Současné metodické postupy a přehled preimplantační-, prenatální- a postnatální DNA diagnostiky cystické fibrózy v České republice

Současné metodické postupy a přehled preimplantační-, prenatální- a postnatální DNA diagnostiky cystické fibrózy v České republice MUDr. Miroslava Balaščaková 1*, MUDr. Tereza Piskáčková 1*, MUDr. Andrea Holubová 1, MUDr. Eva Raušová 1, MUDr. Veronika Kazárová 1, MUDr. Alice Krebsová PhD 1, MUDr. Monika Koudová 1, RNDr. Alexandra Štambergová CSc. 1, RNDr. Jana Čamajová, PhD. 1,Patricia Norambuena PhD 1, Mgr. Petra Křenková 1, Doc. MUDr. Felix Votava, PhD 2, Doc. MUDr. Věra Vávrová DrSc 3, Doc. MUDr. Milan Macek Sr., CSc. 1 a Prof. MUDr. Milan Macek ml., DrSc. 1 * uvedené autorky přispěly stejným dílem 1 Ústav biologie a lékařské genetiky, University Karlovy v Praze 2. lékařské fakulty a Fakultní nemocnice v Motole, Praha přednosta: Prof. MUDr. Milan Macek ml., DrSc. 2 Klinika dětí a dorostu, UK - 3. lékařské fakulty a Fakultní nemocnice Královské Vinohrady, Praha přednosta: Doc. MUDr. Felix Votava, PhD. 3 Pediatrická klinika, University Karlovy v Praze 2. lékařské fakulty a Fakultní nemocnice v Motole přednosta: Prof. MUDr. Jan Lebl, CSc. Adresa pro korespondenci: Prof. MUDr. Milan Macek ml., DrSc 1 Ústav biologie a lékařské genetiky, University Karlovy v Praze 2. lékařské fakulty a Fakultní nemocnice v Motole, V Úvalu 84, Praha 5, 150 06 Tel.: 224433501 Fax: 224433520 E-mail: milan.macek@lfmotol.cuni.cz 1

2

Souhrn: Cystická fibróza (CF) je nejčastější autozomálně recesivně dědičné onemocnění se závažnou prognózou, způsobené přítomností mutací v genu CFTR. Incidence CF se v České republice odhaduje na 1 : 2700-3800 novorozenců a každý 26.-33. jedinec je zdravým nosičem mutace v genu CFTR. Včasná diagnostika do dvou měsíců života významně ovlivňuje průběh a prognózu tohoto onemocnění. Proto je důležité mít k dispozici spolehlivá molekulárně genetická vyšetření, která stanoví genotyp probanda. Následně je třeba zajistit specializované genetické poradenství. Cílem genetického poradenství u CF je poskytnout rodičům přístupnou a pochopitelnou formou maximum informací o dědičnosti tohoto onemocnění a nabídnout rodině a dalším pokrevním příbuzným genetické vyšetření. V rámci prekoncepční péče informujeme páry o možnostech prenatální diagnostiky tohoto onemocnění. Smyslem je umožnit rodině narození dítěte nepostiženého CF. Klíčová slova: cystická fibróza (OMIM 219700), gen CFTR, prenatální diagnostika, postnatální diagnostika, novorozenecký screening, mutace, varianty, genetické modifikátory, preimplantační genetická diagnostika Summary: Current diagnostic strategies and overview of preimplantation-, prenatal- and postnatal DNA diagnostics of cystic fibrosis in the Czech Republic Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recesive and potentially lethal disorder, caused by mutations in the CFTR gene. The disease's incidence has been estimated to approximately 1 : 2700-3800 newborns in the Czech Republic, which means that every 26 th- 33 rd individual is a healthy carrier of a mutation in the CFTR gene. Early diagnosis by the first two months of life is considered as a favourable prognostic factor. Moreover, the extended molecular genetics analysis is able to confirm clinical diagnosis of CF. Subsequently, specialised genetic counselling is recommended. The aim of genetic counselling in CF is to provide comprehensible information about the heredity of this disease and to offer molecular genetic testing for carrier status in direct family members and/or relatives of the index case. Within the frame of preconception care we inform couples about posibillities of CF prenatal diagnosis. The main 3

purpose of the molecular genetic examination is to provide a choice of a healthy child, not affected by CF for the consultands. Keywords: Cystic fibrosis (OMIM 219700), CFTR gene, prenatal diagnosis, postnatal diagnosis, newborn screening, mutations, variants, genetic modifiers, preimplantation genetic diagnosis Úvod Cystická fibróza (CF; OMIM 219700) [1] je jedním z nejčastějších autozomálně recesivně dědičných onemocnění v bělošské populaci s incidencí cca. 1 : 2000-4000 novorozenců [2,3,4]. Poslední údaje o incidenci CF v různých populacích lze nalézt ve zprávě The Molecular Genetic Epidemiology of Cystic Fibrosis na internetové stránce Světové zdravotnické organizace (WHO; http://www.who.int/genomics/publications/en/) [5]. V České republice byla incidence CF epidemiologickými studiemi v padesátých až šedesátých letech stanovena na 1: 2700 novorozenců [6], přičemž naše nedávná pilotní studie novorozeneckého screeningu prokázala incidenci přibližně dvojnásobně nižší (1: 6400) [7]. Po započtení vlivu prenatální diagnostiky CF v období novorozeneckého screeningu jsme získali hodnotu 1 : 3800 novorozenců, což odpovídá nálezům z ostatních evropských screeningových programů [8]. Celosvětově nebyl dosud rozdíl mezi vyšší epidemiologickou incidencí CF a incidencí onemocnění vyplývající z novorozeneckého screeningu uspokojivě vysvětlen. Z praktického hlediska je stanovení co možná nejpřesnější incidence CF důležité pro určení reziduálního rizika CF u vyšetřovaných, po vyloučení co možná největšího počtu populačně specifických mutací v genu CFTR [9,10,11]. Gen pro CF, nazývaný Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator gene (gen CFTR) je lokalizován na dlouhém raménku 7. chromozomu (7q31.2) a skládá se z 27 exonů [2]. Genomická sekvence genu CFTR zahrnuje cca 230 kb [12,13,14,15], CFTR-mRNA je dlouhá cca 6,5 kb a výsledný CFTR protein má 1430 aminokyselin. Celosvětově bylo dosud popsáno více než 1 500 mutací v genu CFTR a z toho přes 1200 patogenních mutací. (viz. aktuální stav v Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium Dabatase - CFGAC; http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/)[16]. Bohužel molekulárně genetická diagnostika CF je komplikována skutečností, že naprostá většina mutací je privátních a pouze 30 mutací (1717-1G>A, 4

