5MS (6mx,25mmx,25µm) IDENTIFIKACE/ KVANTIFIKACE KONFIRMACE LC-MS/MS Nástřik: 7μl Mobilní fáze:,1m octan amonný:methanol LC kolona: RP-C18 (15 mm x 3 mm x 5 µm) ASPEC, Gilson, Francie GC/MS (EI/CI) systém Agilent 5975N 31 Waters Micromass Quattro Premier XE PŘEČIŠTĚNÍ I. ODSTRANĚNÍ INTERFERUJÍCÍCH MATRIČNÍCH KOMPONENT Z EXTRAKTU BÝVÁ PROVEDENO NA ZÁKLADĚ ROZDÍLNÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ ANALYTŮ A KOEXTRAKTŮ. (1) EXTRAKCE KAPALINA-KAPALINA (LLE) Požadavky: i) nemísitelnost použitých kapalin ii) analyty přecházejí nebo zůstávají pouze v jedné kapalině Výběr rozpouštědel: polarita, rozpustnost analytů Výhody: dobrá efektivitu a jednoduchost Nevýhody: spotřeba velkých objemů rozpouštědel ( nutnost zakoncentrování pro další postup) vysoké nároky na čistotu rozpouštědel možnost tvorby emulzí sekundární kontaminace vzorku metoda používající mikrolitrové objemy: LPME (Liquid-phase micro extraction) (2) GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE (GPC) Princip: dělení látek na základě efektivního objemu molekuly menší molekuly pronikají hlouběji do póru gelu a mají proto větší retenční objem, než velké molekuly Další vlivy při separaci: tvorba vodíkových můstků, dipólové interakce, π-π interakce, disperzní síly VÝBĚR VHODNÉHO GELU: pracovní rozsah (tzv. vylučovací limit) udává, jak velké molekuly již nejsou v gelu zadržovány Analýza pesticidů: styren-divinylové gely s malým vylučovacím limitem (např. rigidní PL- gel, měkký Bio Beads) Výhoda GPC: snadná automatizace 32 PŘEČIŠTĚNÍ II. (3) EXTRAKCE NA TUHOU FÁZI (SOLID-PHASE EXTRACTION, SPE) Princip: vzájemné interakcích sorbentu, analytů a rozpouštědla. Nejběžnější uspořádání SPE: kolonky obsahující,1 1 g sorbentu Po nanesení vzorku může nastat několik situací: analyty i interferující látky jsou sorbentem zadrženy, k eluci analytů nebo interferentů je potřeba změnit eluční sílu rozpouštědla jsou zadrženy pouze analyty, interferující látky projdou kolonkou a analyty jsou eluovány rozpouštědlem s vyšší eluční silou jsou zadrženy pouze interferenty a analyty kolonkou projdou DISPERZNÍ SPE: malé množství sorbentu přidáno přímo do extraktu, po filtraci nebo centrifugaci se k analýze odebere alikvotní objem přečištěného extraktu (QuEChERS) Výhody: Sorbent přichází do styku s extraktem celým povrchem čištění efektivnější a účinnější Nižší cena (menší množství sorbentu,nejsou potřeba komerční kolonky) Není potřeba zdroj vakua a eluční rozpouštědla jako u klasického SPE Celý proces velmi rychlý a jednoduchý Typy sorbentů používaných v SPE v multireziduální analýze pesticidů Normální fáze Reverzní fáze Iontoměniče Grafitizované saze (GCB) Oktadecilovaný silikagel (C18) Silné anexy (SAX) Alumina Polymery (divinylbenzen, DVB) Primární-sekundární amin (PSA) Silikagel Cyanopropyl (-CN) Aminopropyl (-NH2) Florisil Silné katexy 33 11
