Základy molekulární patologie nádorových onemocnění. Molekulárně biologické metody používané v molekulární patologii.

Základy molekulární patologie nádorových onemocnění. Molekulárně biologické metody používané v molekulární patologii. Ivana Tichá RNDr. Ivana Tichá, Ph.D. (ivana.ticha@vfn.cz), Laboratoř molekulární patologie Ústav patologie, 1.LF UK a VFN v Praze

Patologie Mikroskopická vs. Molekulární Mikroskopická patologie histologické preparáty IHC proteiny FISH/CISH chromozomální aberace Molekulární patologie Molekulárně biologické analýzy Nukleové kyseliny analýza genových aberací Kompletní data důležitá pro určení diagnózy a určení typu léčby pacienta

Molekulární patologie Studuje molekulární mechanismy vývoje a progrese nádorových (i nenádorových) onemocnění využívá metod molekulární biologie odpověď na léčbu (prediktivní faktory) diferenciální diagnostika a klasifikace nádorů určení prognózy monitorování odpovědi pacienta na léčbu zjištění relapsu nádorového onemocnění detekce molekulárních aberací odpovědných za nástup onemocnění diagnostika infekčních onemocnění

Molekulární patologie relativně nové a stále rostoucí specializační odvětví patologie Personalizovaná medicína (protilátky/malé molekuly cílené proti specifickým molekulám či epitopům) používá metody molekulární biologie/ molecular genetics Vyšetřuje prediktivní markery => účinnost léčby Diferenciální diagnostika prognóza hledání nových klinicky významných a využitelných markerů vs. Klinická onkologie vyšetřuje prognostické markery => genetické poradenství

Prognostické a prediktivní markery Prognostický marker může být definován jako znak/vlastnost, který umožní rozdělení populací s ohledem na výsledek sledovaného jevu (onemocnění) v případě, že pacient nedostane léčbu (odhad chování onemocnění či jeho závažnosti) Prediktivní marker může být definován jako znak/vlastnost, který umožní rozdělení populací s ohledem na výsledek sledovaného jevu (onemocnění) v případě, že pacient léčbu dostane (odhad odpovědi na konkrétní léčbu)

Prognostické a prediktivní markery Prediktivní markery nasazení či naopak nenasazení specifické terapie (zda pacient bude mít z léčby prospěch či nikoli) Rozhodování o léčbě řídí se výsledkem validované metody laboratoře řada rozdílných komerčně dostupných testů pro analýzu stejného prediktoru (Mezinárodní nebo národní kontrola kvality!!) sledované vlastnosti genové alterace, klinickopatologická data histologický typ, stage TNM klasifikace, grade, věk, ki-67 jsou obvykle buď prognostickým nebo prediktivním faktorem. Některé faktory jsou jak prediktivní tak prognostický faktor pro dané onemocnění (např. EGFR, triple negativní karconom prsu).

Modrá kniha (www.linkos.cz)

Modrá kniha (www.linkos.cz) Karcinom prsu ER, PR, Her2 (ERBB2), Ki-67, cyklin, D1,TOP2A NSCLC EGFR, ALK, ROS1 Kolorektální karcinom RAS (KRAS, NRAS) BRAF Maligní melanom BRAF GIST c-kit, PDGFRα Karcinom žaludku Her2 (ERBB2)

Základ..pro studium genetických aberací Dogma molekulární biologie DNA RNA Protein Fenotyp může být vysvětlen genotypem

Metody molekulární biologie..pro studium genetických aberací Izolace nukleových kyselin kvalitativní a kvantitativní analýza DNA/RNA (elektroforetické techniky agarosa, PAGE; měření koncentrace Vlastní analýza vyžaduje citlivé techniky pro hledání variant v DNA (3x10 9 bp změna 1 bp nelze detekovat! Nezbytné amplifikovat oblast zájmu) Techniky založené na PCR qpcr, sekvenování, PCR následovaná reverzní hybridizací FISH (fluorescent in situ hybridization) NGS (masivně paralelní sekvenování)

Metody molekulární biologie..citlivost..typy mutací..komplikace Různé techniky pro různé potřeby!! Citlivost metod cytogenetické (FISH) - 10-2 Molekulární (qpcr - realtime PCR) - 10-2 -10-6 Typy alterací: gen -bodové mutace, krátké del/ins a komplexní přestavby, dlouhé přestavby; epigenetické změny chromosomové aberace translokace, amplifikace heterogenita vzorku tkáně ale také buněk samotného nádoru

