1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené třemi doménami, poskytuje ligandům mnoho míst, kam se mohou vázat. Nejsilněji vázané ligandy jsou hydrofobní organické anionty střední velikosti (100 až 600 Da) dále dlouhé řetězce mastných kyselin, hematin a bilirubin. Menší a méně hydrofobní látky, jako je tryptofan a kyselina askorbová, jsou vázány méně silně, avšak jejich vazba zůstává vysoce specifická. Bromfenolová modř (BPB) se používá jako acidobazický indikátor a barvivo při provádění gelových elektroforéz. Chemickou povahou je BPB slabá kyselina (pka=3,85). Při acidobazických titracích mění barvu v úzkém rozmezí ph: 3 (žlutá barva) až 4,6 (fialová barva). Po navázání indikátorů na některé proteiny můžeme pozorovat zajímavý jev, zvaný proteinová chyba indikátoru. Tento jev komplikuje situaci, při stanovování hodnoty ph kolorimetricky. Např. roztok neutrální červeně má bez přidání globulinu ph 6,6. Po přidání pětiprocentního globulinu se ale jeho ph jeví jako 6,0. Velikost proteinové chyby závisí jak na použitém indikátoru, tak na druhu proteinu. Při zjišťování vazby ligandu na protein lze postupovat mnohými způsoby. V této úloze budete používat Jobův a Scatchardův výnos. Jobovým výnosem se zjišťuje stechiometrie komplexu při studiu vazby ligandu na protein. Celková molární koncentrace proteinu a ligandu zůstávají po celou dobu experimentu konstantní, mění se pouze molární zlomky složek směsi. Měřitelná veličina, která je úměrná tvorbě komplexu (v našem případě absorbance), je vynesena proti molárnímu zlomku jedné ze složek. Maximum na vzniklé křivky odpovídá stechiometrii vzniklého komplexu. Scatchardovým výnosem se určují vazebná místa proteinu pro ligand s různými afinitami, celkový počet vázaných molekul ligandu jednotlivými vazebnými místy a dá se z něj určit i vazebná konstanta. Pro výnos podle Scatcharda potřebujeme znát množství navázaného ligandu (ozn. jako B), které je funkcí koncentrace volného ligandu (ozn. jako [L]), tj. B = g([l]). Sérový albumin je titrován roztokem BPB a následně jsou takto připravené roztoky proměřovány při dvou vlnových délkách. Z naměřených dat jsou poté vypočteny absorpční koeficienty pro
vázanou a volnou BPB, ze kterých jsou poté vypočítány hodnoty B a [L], které se vynášejí do grafu, B/[L] na osu y a B na osu x. Pomůcky a chemikálie Bromfenolová modř (Mr = 667) Hovězí (Mr = 66 000) nebo lidský (Mr = 67 000) sérový albumin Kyselina citronová a citronan sodný pro přípravu citrátového pufru 0,5 mol l -1 roztok NaOH Destilovaná voda Kádinky pro přípravu zásobních roztoků, odměrné válce, lékovky, automatické pipety, skleněné kyvety Spektrofotometr Specord M40 ph metr inolab 720 Pracovní postup Příprava roztoků sérového albuminu a bromfenolové modři 1, Připravte zásobní roztok BPB. Na analytických vahách přesně navažte přibližně 15 mg barviva, rozpusťte ve 200 µl 0,5 M NaOH a přidejte takový objem destilované vody, aby výsledný roztok BPB měl koncentraci 1 10-3 mol l -1. 2, Připravte zásobní roztoky kyseliny citronové a citronanu sodného o přibližné koncentraci 0,1 mol l -1 v dostatečném množství (případně použijte již připravené roztoky). 3, Ze zásobních roztoků kyseliny citronové a citronanu sodného připravte dostatečné množství citrátového pufru. Postupujte tak, že nejprve do kádinky přidáte požadované množství roztoku kyseliny a soli (poměr kyseliny a soli je pro požadované ph 4:1), následně zkontrolujte ph roztoku a podle potřeby dotitrujte roztokem soli nebo kyseliny na ph 3,3. 4) Připravte roztok sérového albuminu o koncentraci 2 10-5 mol l -1 a objemu 100 ml. Protein rozpouštějte v právě připraveném citrátovém pufru. 2