1898+1G>A, 2184delA, 2789+5G>A, 3120+1G>A, 3659delC, 3849+10kbC>T, 621+1G>T, 711+1G>T, A455E, F508del, I507del, G542X, G551D, G85E, N1303K, R1162X, 1161delC, S549N, R117H, R334W, R347P, R553X, R560T, W1282X, 1078delT, 394delTT, CFTRdele2,3(21kb), 3272-26A>G a D1152H) se vyskytuje s četností více než 0,1 %. Mnohé mutace jsou populačně specifické a/nebo se nacházejí ve vyšší prevalenci v populačních či náboženských izolátech [16]. V Evropě v zásadě narůstá heterogenita mutací od Severu na Jihovýchod [16,17,18]. V této souvislosti je nutno rovněž uvést, že objektivně byl patogenetický potenciál vyšetřen expresními studiemi pouze u necelého 1% mutací, a tak kauzální vztah většiny mutací k rozvoji CF byl stanoven pouze jejich asociací s fenotypem choroby u pacienta, u něhož byly původně identifikovány [19,20]. Z hlediska typu mutací se nejčastěji vyskytují mutace vedoucí k záměně aminokyseliny (tzv. missense mutace), kromě nich jsou diagnostikovány nukleotidové substituce vedoucí k zavedení předčasného stop/terminačního kodónu ( stop/nonsense mutace), posuny čtecího rámce jsou dány výpadkem či vnesením takového počtu nukleotidů DNA, který není dělitelný třemi ( frameshift mutace) a sestřihové mutace ( splicing mutace) [21]., včetně delecí/inzercí jednotlivých kodonů, které nevedou k posunu čtecího rámce (viz. aktuálně CFGAC) [16]. Větší delece nebo inzerce zahrnující celé exony a přilehlé intronové sekvence se vyskytují v 1-2 % všech případů a nejsou zachytitelné standardními PCR metodikami, které neumožňují kvantifikaci amplifikace obou alel (paternálních a maternálních) genu CFTR [22,23]. V naprosté většině případů se jedná se o mutace germinální, zpravidla s ancestrální povahou [24], tj. vyskytují se v dané populaci dlouhodobě a jsou důsledkem dávných historických selekčních procesů [25]. Dosud bylo popsáno pouze několik málo de novo mutací, v současné době však nejsou k dispozici žádné spolehlivé údaje o jejich skutečné četnosti. Konečně somatické mutace se v genu CFTR dosud nenašly [2,16]. Z hlediska molekulárně genetické diagnostiky je podstatné uvést, že efekt mutací na jednotlivé složky fenotypu CF je tkáňově specifický [26], přičemž necitlivější je mužský reprodukční trakt (vas deferens / chámovod), pankreas, potní žláza a vedlejší nosní dutiny [105], přičemž bronchiální postižení je na vlivu genu CFTR závislé nepřímo, díky výraznému vlivu prostředí (tj. infekcí) [27] a dalších genetických modifikátorů, jako je například je gen pro TGFbeta1 [19,3,20]. 5

V současné době je molekulárně genetická diagnostika prováděna již ve dvaceti laboratořích v České republice, které se podrobují externí kontrole kvality (http://www.uhkt.cz/nrl/db). Vzhledem k širokému vyšetřování mutací v genu CFTR, jak na klasických genetických pracovištích (soukromých i státních), tak i v poslední době v centrech asistované reprodukce, vyvstala potřeba poskytnout aktuální doporučení pro laboratorní a klinicko-genetické postupy pro molekulárně genetickou diagnostiku CF. Dále tedy uvádíme nejčastější diagnostické situace a doporučené postupy pro jejich řešení: Postnatální molekulárně genetická diagnostika CF Smyslem postnatálního molekulárně genetického vyšetření genu CFTR u pacienta s CF je především potvrzení klinické diagnózy onemocnění. Nesporným přínosem je také možnost provedení prenatální diagnostiky v dalších graviditách rodičů probanda a genetické vyšetření pokrevních příbuzných ke stanovení možnosti přenašečství daných mutací (viz. dále). Spolupracující klinické pracoviště by mělo být poučeno o tom, že pacient nebo u nezletilých jeho zákonní zástupci by měli podepsat informovaný souhlas s vyšetřením (viz například pravidla stanovená Švýcarskou společností lékařské genetikyhttp://www.ssgm.ch/sections/pdf/2001/meetings/ge01/informed_consent.pdf nebo OECD - www.oecd.org\sti\biotechnology). Vzhledem k populačně specifickému zastoupení jednotlivých mutací je při molekulárně genetickém vyšetření genu CFTR klíčové znát etnický původ probanda a znalost distribuce a četnosti mutací v příslušné populaci! Důležité je i znalost populačně specifické incidence CF pro stanovení reziduálního rizika CF (viz. výše). U českých pacientů bylo zatím nalezeno celkem 70 různých mutací (viz. Tabulka 1) [16,17], kde 18 mutací se vyskytlo více než třikrát, což je statistický limit chyby malých čísel při tomto počtu mutací. Vzhledem k autozomálně recesivnímu charakteru CF spočívá strategie tzv. kaskádového molekulárně genetického vyšetření genu CFTR u pacienta s CF spočívá v postupném vylučování 6

