Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie

Podobné dokumenty
Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy,

MALDI hmotnostní spektrometrie pro analýzu kovy značených proteinů. Typ laseru Vlnová délka UV-MALDI N 2

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie

Hmotnostní spektrometrie s průletovým analyzátorem a ionizací laserovou desorpcí v přítomnosti matrice (MALDI TOF MS)

Hmotnostní spektrometrie s analyzátorem doby letu a laserovou desorpcí/ionizací za účasti matrice (MALDI TOF MS)

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním

Základy hmotnostní spektrometrie

MENÍ A INTERPRETACE SPEKTER BIOMOLEKUL. Miloslav Šanda

měkká ionizační technika pro analýzu biomolekul vstup

Identifikace a charakterizace metalothioneinu v nádorových buňkách pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie

Pracoviště (1) Oddělení mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy, Brno, Česká republika (2)Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodověde

Studium vlastností liposomů jako přenašečů léčiv pomocí různých analytických metod

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii. Miloslav Šanda

Úvod do strukturní analýzy farmaceutických látek

LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková

Iontové zdroje II. Iontový zdroj. Data. Vzorek. Hmotnostní analyzátor. Zdroj vakua. Iontové zdroje pracující za sníženého tlaku

No. 1- určete MW, vysvětlení izotopů

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Hmotn mot o n s o t s n t í n sp sp kt k r t ometr t ie

IVD Bacterial Test Standard

Bruker Daltonics s.r.o. Informace o výrobku. Bruker Bakteriální Test Standard

INTERPRETACE HMOTNOSTNÍCH SPEKTER

Hmotnostní spektrometrie. Historie MS. Schéma MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Základy hmotnostní spektrometrie

Autoři: Pavel Zachař, David Sýkora Ukázky spekter k procvičování na semináři: Tento soubor je pouze prvním ilustrativním seznámením se základními prin

Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie - Mass Spectrometry (MS)

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

Moderní nástroje v analýze biomolekul

Hmotnostní spektrometrie ve spojení se separačními metodami

Spojení hmotové spektrometrie se separačními metodami

Hmotnostní spektrometrie.

Stručná historie hmotnostní spektrometrie. Analytická chemie II: Úvod do hmotnostní spektrometrie. Stručná historie hmotnostní spektrometrie.

ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE

Odůvodnění veřejné zakázky

Detekce a detektory část 2

Hydrofobní chromatografie

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ. Stanovení těkavých látek


Příprava GFP pro molekulárně biologické aplikace 1.část: Biosyntéza GFP

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ. Stanovení těkavých látek

Hmotnostní detekce v separačních metodách

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2

Základy hmotnostní spektrometrie

Specifická izolace microrna pomocí magnetizovatelných mikročástic

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS

Chromatografie. Petr Breinek

COSY + - podmínky měření a zpracování dat ztráta rozlišení ve spektru. inphase dublet, disperzní. antiphase dublet, absorpční

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS

CRH/NPU I - Systém pro ultraúčinnou kapalinovou chromatografii (UHPLC) ve spojení s tandemovým hmotnostním spektrometrem (MS/MS)

Sbohem, paní Bradfordová

Základy hmotnostní spektrometrie. Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Králové

Iontové zdroje II. Iontový zdroj. Data. Vzorek. Hmotnostní analyzátor. Zdroj vakua. Iontové zdroje pracující za sníženého tlaku

10. Tandemová hmotnostní spektrometrie. Princip tandemové hmotnostní spektrometrie

2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/85

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

S P E K T R O M E T R I E 2. roník listopadu 2009

STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM

Dynamické procesy & Pokročilé aplikace NMR. chemická výměna, translační difuze, gradientní pulsy, potlačení rozpouštědla, NMR proteinů

INTERAKCE IONTŮ S POVRCHY II.

IVD Bacterial Test Standard

MALDI, DESI, DAPPI, DART

Metody povrchové analýzy založené na detekci iontů. Pavel Matějka

MALDI-TOF MS analýza mikroorganismů

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

2) Připravte si 7 sad po pěti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

Kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí ( LC-MS )

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC

Izolace nukleových kyselin

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

MC230P83 Hmotnostní detekce v separačních metodách, Hmotnostní detekce v separačních metodách III.