Nádorová heterogenita..klonální evoluce Větvený model růstu nádoru (branched model) heterogenita v rámci primárního nádoru i mezi primárem a metastázou odsouvá lineární model evoluce nádoru po sobě následující mutace ve stěžejních genech vedou k expanzi klonálně homogenních nádorových buněk Nowell PC et al. Science 1976; scheme taken from Caldas C et al. Nature 2012 )

Nádorová heterogenita..klonální evoluce..lineární model Kumulace genetických změn => maligní transformace Selekční tlak + karcinogeny (chemické, fyzikální, biologické..) Dědičná predispozice Interakce genotyp - prostředí

Nádorová heterogenita Přináší vysvětlení, proč výsledek genetického vyšetření ze 2 různých míst nádoru stejného jedince se může lišit Potřeba nových strategií pro validaci biomarkerů a překonání sekundární rezistence na léčbu -kombinovaná terapie -monitorování léčby na molekulární úrovni

Získané genetické změny..v nádorech Malé (submikroskopické) Bodové mutace Malé delece/inzerce Aktivující (proto-onkogeny; RAS, EGFR) x Inaktivující (tumorsupresory; p53,rb) Velké (mikroskopické) Nenáhodné změny karyotypu (balancované translokace, genové amplifikace, delece)

Translokace, amplifikace..cytogenetické metody Synoviální sarkom - balancovaná translokace t(x;18)(p11.2;q11.2) Ewingův sarkom - Translokace t(11;22) - 85%; t(21;22) or t(7;22) NSCLC (non-smal- cell lung carcinoma) - ALK (2p23) přestavba nebo translokace (fúzní protein EML4/ALK)... a vyšetření EGFR mutací v exonech 18-21 Karcinom žaludku - ERBB2 amplifikace - translokace/přestavba zasahující gen ALK

Translokace, amplifikace..fish

Translokace.. ALK..zlomová próba ALK Dual Color Break Apart Probe reciprocal translocation t(2;10)(p23;p11.22)

Translokace.. ALK..zlomová próba..alk Dual Color Break Apart Probe reciprocal translocation t(2;10)(p23;p11.22)

Amplifikace.. ErbB2 (Her2/neu)..centromerická a lokus specifická próba

Genetické testování u sporadických nádorů Terapeutické cíle personalizovaná medicína

Terapeutické cíle personalizovaná medicína Genetické aberace v signálních drahách vedou k transformaci buněk, vývoji nebo progresi nádorového onemocnění. Klinické cíle: snadno dostupné molekuly metastazující kolorektální karcinom Ras (Braf) anti-egfr (TKI) NSLC EGFR, ALK anti-egfr, anti ALK (TKI)

Signální kaskády.. mitotická stimulace

Signální kaskády.. Tyrosin kinasová dráha..inhibitory tyrosin kináz (TKI) Mutace každého jednotlivého člena dráhy ovlivní léčbu specifickou látkou (léčivo)

Signální kaskády.. Tyrosin kinasová dráha..inhibitory tyrosin kináz (TKI) Strukturní a funkční homology transmembránových proteinů receptory růstových faktorů = Her2

Signální kaskády.. Tyrosin kinasová dráha..inhibitory tyrosin kináz (TKI) Mutace každého jednotlivého člena dráhy ovlivní léčbu specifickou látkou (léčivo)

Signální kaskády.. Tyrosin kinasová dráha..somatické mutace proto-ongogenů Ras GTP = active form Ras GDP = inactive

Signální kaskády.. Tyrosin kinasová dráha..somatické mutace proto-ongogenů Bodové mutace vedou k aktivaci proto-onkogenů Kras a Nras - mutace vede ke snížení GTPázové aktivity. V nádoru nebyla prokázána mutace genu NRAS v kodonech 12, 13, 59, 60, 61, 146. Nádor je RAS wild type ve smyslu aktuálně platných indikačních kritérií anti-egfr cílené léčby. kodon 12 kodon 12

Defekty v tyrosin kinasové dráze..somatické mutace aktivují proto-ongogen => onkogen Aktivující mutace v genech RAS jsou silně spojeny s rezistencí na terapii anti-egfr inhibitory vyšetření exonů 2,3,4 genu KRAS a exonů 2,3,4 genu NRAS je nezbytné, aby mohla být zahájena anti-egfr terapie u pacientů s diagnózou metastatický karcinom kolorekta. Mutace genu EGFR u NSCLC jsou spojeny s citlivostí na léčbu (!!ALE resistentní mutace T790M!! od R2016 existuje léčba) Metody: sekvenování, qpcr, PCR následovaná hybridizací na specifické próby na stripu, HRM.