nejčastějších mutací v dané populaci [28]. Tento postup je účelný z praktického i ekonomického hlediska. Nález dvou patogenních mutací v pozici trans, tj. v dvou homologních genech na chromozomech paternálního a maternálního původu, znamená ukončení molekulárně genetického vyšetření, a tak finální stanovení genotypu u vyšetřovaného. V některých případech nález dvou závažných mutací v pozici trans nekoreluje s atypicky mírnými průběhem onemocnění (vzhledem k věku pacienta a kvalitě jeho léčby). Zde je třeba pokračovat ve vyšetření celé kódující sekvence genu CFTR, která může odhalit další varianty či dokonce mutace v pozici cis (například F508del-V1212I), které mitigují klinický dopad hlavní mutace a zásadně zlepšují prognózu quoad vitam u vyšetřovaného. Spolupráce s referenčním pracovištěm je v tomto ohledu žádoucí [10]. Pokud je kaskádové vyšetření neúspěšné a pacient vykazuje jasné klinické a laboratorní známky onemocnění (a chloridy v potu jsou větší než 30 mmol / l), je indikováno vyšetření méně častých nebo neznámých mutací genu CFTR tzv. mutačně,,skanovacími metodami [29]. Zde se například jedná o denaturační gradientovou elektroforézu - DGGE nebo analýzu křivek tání DNA - HRMCA; viz také doporučení a databáze projektu EuroGentest www.eurogentest.org nebo CF Thematic Network www.cfbnetwork.be) nebo o přímé sekvenování kódující sekvence genu CFTR a přilehlých intronových oblastí. Při sekvenaci genu CFTR (Lucarelli 2006) je vhodné zahrnout alespoň +/- 50 pb v přilehlých intronech [21], kde se mohou nacházet klinicky relevantní intronové mutace rozrušující konsensuální místa sestřihu exonů genu CFTR. Je potřeba v této souvislosti zdůraznit, že primární využití sekvence pro diagnostické účely je nevhodné vzhledem k tomu, že často jsou nalezeny varianty sekvence genu CFTR jejichž patogenetický dopad není jasný [30]. Jejich nesprávná interpretace může vést k chybné diagnóze a iatrogenizaci vyšetřovaných. Konečně pokud laboratoř nemůže s jistotou určit, zda je nalezená varianta patogenní či nikoli, měla by to výsledkového protokolu ( zprávy ) tuto skutečnost jednoznačně uvést. Zpráva o výsledku by měla splňovat minimální kritéria kvality, tak jak je doporučeno Švýcarskou společností lékařské genetiky - http://www.ssgm.ch/sections/pdf/current/publications/ssgm%20reporting%20guidelines%20dna %20v1.pdf nebo OECD guidelines for quality assurance in molecular genetic testing (viz. výše) [9,11,31]. 7

V případě, že sekvenace kódující sekvence není úspěšná a mutaci se nedaří nalézt, je s výhodou stanovit genotypy varianty M470V (1540A/G), kde alela V (G) je signifikantně asociována s přítomností non-f508del mutací v genu [32]. Podobně nález jedné patogenní mutace (např. F508del) a koncentrace chloridů v potu nad 30 mmol/l, výrazně zvyšují šanci, že se podaří najít dosud neznámou mutaci v genu CFTR [33]. Molekulárně genetická diagnostika u pacientů s CF by měla v každém případě zahrnovat všechny mutace, které se v příslušné populaci vyskytují s četností vyšší než 0,5 % nebo optimálně více než 0,1% [9,10]. V Tabulce č. 1 jsou uvedeny nejčastější mutace v genu CFTR, které byly naším centrem v posledních deseti letech zachyceny. Současně by měly být vyšetřeny časté intragenové přestavby (1-2% všech mutací), které nejsou běžnými metodami založenými na podkladě PCR zachytitelné, a to pomocí moderních kvantitativních technik jakou jsou MLPA / QPMSF [22,23]. Nálézáme především přestavby v oblasti exonů 2-3 a 17A-17B. Ostatně druhou nejčastější mutací v naší populaci je rozsáhlá slovanská delece CFTRdele2,3(21kb) [34]. Pokud nemáme k dispozici informace o distribuci mutací u konkrétní etnické skupiny, je vhodné u těchto pacientů vyšetřit celosvětově nejčastější mutace [16,17]. To platí rovněž pro pacienty, jejichž etnická příslušnost není známa nebo kteří byli počati na podkladě dárcovství gamet. Ne všechny mutace genu CFTR, zvláště pak vzácné (či dokonce privátní) záměny aminokyselin, jsou jednoznačně spojeny z rozvojem klasické formy onemocnění [19,20]. Je proto vždy nezbytné potvrdit segregační analýzou jejich přítomnost u obou rodičů vyšetřovaného segregační analýzou (k ozřejmění jejich lokalizace v obou homologních alelách), protože se mohou se nacházet i pozici cis, tj. v rámci jednoho genu CFTR genu. Současně je vhodné si ověřit jejich patogenetický potenciál v internetové databázi PolyPhen Tm (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) nebo přímo dotazem u autora, který tuto změnu nalezl. Některé mutace jsou spojeny i s mužskou fertilitou (3849+10kbC>T) [35,36], mírným sinopulmonálním onemocněním (A455E) [19,37], v různých populacích s různou mírou pankreatické dysfunkce (R347P) nebo s populačně specifickým rizikem mekoniového ileu (G542X nebo CFTRdele2,3/21kb) [34]. Variabilita CF i u stejné mutace je u jednotlivých pacientů značná [39] 8