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková. záleží na tom, co chceme dělat 1) METHALOTIONEIN 2) GFP

Infračervená spektroskopie

SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá

LC/MS a CE/MS v proteomické analýze

Název: Stanovení železa ve vzorcích krve pomocí diferenční pulzní voltametrie

Metody pro vyhodnocení experimentálních dat

Indentifikace molekul a kvantitativní analýza pomocí MS

Hmotnostní analyzátory a detektory iont

Molekulární modelování a bioinformatika. Hmotnostní spektrometrie I

Struktura proteinů. - testík na procvičení. Vladimíra Kvasnicová

Transkript:

Název: Školitelé: Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie MSc. Miguel Angel Merlos Rodrigo, Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D. Datum: 17.5.2013 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti in vivo zobrazovacích technik

MALDI - MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization = laserová desorpce/ionizace za účasti matrice - tzv. měkká ionizační technika převážně se tvoří molekulární ionty [A+H] + v pozitivním iontovém módu, kde A je analyt a H je atom vodíku - energii laseru absorbuje převážně matrice (organická kyselina), která je v nadbytku nad analytem a po desorpci mu předává náboj - vhodná ionizační metoda pro analýzu celých molekul peptidů, proteinů, oligonukleotidů a dalších http://prescottbiochem09.wikispaces.com/how+does+maldi-tof+work%3f (cit. 16.5.2013)

TOF (TIME-OF-FLIGHT) - průletový hmotnostní analyzátor analyzuje hmotnosti iontů na základě jejich doby letu od iontového zdroje k detektoru m z = 2eU t2 L 2 m je hmotnost, z je náboj, e je elementární náboj, U je vložené napětí, t je doba letu, L je délka driftové zóny - po každém pulsu laseru je vždy zaznamenáno celé hmotnostní spektrum, nemusí se proto dělat sken - analýza molekul o velmi vysoké hodnotě m/z; rozsah je teoreticky neomezený - krátká doba záznamu jednoho spektra to umožňuje měřit několik set spekter z jedné skvrny a tyto spektra pak zprůměrovat - vysoká citlivost díky dobré propustnosti iontů - vysokého rozlišení lze dosáhnout díky použití reflektoru (iontového zrcadla) a zpožděné extrakce - reflektor zvyšuje rozlišení díky zaostřovacímu efektu, kdy ionty s větší kinetickou energií pronikají hlouběji do reflektoru a tím dochází k prodloužení jejich doby letu oproti iontům s menší kinetickou energií, ale se stejným poměrem m/z. - zpožděná extrakce - urychlovací napětí se aplikuje krátce po desorpci a ionizaci molekul analytu, díky tomu dochází v určité míře k vyrovnání rozdílů v počátečních rychlostech iontů vzniklých při desorpci. Schéma TOF analyzátoru z návodu k Bruker ultraflextreme MALDI-TOF/TOF

Příprava analytu a matrice - nejčastěji používané matrice: kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (HCCA), kyselina 2,5-dihydroxybenzoová (gentisová; DHB), kyselina 3,5-dimethoxy-4- hydroxyskořicová (sinapová; SA), 2,4,6 -trihydroxyacetofenon (THAP), kyselina 3-hydroxypikolinová (3-HPA), dithranol (DIT), kyselina trans-3- indolakrylová (IAA) Analyt peptidy (< 10 kda) peptidy, proteiny (> 10 kda) oligonukleotidy (< 3 kda) nukleové kyseliny (> 3 kda) syntetické polární polymery syntetické nepolární polymery sacharidy Používaná matrice HCCA, DHB SA, DHB THAP HPA DHB DIT, IAA DHB, CHCA, THAP Základní aspekty: - matrice musí být v nadbytku nad analytem; c matrice 1000c analytu - roztok matrice by se měl připravit vždy čerstvý pro daný den - ph roztoku matrice musí být kyselé pro analýzu v pozitivním módu; pro okyselení se používá např. kyselina trifluoroctová (TFA) - podíl organického rozpouštědla... rychlejší odpaření rozpouštědla... méně času pro tvorbu krystalků matrice s analytem - analyt se musí kompletně rozpustit a měl by být čirý, případně se provede jeho purifikace (odsolením,...) - MALDI destička musí být čistá

Nanášení na MALDI destičku Mezi hlavní metody nanášení patří: - dried-droplet roztok analytu se smíchá s roztokem matrice v poměru 1:1 a vzniklá směs se nanese na destičku - quick and dirty roztok analytu se s roztokem matrice smíchá až přímo na destičce; většinou se jako první nanese roztok matrice, poté roztok analytu a nakonec se pomocí špičky mikropipety smíchají - overlayer nejprve se na destičku nanese roztok matrice v koncentrovaném organickém rozpouštědle (nejčastěji acetonu), pak se nanese směs roztoku analytu s roztokem matrice - sandwich jako první se nanese roztok matrice s vysokým obsahem organického rozpouštědla, poté se nanese roztok analytu a nakonec se nanese roztok matrice s menším obsahem organického rozpouštědla - fast evaporation nejprve se nanese roztok matrice s vysokým obsahem organického rozpouštědla, počká se, až se rozpouštědlo vypaří, a poté se nanese roztok analytu - vacuum drying postup je stejný jako u fast evaporation, akorát se rychlost vypařování rozpouštědla urychlí pomocí sníženého tlaku