5 Hz 4 3 2 1 pa 14 12 1 8 6 4 2 STD 2 24_3_26-ESI+_67 Sm (Mn, 2x3) 1 % ECD1 A, (JANA_T~1\ZKOUSKA\STD1.D) 14 15 16+17 19 21 23 24+25 26+27 3 32 37+38 33+34 35 2 3 4 5 6 7 NPD2 B, (JANA_T~1\ZKOUSKA\STD1.D) 1 3 4 2 5 6 7 8 9 14 17 18 2 22 23 24 27 26 28+29 31 32 33+34 35 36 37+38 4 39 4 43+44 53 5+52 47+48 42 49 54 2 3 4 5 6 7 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 24_3_26-ESI+_67 Sm (Mn, 2x3) 2: MRM of 32 Channels ES+ 7,59 1 215,1 > 79,1 1,1e3 % 3,3 2,85 3,43 Time 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 92/6 24_3_26-ESI+_53 Sm (Mn, 2x3) 1 % % 2,24 2,69 4,27 3,81 4,4 4,47 4,78 5,14 5,46 6,3 6,45 6,2 7,6 8,32 7,87 8,62 8,45 8,7 1,6 1,99 11,36 12,19 11,51 11,6 11,24 2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 16,15 2,28e3 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 24_3_26-ESI+_53 Sm (Mn, 2x3) 2: MRM of 32 Channels ES+ 1 12,51 215,1 > 79,1 548 8,53 2,42 2,67 2,98 2,89 3,2 4,35 6,3 3,62 3,94 5,1 6,36 6,77 7,9 4,7 4,35 4,63 5,94 5,74 5,21 6,47 6,67 7,28 7,14 7,44 7,62 7,86 8,47 Time 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 8,28 8,93 9,14 9,66 9,94 9,38 1,46 8,82 1,19 8,69 9,219,45 8,96 1,78 1,5 11,19 11,96 12,47 12,65 2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 16,15 438 11,66 11,88 9,72 1,94 9,9 11,5 1,31 1,72 1,9 1,51 11,24 12,3 12,6 12,62 41 43 42 45 46 5+51 55 55 57+58 56 87/6 24_3_26-ESI+_48 Sm (Mn, 2x3) 1 % 59+6 61 62 63+64 65 66 67 68 69 67 7 7 71 72 73 72 74 75 76 77 77 78 78 79 8 81 81 8 82 83+84 87+88+89+9 8,57 9,65 1,26 11,1 12,49 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 24_3_26-ESI+_48 Sm (Mn, 2x3) 2: MRM of 32 Channels ES+ 7,55 1 215,1 > 79,1 1,96e3 % 3,73 3,32 4,9 5,48 6,45 6,67 6,81 7,58 Time 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 11, 12, 13, 8,4 9,2 8,76 9,56 9,7 9,19 85+86 1,49 1,4 91 1,5 11,1 11,22 95 min min 2: MRM of 32 Channels ES+ 215,1 > 16,15 5,99e3 11,66 11,84 12,38 12,69 12,86 UKÁZKA GC-MS CHROMATOGRAMŮ SMĚSI STANDARDŮ (KONCENTRAČNÍ HLADINA.8 3 µg/ml) ECD 12 13 92 93+94 NPD 1 11 57+58 63 Abundance 9 85 8 75 7 65 6 55 5 45 4 35 3 25 2 15 MSD TIC/Scan TIC: std1deva.d\data.ms Time--> 1 5 15. 2. 25. 3. 35. 4. 45. 5. 55. 6. 65. 7. 34 PRAKTICKÉ PŘÍKLADY- identifikace pozitivních vzorků UKÁZKA GC-MS CHROMATOGRAMŮ PHOSALONE (m/z 121, 182, 367) Ion 121. (12.7 to 121.7): STD3C.D Ion 182. (181.7 to 182.7): STD3C.D 55.7 Ion 367. (366.7 to 367.7): STD3C.D 26 24 22 2 18 16 14 12 1 Abundance 5 45 4 35 3 25 2 15 7 1 Scan 3462 (58.418 min): mstd3smsc.d\data.ms 182 Cl O O S N P(OCH 27 2CH 3) 2 CH 2 S 121 281 367 97 154 138 8 6 55.3 55.4 55.5 55.6 55.7 55.8 55.9 56. 