a dokonce i rasově specifická [38]. Konečně jednoznačně platí, že negativní nález mutací v genu CFTR neznamená vyloučení diagnózy onemocnění v případě, že jsou splněna ostatní laboratorní a klinická kritéria CF [4,40]. Rodiče pacienta s CF Pokud to okolnosti umožňují, je vždy důležité vyšetřit rodiče pacienta s CF a potvrdit tak nosičství nalezených mutací u každého z nich. Tímto vyšetřením vyloučíme záměnu vzorků nebo eventuální non-paternitu, zvláště pří prenatální diagnostice. Odhalení mutací u rodičů pacienta umožní také cílené vyšetření jejich pokrevních příbuzných. V případě další gravidity s 25% rizikem narození dítěte s CF můžeme rodičům nabídnout možnost invazivní prenatální diagnostiky (t.j. odběr buněk plodu buďto v I. trimestru těhotenství pomocí choriové biopsie CVS nebo ve II. trimestru- amniocentézou) k vyšetření genotypu plodu [41]. Příbuzní pacientů s CF U sourozenců pacientů s CF se známými mutacemi je dostačující prokázat nebo vyloučit familiární mutace v genu CFTR. Pokud nezletilý sourozenec pacienta nevykazuje žádné příznaky CF, doporučujeme v současné době provedení molekulárně genetického vyšetření odložit do doby plnoletosti nebo alespoň do doby, kdy může poskytnout informovaný souhlas a pochopit reprodukční dopady tohoto vyšetření (minimálně 12 let). Pokud není genotyp probanda s jistotou zcela objasněn, lze pomocí nepřímého molekulárně genetického vyšetření určit pravděpodobnost nosičství u dalších pokrevních příbuzných, event. u plodu při prenatální diagnostice. V tomto případě je však nutné mít k dispozici genetický materiál probanda, u něhož však byla diagnóza CF jednoznačně stanovena. Je potřeba mít DNA od probandových rodičů a rodina musí být dostatečně informativní pro kombinaci neznámé mutace s intragenovými a extragenovými markery s neznámou mutací vázaných intragenových a extragenových markerů (tj. diagnosticky relevantních benigních polymorfismů) [11,42,43,44]. K zamezení rizika rekombinace markerů asociovaných s mutovaným genem je vhodné zvolit jejich lokalizaci z obou stran genu CFTR (tj. ze strany 5 a 3 ) [106]. Navíc vzhledem k rozsáhlé 9

oblasti vazebné nerovnováhy v oblasti CFTR lokusu, která začíná 200 kb před promotorem genu CFTR a končí přibližně okolo exonu 14B, poskytují diagnostické markery v této oblasti stejnou míru informativity [44]. Na základě podrobné rodokmenové analýzy je důležité vytipovat pokrevní příbuzné vhodné k molekulárně genetickému vyšetření. Cílem je opět vyloučit nebo potvrdit nosičství familiární mutace. V případě rizika přenašečství neznámé mutace doporučujeme provést nepřímé molekulárně genetické vyšetření. Pokud toto vyšetření provést nelze, je indikováno vyšetření populačně specifických mutací u partnera tohoto příbuzného s dostatečně vysokou populačně specifickou záchytností, převyšující optimálně 90% etnicky specifických alel. Takto výrazně snížíme riziko narození dítěte s CF v jejich rodině, tj. minimálně pod základní populační riziko dané incidencí CF v České republice [9,10,11]. Vyšetření genu CFTR u onemocnění příbuzných CF Kromě suspektní klasické formy CF je postnatální molekulárně genetické vyšetření genu CFTR indikováno i u onemocnění příbuzných CF tj. u mužů s kongenitální bilaterální agenezí vas deferens (CBAVD), neobstrukční formou těžké oligospermie a azoospermie [45,46], chronické idiopatické [47,48] pankreatitidy [49,50,51], roztroušených bronchiektázií [52,53], izolované nosní polypózy [54], chronické rhinosinusitidy [55] nebo alergické bronchopulmonální aspergilózy [56]. Zde je však velice důležité správně interpretovat získané výsledky a pacienta psychicky netraumatizovat diagnózou klasické formy CF, pokud nemá další klinické obtíže a laboratorní známky svědčící pro CF [3,4,40]. Ve většině případů se spíše jedná o atypické formy CF s výrazně lepší prognózou quoad vitam než u klasické formy nemoci [40]. V každém případě je vhodné tyto pacienty dlouhodobě klinicky dispenzarizovat ve specializovaných centrech CF. V případě kongenitální bilaterální absence vas deferens (CBAVD) byla prokázána nezvykle vysoká četnost složeně heterozygotního genotypu mutací F508del a R117H na intragenovém pozadí varianty IVS8 "5T" (pozici cis, tj. v témže genu CFTR; kdy genotypový zápis laboratorního výsledku je F508del/R117H-5T ). Vzhledem k tomu, že u pacientů s CBAVD a ostatními onemocněními příbuznými CF je záchytnost mutací používaných k diagnostice klasické 10

