Imunologické metody fagocytóza, stanovení oxidačního metabolismu, chemiluminiscence, baktericidní test
Fagocytóza Jeden z evolučně nejstarších obranných mechanismů Součást přirozené imunity Schopnost buněk imunitního systému pohlcovat, usmrcovat a rozkládat mikroorganismy (u živých) Schopnost rozpoznat cizorodou částici, navázat se a pohltit ji Fagocytující buňky - neutrofily, eosinofily, monocyty, makrofágy
Fagocytóza jako mnohastupňový proces Interakce mezi fagocytujícími buňkami a endotelem Adhezní molekuly Chemotaxe s účastí chemoatraktantů Ingesce pohlcování částic, > 0,5um Nitrobuněčné zabíjení Mechanismy zabíjení nezávislé na kyslíku a závislé na kyslíku (NADPh oxidázový komplex)
Vrozené poruchy fagocytózy Imunitní nedostatečnost Primární poruchy geneticky podmíněné nízká incidence 1:100000-1:1000000 Sekundární poruchy Poruchy v počtu granulocytů (retikulární dysgeneze) Poruchy funkce granulocytů LAD syndrom (Leukocyte Adhesion Deficency, mutace genu pro podjednotku beta CD18)
Poruchy fagocytózy Poruchy chemotaxe Poruchy ingesce Poruchy tvorby granulí neutrofilních granulocytů ( Chediak-Higashiho sy, poruchy myeloperoxidázy)
Fagocytóza princip metody (testy postihující pohlcení) Substráty MSHP hydroxyetylmetakrylátové partikule Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans MSHP hydrofilní charakter částic (omezení nespecifické adherence), standardní velikost 1um (nízká spontánní agregace) Inkubace s plnou krví 1 hodinu při 37C, po inkubaci nátěr na podložní sklo, fixace, obarvení a počítání ve světelném mikroskopu Hodnocení určitého počtu buněk, pozitivní obsahují 3 a více partikulí.
Fagocytóza technické podmínky a hodnocení Čerstvá krev s heparinem (zpracování do 2 hodin po odběru) EDTa vyvázání kalciových iontů Třepání, nátěry Omezená výpovědní hodnoty v rutinní klinické praxi Toxikologie, farmakologie Termostat, třepačka, světelný mikroskop, event. průtokový cytometr
Baktericidní test Screeningová metoda Rozdílné mikrobicidní systémy s druhovou specificitou mikroba Substrát živý mikroorganismus!!! Candida albicans, Staph.aureus, pseudomonády Vyšetření z plné krve nebo na izolovaných granulocytech Vitální barvení kandid trypanovou modří, živé kandidy mají schopnost trypanovou modř eliminovat Staphylokok očkování na plotny a počítání kolonií nebo průtoková cytometrie s barvením přežívajících mikroorganismů
Baktericidní test technická úskalí Obtížná standardizace Heparinová krev, teplota zpracování, časový limit pro zpracování Substrát mikrobiologická laboratoř, různá citlivost kmenů, pasážování kmenů Uplatnění v rutinní diagnostice omezené, více ve výzkumu Technické vybavení třepačka, termostat, sterilizátor, mikroskop, průtokový cytometr
Testy oxidačního metabolismu Testujeme schopnost granulocytů tvořit kyslíkové radikály aktivací NADPH oxidázy NBT - nitroblue-tetrazolium chlorid INT iod-nitroblue tetrazolium Schopnost granulocytů redukovat bezbarvé tetrazoliové soli na barevné formazány Kyslíkový metabolismus, zabíjení stafylokoků, enterokoků, kandid Sklíčkový test optický mikroskop, pozitivní buňky jsou s modrými skvrnami ( redukovaný formazán) Mikrotitrační destičky s fotometrickým odečtem Klinické koreláty chronická granulomatozní choroba Zpracování do 2 hodin po odběru
Chemiluminiscence Měření chemiluminiscenční aktivity fagocytů Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí Redukce molekulárního kyslíku na superoxid a následně peroxid vodíku Peroxid vodíku je substrátem pro myeloperoxidázovou reakci s emisí fotonů a chemiluminiscencí fagocytů Pro chemiluminiscenci je stimulem phorbol-myristát-acetát, který aktivuje proteinkinázu C a následně NADPH oxidázu Chemické světlo se zesiluje akceptací fotonů luminolem Spontánní aktivita a aktivita stimulovaných fagocytů Chemiluminiscenční analyzátor Hodnotí se vrchol odpovědi a čas nezbytný k jeho dosažení
Chemiluminiscence technické podmínky, uplatnění testu Čas zpracování, teplota při zpracování 37C, koncentrace granulocytů, diferenciál krevního obrazu Širší uplatnění ve srovnání s NBT testem Poruchy NADPH v oxidázovém a myeloperoxidázovém systému Klinický korelát chronická granulomatóza Farmakologie Chemiluminometr, průtokový cytometr