56.1 56.2 56.3 56.4 56.5 56.6 56.7 Obr. 1: Chromatogram standardu phosalonu m/z--> 5 221 249 267 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 Obr. 2: Hmotnostní spektrum phosalonu 341 Ion 121. (12.7 to 121.7): ML22.D 55.93 Ion 182. (181.7 to 182.7): ML22.D 17 55.65 Ion 121. (12.7 to 121.7): ML222.D Ion 182. (181.7 to 182.7): ML222.D Ion 367. (366.7 to 367.7): ML222.D 13 125 Ion 367. (366.7 to 367.7): ML22.D 16 12 15 115 14 11 13 12 11 15 1 95 9 1 85 9 8 8 75 7 7 6 55.4 55.5 55.6 55.7 55.8 55.9 56. 56.1 56.2 56.3 Obr. 3: Chromatogram vzorku - pozitivní nález Ti > 65 55.4 55.6 55.8 56. 56.2 56.4 56.6 56.8 35 Obr. 4: Chromatogram vzorku bez nálezu PRAKTICKÉ PŘÍKLADY- identifikace pozitivních vzorků II. UKÁZKA LC-MS-MS CHROMATOGRAMŮ Matriční standard Kvantifikační MS-MS přechod Konfirmační MS-MS přechod DMST Negativní nález Pozitivní nález Chybí konfirmace 36 12
1.4. MYKOTOXINY 37 MYKOTOXINY toxické sekundární metabolity mikroskopických vláknitých hub hlavní producenti Aspergillus, Penicillium, Fusarium výskyt - celosvětově rozšířené, napadají široké spektrum potravin a zemědělských plodin ke kontaminaci dochází v průběhu vegetace, skladování průnik do živočišných produktů mykotoxikosy onemocnění zvířat i lidí (karcinogenní látky, potenciálně karcinogeny, toxické látky) faktory ovlivňující výskyt - vlastnosti mikromycet, typ substrátu, aplikované technologie pěstování, počasí, podmínky skladování, způsob zpracování surovin bioterorismus 38 legislativa KLASIFIKACE MYKOTOXINŮ pestrá skupina nízkomolekulárních sloučenin nelze jednoduše rozdělit podle chemické struktury nutnost zohlednit producenty, výskyt, toxické účinky aj. dle nejnovějších vědeckých studií a dlouhodobého výzkumu lze konstatovat, že mezi nejvýznamnější mykotoxiny patří 7 níže uvedených Producent Aspergillus Fusarium Penicillium Mykotoxin aflatoxiny, ochratoxin A, patulin deoxynivalenol (DON),HT-2 a T-2 toxin, zearalenon, fumonisiny ochratoxin A 39 13
STANOVENÍ MYKOTOXINŮ VZORKOVÁNÍ EXTRAKCE KRITICKÝ KROK NEHOMOGENNÍ MATERIÁL OHNISKA KONTAMINACE PŘEČIŠTĚNÍ IDENTIFIKACE A KVANTIFIKACE Které analytické metody jsou používány???? 4 STANOVENÍ MYKOTOXINŮ INSTRUMENTÁLNÍ METODY OFICIÁLNÍ KONTROLA POTRAVIN HPLC-UV HPLC-FLD HPLC-MS-MS GC-FID GC-ECD GC-MS RYCHLÉ METODY SCREENING TLC ELISA LFD Biosensory IR-spektroskopie TRENDY V ANALÝZE MYKOTOXINŮ Rychlejší metody, ale spolehlivé. Jednoduchší metody, ale spolehlivé. Levnější metody (práce, chemikálie ) Vyšší stupeň automatizace Multireziduální metody (více analytů součastně) 41 RYCHLÉ METODY SCREENING ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )- Imunochemické stanovení LFD (Lateral Flow Device)- Imunochromatografická metoda Použití testovánípřímo v terénu, screeningová analýza, v rozvojových zemích Výhody rychlá, levná, nenáročná 42 14