formy CF nízká, nelze vyloučit přítomnost dalších mírných alel. Vyšetření je třeba také rozšířit o mutaci D1152H nebo provést mutační skanování celé kódující sekvence [57], podobně jako u chronické idiopatické pankreatitidy. Nicméně názor na analýzu celé kódující sekvence u onemocnění příbuzných CF není sjednocený vzhledem ke zvýšenému riziku nálezu variant s neznámým či neurčitelným patogenetickým potenciálem klinickou interpretací (viz. výše). Význam molekulárně genetického vyšetření spočívá především v objasnění patogeneze mužské neplodnosti a v primární prevenci CF v širší rodině probanda. Konečně intragenové přestavby v genu CFTR byly nalezeny i u CBAVD [64]. Vyšetření a klinická relevance intragenových variant IVS8 T(n) / IVS-8 TG (n) a polyvariantní haplotypy Geny CFTR, které mají minimálně dvě funkčně relevantní varianty či mutace v pozici cis (tj v témže genu a na témže chromozomu 7), jsou nazývány komplexní alely. V současné době byly nejpodrobněji charakterizovány komplexní alely intronu 8 (IVS-8) v podobě asociace variant TG13-T5, TG12-T5 a TG11-T5 nebo R117H-T5 / R117H-T7 [58], včetně dyády varianty I148T- s mutací 3199del6. Před exonem 9 v intronu 8 genu CFTR se nalézají dvě polymorfní repetice nukleotidových bází v přímé souslednosti (ve směru 5-3 DNA transkripce): TG(n) a T(n). Se vzrůstajícím počtem repetice TG(n) a naopak se snižujícím se počtem repetice T(n) se snižuje i podíl správně sestřižených exonů 8 a 9 v průběhu sestřihu pre-mrna genu CFTR [59]. Transkripty CFTR m- RNA, které nemají exon 9, nejsou dále zpracovány v endoplasmatickém retikulu a transportovány dále z jádra k povrchu buňky [67]. Z tohoto důvodu je na povrchu epiteliálních buněk je menší množství funkčních proteinů CFTR. V rámci lokusu T(n) se vyskytují tři časté alely T5, T7 and T9, vzácně i T3 [60]. Efekt repetice IVS-8 T(n) na správný sestřih exonu 9 je potencován její asociací s IVS-8 TG(n) v pozici cis (viz. výše). Proto alela T5 může být asociována s v pozici cis s TG11 (tj. 11x dinukleotid TG), TG12, TG13 a vzácně i TG15 [61]. Přibližně 5% genů CFTR v náhodné evropské kontrolní populaci obsahuje variantu IVSA-8 T5 [62]. V případě alely T5 počet TG repetic (v pozici cis) určuje výsledné množství plně funkčních 11

proteinů chloridových kanálů CFTR, které zajišťují normální transport iontů na povrchu epiteliálních buňek. Pokud jejich množství klesne pod kritickou hranicí 5-10% normy [63], kdy se kvantitativní defekt změní v kvalitativní, dojde k rozvoji patogenetické kaskády vedoucí k rozvoji atypických- či dokonce vzácně i typických forem CF [59,65]. Asociace TG12-T5 nebo TG13-T5 (obojí v pozici cis) v homozygotním stavu (tj. obě komplexní alely v pozici trans vzájemně vůči sobě) nebo ve složeně heterozygotní podobě s další patogenní mutací v genu CFTR v pozici trans obvykle vede k rozvoji onemocnění příbuzného CF, jako je například CBAVD nebo chronická idiopatická pankreatitida (viz. výše). Je zajímavé, že ve vyšším věku někteří pacienti s CBAVD rozvinou i mírné příznaky sino-pulmonálního onemocnění jako u klasické formy CF. Zcela výjimečně extrémní kombinace TG13-T5 může vést k rozvoji CF, pokud je v pozici trans patogenní mutace [66,59]. Je tedy potřeba nález izolované alely 5T, tak jak je zavzata do většiny současných komerčních diagnostických souprav, vždy doplnit vyšetřením alel poly-tg traktu, protože jinak není možno se vyjádřit k jejímu patogenetickém potenciálu. Naopak kombinace TG11-T5 je velmi nepravděpodobně spojena s rozvojem CF. V případě CBAVD je většina variant T5 asociována v pozici cis s TG12/ TG13 (v 90% všech případů), přičemž pouze 10% alel je spojeno s TG11 [59,65,68]. Podobné asociace platí i u chronické idiopatické pankreatitidy nebo roztroušených bronchiektázii [52]. Na závěr je potřeba uvést, že dosud není dořešena z diagnostického hlediska problematika tzv. polyvariantních haplotypů (tj. přítomnost několika benigních variant v pozici cis), které mohou i při nepřítomnosti kauzální mutace svým additivním či dokonce multiplikativní efektem natolik změnit (negativním loss of function mutation i pozitivním směrem gain of function mutation funkci CFTR proteinu, že vlastně nahrazují přítomnost patogenní alely genu CFTR [59]. Na tuto skutečnost je nutno pomýšlet i v situacích, kdy se sekvenční analýzou nedaří nalézt patogenní mutaci. Výzkum v této oblasti pokračuje a v této souvislosti byly charakterizovány i tzv. subpolymorfní varianty, které se vyskytují v obecné populaci více než v 1% a méně než ve 3% a jsou potenciálně patogenní [42,43]. Z tohoto důvodu je rovněž nezbytné při nálezu vzácné mutace při sekvenční analýze ověřit zda je v pozici cis (velmi pravděpodobně nepatogenní) nebo 12