HRM High resolution melting..testování RAS

Rutinní diagnostika LMP analýza prediktivních (příp. diagnostických faktorů) Nádorová tkáň Vyšetřovaný marker Analýza plíce - NSCLC ALK EGFR, Kras ROS1, RET, MET FISH PCR FISH karcinom prsu ERBB2 (Her2) FISH karcinom žaludku ERBB2 (Her2) FISH karcinom kolorekta Kras, Nras, Braf PCR maligní melanom Braf (V600) PCR štítná žláza Kras, Braf PCR počet analyzovaných případů/ provedených analýz Analýza 2015 FISH ~450 případů/testů PCR ~470 případů/~570 testů

Rutinní diagnostika LMP Akreditovaná laboratoř dle ISO 15189 (ČIA a/nebo NASKL) Certifikovaná laboratoř účast na pravidelných EHK pro jednotlivé validované metody/faktory) Analýza prediktivních markerů personalizovaná medicína (odeslání výsledku 2-10 dní poté co se vzorek dostane do LMP) Vyšetřovaný materiál Formalínem fixované a do parafinu zalité tkáně (nebo etanolová fixace) Cytologické preparáty (cytoblok, nátěr) Čerstvě zamražená tkáň (zřídka) Fixovaný (barvením) otisk cytologického preparátu (sentinelové uzliny; zřídka)

Rutinní diagnostika Postup Žádanka s uvedením diagnózy a faktoru, který se má vyšetřit (onkolog, jiný specialista; patolog) HE preparáty (příp. cytologický nátěr) - každý vzorek musí být zhodnocen patologem s ohledem na: - vhodnost vzorku pro testování - určení množství / proporce nádorových buněk* -oblasti pro případnou disekci (makrodisekce / mikrodisekce)

Laserová mikrodisekce nabohacení vzorku nádorovými buňkami

Rutinní diagnostika * Každá laboratoř by si měla určit minimální množství / proporci nádorových buněk během validace - optimálně >500 nádorových buněk / 50 % nádoru ( 10 %) Metoda - jakákoliv validovaná metoda schopná detekovat typ mutace vyskytující se s frekvencí (ve všech nádorech) alespoň 1 % Interpretace výsledku Uvolnění výsledku pro účely klinických lékařů

DNA kvalita a kvantita Preanalytická příprava vzorku!! Kvalita DNA!! heterogenní, výrazně odlišná od DNA z krve či čerstvě zamražené tkáně 300 bp

DNA kvalita a kvantita spektrofotometrické vs. fluorometrické měření koncentrace 4-5x nižší při měření na fluorimetru 300 bp

DNA kvalita a kvantita spektrofotometrické vs. fluorometrické měření koncentrace 4-5x nižší při měření na fluorimetru 300 bp 300 bp

Rutinní diagnostika analyzované prediktivní markery EGFR ex18-21 (NSCLC) Jan Nov 2016 invalid 1.67% of all samples (4/239); LCM or limited tumor area 10% WT 90.2% (212/235) activating MUT 9.8% (23/235) RAS ex 2-4 (mcrc) Jan Oct 2016 WT 49.5% (104/210) invalid 2.7% of all samples (6/216) MUT KRAS 46.2% (97/210) MUT NRAS 4.3% (9/210) + BRAF ex 15 (mcrc) Mut - 5/25 (20%)

Rutinní diagnostika analyzované prediktivní markery BRAF ex15 V600 (Maligní Melanom) Leden září 2015 MUT 40% (27/68) MUT 60% (41/68) invalidní 4% ze všech případů přijatých do LMP (3/71)

Rutinní molekulární diagnostika úskalí Invalidní výsledky molekulárního testování jsou vysoce závislé na: preanalyticé fázi (způsob odběru a zacházení se vzorkem) na kompletní doprovodné dokumentaci a dostatečných klinických údajích Na reprezentativním vzorku (dostatečné množství a kvalita) Na dodržení podmínek fixace (typ fixativa a doba fixování; pufrovaný formol crosslinks DNA-DNA, DNA-proteiny) Toto všechno jsou zásadní kroky pro získání kvalitně fixovaného vzorku vhodného pro molekulární analýzu či jiné přezkoumání i za několik let