Kompetitivní ELISA test ELISA soupravy obsahují destičku mikrotitračních jamek s navázanou protilátkou, sestavu pěti nebo šesti standardních roztoků o známých koncentracích. Analyzovaný mykotoxin obsažený v testovaném vzorku a konjugovaném antigenu soutěží o vazebná místa protilátky, na antigenu je navázaný enzym, který štěpí chromogen za vzniku barevné reakce. Čím víc mykotoxinu vzorek obsahuje, tím více vazebných míst je obsazeno. Naváže se méně konjugovaného antigenu a výsledná barevná reakce je slabší. Intenzita zbarvení je měřena při odpovídajících vlnových délkách. Výsledné koncentrace analytů jsou vypočteny na základě srovnání s absorbancí standardních roztoků. Příprava vzorků - vzorek se extrahuje destilovanou vodou nebo 7% roztokem metanol-voda v závislosti na analyzovaném mykotoxinu. Je nutné, aby všechny testované extrakty měly ph v deklarovaném rozmezí. Tato podmínka je obvykle bez problémů splněna u extraktů vzorků, pro které jsou ELISA soupravy výrobcem doporučeny. 43 INSTRUMENTÁLNÍ METODY MULTIREZIDUÁLNÍ LC- MS METODA 16 mykotoxinů Postup - 25 g vzorku s 1 ml ACN:H2O třepačka 2 hod, filtrace, naředění 4 x vodou, LC-MS systém Zdroj: M. Spanjer et. al.: Single run LC-MS/MS analysis of mycotoxins subject to actual and 44 upcoming EU legislation in one sample extract, 2 nd World Mycotoxin Forum, 23, Noordwijk, NL Aflatoxiny AFB1 Producenti: Aspergillus flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř 1 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G), A. argeninicus a A. nomius 4 přirozené typy aflatoxinů: AFB1, AFB2, AFG1 a AFG2 jejich metabolity: AFM1, AFM2, AFM4, AFP1, AFQ1 Výskyt: obiloviny, mléko, sýry, vejce, maso, koření, oříšky Toxikologické účinky: akutně toxické, kancerogenní, mutagenní a teratogenní pořadí toxicity a mutagenity je AFB1>AFG1> AFB2>AFG2 Analytický postup Extrakce- methanol, chloroform, voda nebo jejich směsi Přečištění- SPE (imunoafinitní kolonky IAC, MycoSep kolonky, C18 kolonky) Identifikace a kvantifikace - HPLC/FLD (normální či reverzní fáze, před nebo pokolonová derivatizace) HPLC/MS 45 15
Aflatoxiny IAC Příprava a extrakce vzorku - rozetření a navážení doporučeného množství vzorku,smíchání vzorku s roztokem NaCl a vodným methanolem, filtrace Ředění a filtrace - nařeďění potřebného množství extraktu, filtrace Absorbce a eluce - dávku filtrátu nechat protéct přes imunoafinitní kolonku Afla B promýt kolonku vodou, eluování aflatoxinů z kolonky methanolem a jímání eluátu do kyvetky Měření - derivatizace aflatoxinů přidáním vývojky do kyvetky,umístění kyvetku do měrné cely kalibrovaného fluorometru, na displeji fluorometru odečtění výsledků (B1 a B2) v ppb, nebo nástříknutí eluátu do kapalinového chromatografu 46 Ochratoxin A Sytematický název: (R)-N-[(5-chloro-3.4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl 1-oxo-1H-2-benzo-pyran-7- yl)karbonyl]-l-fenylalanin Producenti: P. verrucosum, A. ochraceus a některé další druhy Aspergillus Výskyt: cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich, v kávových bobech, v mase a vnitřních orgánech hospodářských zvířat Toxikologické účinky: nefrotoxicita, hepatotoxicita, genotoxicita, imunotoxicita a karcinogenita 47 Ochratoxin A 48 16