trans (velmi pravděpodobně patogenní) vůči hlavní nebo časté patogenní mutaci v genu CFTR [69]. Molekulární patogeneze u mutace R117H v asociaci s intragenovou variantou IVS8 T(n) Zajímavá je i asociace mírné mutace R117H v pozici cis s IVS-8 T5 nebo T7 [70]. Asociace R117H-T5 vede k méně funkčnímu proteinu CFTR než asociace R117H-T7. Z tohoto důvodu kombinace R117H-T5 vede k mírné formě CF, zatímco kombinace R117H-T7 vede u mužů převázně k obstruktivní azoospermii až CBAVD nebo dokonce je spojena i s asymptomatickým průběhem z hlediska CF, převážně u žen. Proto se doporučuje v případě nálezu mutace R117H doplnit genotyp varianty IVS-8 5T nebo 7T (tj. pomocí reflexního vyšetření ) [70]. Stanovení počtu thymidinů u varianty IVS-8 T(n) je obzvláště důležité při novorozeneckém screeningu CF, protože více než 7% novorozenců se zvýšenými koncentracemi imunoreaktivního trypsinogenu (IRT) má mutaci R117H v trans s další závažnou mutací v genu CFTR [71]. Z uvedeného vyplývá, že počet pacientů s mutací R117H je vyšší v populaci jedinců zachycených laboratorním testem (tj. novorozeneckým screeningem na podkladě zvýšeného IRT) než zachycených na podkladě klinické diagnózy (tj. symptomaticky). Pacienti s mutací R117H zachycení při novorozeneckém screeningu jsou dosud v průběhu dosavadního sledování (max. 15 let od začátku screeningových programů) asymptomatičtí. Nicméně podobně jako u CBAVD (viz. výše) není možno vyloučit, že se u nich v dospělosti nerozvinou mírné příznaky sinopulmonálního onemocnění, tak jako u klasické formy CF [72]. Na druhé straně mutace R117H je celosvětově relativně velmi častá [16,17]. Z porovnání výskytu této mutace v náhodné kontrolní populaci a u pacientů s CF prokázalo, že pouze přibližně 1% složených heterozygotů s touto mutací a další závažnou alelou v genu CFTR rozvine nějakou z forem CF. Rozhodující je v této souvislosti posouzení asociace R117H s variantou IVS-8 7T v pozici cis. V případě, že je komplexní alela R117H-7T nalezena ve složeně heterozygotní podobě s další mutací v genu CFTR, bude množství plně funkční CFTR-mRNA menší (viz. výše), což vysvětluje rozvoj onemocnění u klinicky diagnostikovaných pacientů. Zatímco pokud bude komplexní alela 13

R117H-7T zachycena na podkladě novorozeneckého screeningu u novorozence/kojence bez klinických příznaků CF, nepovede tato genotypová kombinace pravděpodobně nepovede k rozvoji onemocnění v dětství a rané dospělosti. Nicméně tito pacienti by měli být dlouhodobě sledováni ve specializovaných centrech CF. Tato skutečnost ještě vyžaduje další výzkum a dlouhodobé sledování takto diagnostikovaných pacientů [71]. Komplexní alela I148T-3199del6 Varianta I148T byla omylem na začátku devadesátých let charakterizována jako častá patogenní mutace. Z tohoto důvodu American College of Medical Genetics (ACMG) zahrnula tuto variantu do panelu 25 základních mutací, které by měly být vyšetřovány pří populačním screeningu nosičů CF v U.S.A [69]. Nicméně v roce 2004 bylo stanoveno, že I148T není patogenní a že se jedná o neutrální polymorfismus s populační četností 7% [73]. Při další analýze se prokázalo, že mutace 3199del6 je v pozici cis zodpovědná za rozvoj onemocnění u pacientů s I148T [74]. Vzhledem k tomu, že pouze 1% všech genů s variantou I148T rovněž nese mutaci 3199del6, varianta I148T byla vyřazena z rutinního panelu ACMG v roce 2004 [75]. Tento příklad je uváděn především z toho důvodu, že řada výrobců komerčních diagnostických souprav nezareagovala s dostatečnou flexibilitou a varianta I148T se stále nachází v panelech komerčních diagnostických souprav, bez možnosti reflexního testování pro patogenní mutaci 3199del6! Novorozenecký screening CF: nová perspektiva Včasná diagnostika a systematická specifická terapie u pacientů s CF je jednoznačně považována za prognosticky příznivý faktor a zároveň za průkaz dobře fungující zdravotní péče. Pozdě diagnostikovaná choroba má často komplikovaný průběh a je problémem terapeutickým, psychologickým i sociálně ekonomickým [7,107]. Přestože CF dosud není kauzálně léčitelná, délka a kvalita života pacientů s CF se v posledních desetiletích ve vyspělých zemích významně zlepšila (viz. například data Americké nadace pro CF www.cff.org) a je přímo úměrná celkové úrovni zdravotní péče v daném státě. Nedávná studie dokazuje, že pacienti s CF diagnostikovaní do 2 měsíců věku jsou dlouhodobě v lepším 14