Kalibrace - osa x se kalibruje většinou na směsi standardů peptidů či proteinů; nejčastěji se využívají tyto standardy: Peptid [M+H] +, monoizotopická m/z [Da] [M+H] +, průměrná m/z [Da] Bradykinin 1-7 757.3992 757.86 Angiotensin II 1046.5418 1047.19 Angiotensin I 1296.6848 1297.49 Substance P 1347.7354 1348.64 Bombesin 1619.8223 1620.86 Renin Substrate 1758.9326 1760.03 ACTH clip 1-17 2093.0862 2094.43 ACTH clip 18-39 2465.1983 2466.68 Somatostatin 28 3147.4710 3149.57 Protein [M+H] +,Průměrné m/z [Da] Insulin 5734.51 Ubiquitin I 8565.76 Cytochrom C 12360.97 Myoglobin 16952.30 Trypsinogen 23982 Protein A 44613 Albumin-hovězí (BSA) přibližně 66.5 kda

Bruker new ultraflextreme MALDI-TOF/TOF - 2 khz smartbeam TM II laser v TOF módu a 1 khz v TOF/TOF módu - umožňuje zaostřit laserový paprsek na do průměru až 10 µm to je vhodné pro MALDI Imaging a jeho vysoké prostorové rozlišení - rozlišení až 40000 a přesnost určení hmotnosti je 1 ppm - unikátní metoda samočistění iontového zdroje pomocí infračerveného laseru (jiný laser než je použitý pro ionizaci) zvyšuje životnost a udržuje potřebný výkon přístroje Fotky přístroje ultraflextreme v celku a po otevření krytu

Štěpení proteinu v gelu (z 1D nebo 2D gelové elektroforézy) 1) Připraví se 0.02 mg/ml trypsin z 0.1 mg/ml trypsinu k 20 µl 0.1 mg/ml trypsinu se přidá 80 µl 50 mm NH 4 HCO 3. 2) Ke vzorku gelu (gel je odbarvený a vysušený) s ukotveným proteinem se přidá 50 µl 0.02 mg/ml trypsinu, směs se promíchá a nechá se 60 minut inkubovat při pokojové teplotě. Občas se směs lehce promíchá. 3) Mikrozkumavka se vloží do termostatu a nechá se 2 hodiny inkubovat při 45 C. 4) Supernatant se opatrně odsaje mikropipetou do nové mikrozkumavky (I) a sníží se jeho hodnota ph pod 4 pomocí kyseliny octové. 5) Ke kouskům gelu se přidá 50 µl extrakčního roztoku (5% kyselina octová v 75% ACN) a 15 minut se směs nechá jemně třepat. 6) Supernatant se odsaje do nové mikrozkumavky (II) a zopakuje se bod č. 5 s dalším přídavkem 50 µl extrakčního roztoku. 7) Roztoky v mikrozkumavkách (I) a (II) se nechají při sníženém tlaku (nebo v dusíkové odparce) zkoncentrovat na objem přibližně 25 µl. 8) Z každé mikrozkumavky se odebere 10 µl do mikrozkumavek určených pro purifikaci pomocí ZipTip TM. 9) Purifikace pomocí ZipTip TM špiček a následné nanesení purifikovaných vzorků na MALDI destičku.

Peptidové mapování (PMF = peptide mass fingerprinting) - po selektivním štěpení proteinu trypsinem, který štěpí peptidové vazby za lysinem (K) nebo argininem (R), pokud po nich nenásleduje prolin (P), se získá směs peptidů, jejichž hmotnosti získané pomocí MALDI-TOF poslouží k identifikaci výchozího proteinu - identifikace probíhá na základě srovnání získaných hmotností peptidů s hmotnostmi peptidů uloženými v databázi (SwissProt, NRDB, TrEMBL, aj.) - k porovnání dat slouží různý software (např. Mascot) - pravděpodobnost správné identifikace původního proteinu závisí na několika faktorech, jako např. na poměru nalezených/zadaných peptidů (expectation factor) nebo na procentu pokrytí sekvence v případě Mascotu nám definuje pravděpodobnost určení tzv. log(score), který když je 70, tak poukazuje na to, že daný výsledek je signifikatntní na zvolené hladině pravděpodobnosti Následující obrázek ukazuje identifikaci lysozymu C podle jeho štěpů:

Shrnutí - MALDI-TOF MS je metoda vhodná pro analýzu biomolekul; využívá se především pro identifikaci proteinů, bakterií, apod. - Před měřením je důležitá příprava analytu a matrice; musí se zvolit vhodné rozpouštědlo a případně je nutná purifikace/izolace analytu. - Cílem prezentace a navazujícího workshopu bylo seznámení spolupracovníků s metodou MALDI-TOF a s prací na přístroji Bruker ultraflextreme, což bylo splněno.

Poděkování Laboratoř metalomiky a nanotechnologií prof. Ing. René Kizek, Ph.D. doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Podpořeno projektem: NANOLABSYS CZ.1.07/2.3.00/20.0148

Děkuji za vaší pozornost Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti in vivo zobrazovacích technik