LU 75 7 65 6 55 FLD1 A, Ex=249, Em=464 (C:\ZALOHA~1\D\1\DATA\OA5\51179.D) 5 2 4 6 8 1 12 14 DAD1 A, Sig=276,4 Ref=36,1 (C:\ZALOHA~1\D\1\DATA\PATULIN\591367.D) mau.8.6.4.2 -.2 2 4 6 8 1 12 14 min min Ochratoxin A Stanovení: Extrakce: 6 % ACN SPE přečištění: Imunoafinitní kolonky OchraTest TM VICAM; OCHRAPREP R R-BIOPHARM RHONE Analytická koncovka: HPLC-FLD (ex. 249 nm; em. 464 nm) Kolona: LichroSpher C18 Mobilní fáze: ACN:H 2 O:k. octová (99:99:2) Parametry metody: LOD:,5 μg/kg Výtěžnost: 77, % Opakovatelnost: 4,5 % Psenicna mouka spike.5 mg/kg Ochratoxin A Chromatogram: Pšeničná mouka spike,5 mg/kg 49 Patulin Sytematický název: 4-hydroxy-4H-furo[3,2-c]pyran-2(6H)-on Producenti: Penicillium, Aspergillus, and Byssochylamys hlavně P. patulinum a P. expansum Výskyt: Jablka, hrušky, hroznové víno, drobné ovoce a výrobky z nich Toxikologické účinky: Karcinogenita, mutagenita, neurotoxicita a imunotoxicita Legislativa: EC 1425/23 (25 g/kg pro jablka, 5 g/kg pro mošty a 1 g/kg pro dětskou výživu). 5 Patulin Stanovení: Extrakce: 84 % ACN SPE přečištění: MycoSep 228 Analytická koncovka: HPLC-DAD (276 nm) Kolona: Hypurity AquaStar C18 Mobilní fáze: ACN :,5% k. octová (4:96) Parametry metody: LOD: 5 mg/kg Výtěžnost: 57,6 % Opakovatelnost: 5,6 % Jablko spike,4 mg/kg Patulin Chromatogram: Jablko spike,4 mg/kg 51 17
Fusariové mykotoxiny Deoxynivalenol (3a,7a,15-Trihydroxy-12,13-epoxytrichothec-9-en-8-one) Výskyt - nejfrekventovanější - cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich Toxicita - dermatitidy, gastrointestinální onemocnění, hematologické onemocnění, imunotoxicita Legislativa - Vyhláška 35/24 Sb.; obiloviny pro přímou spotřebu a zpracované obilí, kromě tvrdé pšenice,5 mg/kg, chléb a jemné pečivo,35 mg/kg, Výrobky z obilovin určené pro dětskou výživu,1 mg/kg T-2 toxin (3-Hydroxy-4,15-diacetoxy-8-[3-methyl-butyryloxy]-12,13-epoxytrichothec-9- ene) Výskyt - cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich Toxicita - dermatitidy, emetické účinky, imunotoxicita, karcinogenita? Zearalenon (μ-lakton 6-(1-hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl)-β-resorcyklové kyseliny) Výskyt - cereálie (ječmen, pšenice, oves, kukuřice, rýže) a výrobky z nich Toxicita estrogenní účinky Legislativa - Vyhláška 35/24 Sb.; dětská výživa a kojenecká výživa z obilovin,2 mg/kg, obiloviny a výrobky z obilovin,5 mg/kg 52 Fusariové mykotoxiny Stanovení: Parametry metody: Extrakce: ACN:H2O (84:16,v:v) LOD:,5 μg/kg SPE přečištění: MycoSep kolonky 226 Analytická koncovka: LC-MS/MS (iontová past) Kolona:Synergi Hydro RP (15mm x 3mm x 4µm) Mobilní fáze: gradient methanol, vodný roztok octanu amonného Mycosep kolonky 53 18