klinickém stavu a mají příznivější průběh choroby [76]. Rozpoznání nemoci v prvních měsících života je však často obtížné - mimo případy mekoniového ileu, vyskytujícího se pouze u 13 % novorozenců s CF. V posledním desetiletí však došlo bohužel v České republice ke zhoršení včasné diagnostiky CF. Tyto údaje nás vedly k vytvoření pilotní studie novorozeneckého screeningu CF, která probíhala v letech 2005 2006, s cílem zjistit, zda je novorozenecký screening CF efektivní z hlediska včasné diagnostiky tohoto onemocnění. CF jsme diagnostikovali u 12 novorozenců, medián věku při stanovení diagnózy byl 37 dní. Současně jsme odhalili tuto diagnózu i u jejich 3 starších sourozenců, kteří měli klinické příznaky CF, ale byli vedeni pod jinými diagnózami [7]. Náš projekt tedy splnil všechna objektivní kritéria stanovená WHO pro jeho celoplošné zavedení. Novorozenecký screening CF je v současnosti významným trendem v řadě evropských zemí i v USA [8]. Nabývá na významu v rámci pomoci dětem s CF v celoplošném měřítku k zajištění uniformní a časné diagnózy, včetně následné péče ve specializovaných centrech CF. Jsme proto přesvědčeni, že uvedené skutečnosti jsou pádným důvodem, k tomu, aby se celoplošný novorozenecký screening začal provádět i v České republice v rámci státem garantované preventivní péče, jako v případech kongenitální hypotyreózy, kongenitální adrenální hyperplazie nebo fenylketonurie. Prenatální molekulárně genetická diagnostika CF Prenatální diagnostika CF je v současné době již neodmyslitelnou součástí genetického poradenství a měla by být dostupná pro všechny páry se zvýšeným rizikem tohoto onemocnění u jejich potomků. Úlohou klinického genetika je zvolit správný vyšetřovací postup. Z hlediska etického je potřeba zvážit nelehkou otázku stále se prodlužujícího mediánu přežívání a zvyšující se kvality života nemocných s CF, oproti možnosti selektivního přerušení těhotenství. Tato delikátní rovnováha se vždy odvíjí od specifické situace konkrétní rodiny a od její zkušenosti s CF ve vlastní, či širší rodině. Následující řádky nabízejí stručný přehled současných vyšetřovacích algoritmů: 15

Partneři s 25% nebo 50% rizikem CF u plodu Pokud jsou oba rodiče zdraví nosiči nebo pokud je partnerem nosiče sám pacient s CF, je riziko postižení plodu vysoké 25 % a 50 %. V těchto případech je partnerům doporučeno invazivní prenatální vyšetření, tzn. biopsie choria (CVS) ve 12. 13. týdnu gravidity, a stanovení genotypu genu CFTR u plodu. Rodinu je nutné informovat o možnosti tohoto vyšetření již prekoncepčně, abychom mohli výkon včas naplánovat. Výhodou tohoto vyšetření je časné stáří gravidity v době odběru, což v případě potvrzení diagnózy CF u plodu umožňuje umělé přerušení gravidity (UPT) na počátku II. trimestru. Tím snížíme riziko komplikací při tomto výkonu u matky a současně zkrátíme období stresu při čekání na výsledek vyšetření. V případě záchytu plodu s CF jsou doporučení klinického genetika přísně nedirektivní povahy a konečné rozhodnutí ohledně zachování těhotenství je pouze na rodičích. UPT lze provést do 24. týdne gravidity. Úlohou klinického genetika je v tomto případě poskytnout rodině komplexní a přitom srozumitelné informace o CF, a to včetně eventuální konzultace s dalšími odborníky pediatr, psycholog atd. Součástí prenatální diagnostiky CF je i vyšetření klinicko-genetické, tj. například u rodin se vyšším věkem matky (nad 35 let) nebo otce (nad 45 let) na nejčastější chromozomální aneuploidie. Hyperechogenita střev u plodu nebo nízká hladina GGT v plodové vodě Další skupinou se zvýšeným rizikem CF tvoří těhotné s negativní rodinnou anamnézou, kde toto zvýšené riziko vychází buď ze záchytu hyperechogenity dutiny břišní u plodu při rutinním ultrazvukovém vyšetření ve II. trimestru gravidity (vzhledem k subjektivnosti nálezu hyperechogenita dutiny břišní musí být minimálně tak intenzivní jako u okolní kostní tkáně) nebo ze signifikantně snížené hladiny gama glutamyltransferázy (GGT nebo dříve používané synonymum GMT ) v plodové vodě pod 3. percentil populačně specifických hodnot [41]. Obojí nález odpovídá prenatálnímu postižení pankreatu a tak malabsorpci u plodu v důsledku ucpání terminálního ilea nenatrávenými zbytky spolykaných epitelií a/nebo chloupků z plodové vody. Při záchytu zvýšené echogenity střevní u plodu je diferenciálně diagnosticky nutné zvážit vrozenou vývojovou vadu GIT, chromozomální aberaci u plodu (a to i v mozaikové podobě), intrauterinně probíhající infekci a prenatální formu CF. Obecně je hyperechogenita střev u plodu způsobená CF maximálně v 10% všech případů [78]. Zde je na místě nabídnout rodině vyšetření nejčastějších mutací v genu CFTR, společně s vyšetřením karyotypu a prenatálních infekcí ze 16

skupiny TORCH [41]. Pokud pacientka odmítne odběr a vyšetření plodové vody, je možné vyšetřit nejčastější mutace genu CFTR u obou partnerů. Pokud se pacientka rozhodne pro amniocentézu, vyšetřujeme gen CFTR přímo u plodu. Abychom snížili riziko kontaminace mateřským materiálem, což by mohlo ovlivnit výsledek molekulárně genetického vyšetření, doporučujeme k tomuto vyšetření použít kultivované amniocyty nebo buňky trofoblastu (z vypreparované CVS). Po vyloučení 38 nejčastějších populačně specifických mutací (zahrnujících přibližně 92% všech populačně specifických mutací) u plodu nebo u obou partnerů je reziduální riziko postižení plodu CF menší než 0,1 %. Přínosem je v případě amniocentézy i biochemické vyšetření plodové vody, jehož součástí je koncentrace GGT [77]. Tento algoritmus funguje i obráceně: pokud je zachycena nízká hladina GGT v plodové vodě, indikujeme vyšetření nejčastějších mutací genu CFTR u plodu a zároveň doporučujeme ultrazvukové vyšetření v 18. 20. týdnu těhotenství se zaměřením na hyperechogenitu dutiny břišní u plodu. Konečně i těhotenství s hyperechogenitou dutiny břišní, u kterých byla CF vyloučena, je doporučována specializovaná perinatální péče s ohledem na zvýšené riziko časného postnatálního ileu [78]. Preimplantační genetická diagnostika CF V současné době se rychle rozvíjí tzv. preimplantační genetická diagnostika (PGD) CF, která je spojena s hormonální stimulací ženy, invazivním odběrem oocytů a metodami asistované reprodukce [79]. Toto vyšetření umožňuje implantovat nepostižené embryo, u kterého pro molekulárně genetické vyšetření mutací v genu CFTR a/nebo vázaných markerů byla biopticky odebrána polární tělíska, jedna až dvě blastoméry či extraembryonální buňky trofoektodermu. Tento postup umožňuje implantovat zdravé embryo (bez mutací nebo pouze nosiče jedné mutace v genu CFTR) a tak předejít selektivnímu přerušení těhotenství jako u standardní prenatální diagnostiky. Přestože se neustále zlepšují molekulárně genetické techniky pro vyšetření mutací genu CFTR nebo intragenových/extragenových markerů, stále je přítomno nezanedbatelné riziko technického selhání metody (falešné pozitivity či negativity) nebo tzv. fenoménu allele dropout [80] při použití několika buněk pro izolaci DNA. Z tohoto důvodu by se měla PGD CF provádět na pracovišti s kvalitním molekulárně genetickým zázemím, laboratorní akreditací podle ISO 15198 (http://www.iso15189.com/) [9,81] a podrobujícímu se 17