Next Generation Sequencing moderní metodika pro vyšetřování celého panelu somatických variant z parafinových bločků.. Multigenové testování Panel genů všechny prediktory (prognostické markery) v jednom KRAS NM033360 all exons (6) NRAS NM002524 all exons (7) EGFR NM005228 exons 18,19,20,21 BRAF NM004333 exons 11 a 15 PDGFRA NM006206 exons 12,14,18 KIT NM000222 all exons (21) BRCA1 NM007294 all exons (23) BRCA2 NM000059 all exons (28) PIK3CA NM006218 exons 9,20 PTEN NM000314 all exons (9)... Hledání somatických variant je odlišné od hledání hereditárních variant

Non-ligationable DNA Adaptors Adaptors ligated together DNA + ligated adaptors Upper marker Lower marker FFPE DNA Library preparation for Illumina sequencing (KAPA HYPER PLUS kit with enzymatic fragmentation) Ligation time - 2 hours Agilent 2100 Bioanalyzer; High Sensitivity DNA kit

Next Generation Sequencing Složité: biostatistické vyhodnocení a interpretace výsledků. (varianty neznámého významu)

Analýza Sangerovým sekvenováním 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% WT Het Mut Normal mamary tissue WT-AGCCCTGACTTTAAGGATACATGA Mut-...... G Breast cancer tissue WT-AGCCCTGACTTTAAGGATACATGA Mut-...... G

Vyšetření z plazmy (NSCLC)..tzv. tekutá biopsie (liquid biopsy) Diagnostika primárního nádoru by musí být provedena z tkáně Vyšetření mutací z plazmy (cfdna cell free DNA; ctdna circulating tumor DNA) - by mohlo usnadnit monitorování změn mutací během léčby pacientů s NSCLC - detekce mutací odpovědných za rezistenci k anti-egfr terapii (získaná sekundární rezistence kvůli přítomnosti klonu nesoucí p.t790m). Prediktivní testování by mělo být přednostně prováděno ze solidní tkáně/cytologických preparátů (patolog tak může potvrdit přítomnost a typ nádoru) Nutné mít metodu, která umí detekovat EGFR p.t790m ve vyorku, kter7 obsahuje alespoň 5% nádorových buněk.

Biobanka Biologického Materiálu (BBM) 1.LF a VFN v Praze, Karlova Univerzita, Ústav Patologie (Hlavův ústav, od roku 2012) - sběr a uchování různých biologických vzorků a s nimi souvisejících klinickopatologických dat a následná distribuce pro potřeby vědy a výzkumu tkáně: bioptický materiál z nádorové a nenádorové tkáně, čerstvě zamražená tkáň a/nebo tkáň v RNALater Tělesné tekutiny: krev, plazma, sérum, DNA, moč - sběr a zpracování vzorků probíhá za standardizovaných podmínek cíl: poskytuje vysoce kvalitní vzroky spolu s relevantními klinickými daty pro biomedicínský výzkum zaměřený především na pochopení etiologie onemocnění, podstaty onemocnění a jejich příčin, vedoucí k novým možnostem časné diagnózy a léčby

Biobanka Biologického Materiálu (BBM) Odpovědná osoba a předseda rady: Prof. MUDr. Tomáš Zima, Dr.Sc., MBA Manažer projektu: Mgr. Stanislava Reinštein Merjavá, PhD. Realizační tým: Mgr. Kateřina Jirsová, PhD. Mgr. Věra Franková, PhD. Doc. MUDr. Viktor Kožich, CSc. Zástupce pro oblast IT: RNDr. Čestmír Štuka, MBA Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky (ÚLBLD) 1. LF UK v Praze, Na Bojišti 3, 128 00 Praha 2 Ústav patologie (Hlavův ústav) 1. LF UK v Praze, Studničkova 2, 128 00 Praha 2 Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Apolinářská 18, 128 51 Praha 2 I. Chirurgická klinika 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2 Stomatologická klinika 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2 Urologická klinika 1. LF UK a VFN, Ke Karlovu 6, 128 08 Praha 2 Oční klinika 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2 IV. Interní klinika gastroenterologie a hepatologie 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2 I. Interní klinika hematologie 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2 Radiodiagnostická klinika 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2 Onkologická klinika 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2 Dermatovenerologická klinika 1. LF UK a VFN, U Nemocnice 2, 128 00 Praha 2

BBM (od března 2012) 1x hlubokomrazící box -80 C (SANYO MDF-U700VX) 2x zásobní kontejner tekutý dusík XL-240 3x kryotank skladování vzorků Dewar 24K Kapacita: 48 000 kryozkumavek (-80 C) 72 150 kryozkumavek (-156 C)