5) Ze zásobního roztoku BPB odeberte takový objem, abyste získali roztok o výsledné koncentraci 1 10-4 mol l -1 a objemu alespoň 20 ml. Roztok BPB zřeďte citrátovým pufrem. (Roztok změní barvu z temně fialové na rezavou) 6) Z právě připraveného roztoku BPB o koncentraci 1 10-4 mol l -1 připravte 50 ml roztoku BPB o koncentraci 2 10-5 mol l -1. Roztok opět zřeďte citrátovým pufrem. Nyní máte připraveny všechny potřebné roztoky o různých koncentracích. Příprava vzorků pro analýzu vazby BPB na sérový albumin A, Příprava vzorků pro Jobův výnos Připravte si do 12 lékovek, označte si je a následně připravte 12 roztoků podle níže uvedené tabulky. K přípravě těchto roztoků používejte zásobní roztoky sérového albuminu a BPB o koncentraci 2 10-5 mol l -1. Číslo vzorku V přidané BPB [ml] albuminu [ml] 1 5 0 2 4,75 0,25 3 4,5 0,5 4 4,25 0,75 5 4 1 6 3,75 1,25 7 3,5 1,5 8 3 2 9 2,5 2,5 10 2 3 11 1 4 12 0 5 Zapněte spektrofotometr Specord M40 nebo spektrokolorimetr Spekol 11 a proměřte absorbanci vzorků při 606 nm, jako blank použijte citrátový pufr. Absorbanci každé směsi změřte třikrát (Spekol 11), na přístroji Specord M40 nastavte integrační čas jednotlivého měření na 5 vteřin. 3
A, Příprava vzorků pro Scatchardův výnos Připravte si 12 lékovek, označte si je a následně připravte 12 roztoků podle níže uvedené tabulky. K přípravě těchto roztoků používejte zásobní roztok sérového albuminu o koncentraci 2 10-5 mol l -1 a zásobní roztok BPB o koncentraci 1 10-4 mol l -1. Na přístroji Specord M40 pomocí vámi vytvořeného programu změřte absorbanci vzorků při 445 a 606 nm, jako blank použijte citrátový pufr. Absorbanci každé směsi změřte třikrát, na přístroji nastavte délku jednotlivého měření na 5 vteřin. číslo vzorku BSA [ml] pufru [ml] V přidané BPB [ml] 1 2 1,98 0,02 2 2 1,96 0,04 3 2 1,92 0,08 4 2 1,88 0,12 5 2 1,84 0,16 6 2 1,8 0,2 7 2 1,7 0,3 8 2 1,6 0,4 9 2 1,5 0,5 10 2 1,4 0,6 11 2 1,2 0,8 12 2 0,8 1,2 13 2 0 2 14 4 0 0 15 0 0 4 4
Vyhodnocení A, Vyhodnocení pomocí Jobova výnosu Naměřené hodnoty absorbance při 606 nm zprůměrujte a vyneste do grafu proti molárnímu zlomku BPB nebo albuminu. Molární zlomek v maximu na vámi vytvořené křivce odpovídá stechiometrii komplexu albuminu A, Vyhodnocení pomocí Scatchardova výnosu Od jednotlivých absorbancí odečtěte hodnotu absorbance roztoku se samotným albuminem. Potom pomocí Lambertova-Beerova zákona (A = ε c l) vypočtěte extinční koeficienty pro volnou BPB (z absorbancí roztoku čisté BPB) a vázanou BPB (z absorbancí roztoku s nejmenším přídavkem BPB) při obou vlnových délkách. Po získání extinčních koeficientů vypočítejte pro vzorky (kromě prvního, použitého pro výpočet ε pro vázanou BPB) pomocí následujících rovnic koncentrace vázané a volné BPB. Z těchto koncentrací již lze vypočítat B a B/[L]. B vypočtěte jako koncentraci vázané BPB podělené koncentrací albuminu v roztoku. B/[L] vypočtěte jako koncentraci vázané BPB podělené koncentrací volné BPB. Z hodnot B a B/[L] vytvořte graf závislosti B/[L] na B. Tento graf obsahuje body, kterými nelze proložit přímku. Proto graf rozdělte na dva samostatné grafy, tak aby obsahovaly body, které přímkou proložit lze. Graf, který obsahuje prvních zhruba 5 bodů, vyjadřuje vazbu BPB do vazebných míst s vyšší afinitou. Graf s ostatními body vyjadřuje vazbu BPB do vazebných míst s nižší afinitou. Z hodnoty průsečíku regresní přímky s osou x odečtěte maximální počet molekul BPB vázaný vazebnými místy s vyšší, popřípadě nižší afinitou. Diskutujte výsledky získané oběma metodami. Jsou ve vzájemném souladu, nebo si odporují? Jak by bylo možné vysvětlit případný rozdíl? 5