mezinárodním kontrolám kvality molekulárně genetické diagnostiky CF. Nezanedbatelné je i riziko ovariálního hyperstimulačního syndromu při hormonální stimulaci [82], komplikace spojené s invazivními metodami odběru oocytů, včetně zvýšeného rizika vzniku poruch tzv. imprintingu při intracytoplasmatické injekci spermií (ICSI) [83]. Z těchto důvodů by PGD měla být pouze metodou volby oproti klasické prenatální diagnostice především v případech, kde pár přerušení těhotenství odmítá z náboženských či závažných sociálních důvodů nebo tam, kde předchozí standardní prenatální diagnostika vedla k opakovaným přerušením těhotenství z genetické indikace [79]. PGD CF je sekundárně vhodná tam, kde pár podstupuje asistovanou reprodukci z jiných příčin, než primárně z důvodu zvýšeného rizika CF (viz. výše). Konečně je rovněž dobrou praxí doporučit po PGD standardní kontrolní prenatální diagnostiku v I.-II. trimestru těhotenství, včetně ultrazvukového vyšetření hyperechogenity dutiny břišní a koncentrací GGT plodové vodě [85]. Vyšetření mutací CF u poruch reprodukce a při asistované reprodukci. Samostatnou kapitolu představují dárci spermií a oocytů. Podle doporučení CF Thematic Network (www.cfnetwork.be) [10] by u nich měly být vyšetřeny nejčastější mutace genu CFTR. V případě záchytu některé z mutací vyřazujeme tohoto dárce/ dárkyni ze seznamu, protože se tím výrazně sníží riziko narození dítěte s CF. Cave: každý 26.-33. jedinec v náhodné české populaci je nosičem jedné mutace v genu CFTR). Vyšetření genu CFTR je indikováno také u pacientů s poruchou spermiogeneze, zejména s obstrukční azoospermií nebo těžkou oligospermií [85]. Pokud je u pacienta mutace zachycena, pokračujeme dále v kaskádovém vyšetření genu CFTR. Pacient by měl zároveň absolvovat potní test a v případě pozitivního výsledku (tj. nad 60 mmol/l) je vhodné doplnit klinické vyšetření, včetně eventuální dlouhodobé dispenzarizace pacienta. Tento postup platí pro všechny pacienty s obstrukční azoospermií, případně jinou těžkou poruchou spermiogeneze, kde byly vyloučeny časté chromozomální aberace a mikrodelece chromosomu Y (DAZ lokus) [84]. V případě záchytu mutace je vždy indikováno vyšetření pokrevních příbuzných pacienta a prenatální diagnostika CF je aktivně nabízena. 18

Vzhledem k tomu, že mužský faktor se podílí na infertilitě z 50% a populační četnosti nosičů mutací v genu CFTR (1: 26 v české populaci) CF Thematic Network doporučuje vyšetření genotypu nejčastějších mutací v genu CFTR i u všech párů podstupujících asistovanou reprodukci, a to bez ohledu na základní diagnózu a negativní rodinnou anamnézu, ale po vyloučení nejčastějších cytogenetických abnormalit [10]. Partner nosiče mutace genu CFTR V rámci prekoncepční péče je indikováno vyšetření nejčastějších mutací genu CFTR (optimálně DNA diagnostickým testem se záchytností vyšší než 90%) také u partnerky či partnera zdravého nosiče mutace v genu CFTR. Při negativitě tohoto vyšetření je reziduální riziko postižení plodu CF pod 0,1 %. Takový pár by měl mít specializovanou péči během gravidity, tzn. podrobné ultrazvukové vyšetření plodu v 18. 20. týdnu těhotenství se zaměřením na hyperechogenitu dutiny břišní u plodu, přičemž po porodu doporučujeme u dítěte provedení potního testu. Pokud by takový pár trval na invazivním vyšetření během gravidity, je možné jim v tomto případě nabídnout odběr a vyšetření plodové vody v 16. 18. týdnu těhotenství. Přínosné je zde vyšetření koncentrace GGT v plodové vodě. Riziko komplikací u tohoto výkonu (tj. 0,5 až max. 1 %) však převyšuje riziko postižení plodu CF [10]. Definitivní rozhodnutí je tedy na rodičích. Molekulárně genetickým vyšetřením je pak možné vyšetřit přítomnost nebo nepřítomnost konkrétní rodičovské mutace u plodu. Při odběru plodové vody je vždy vyšetřen také karyotyp plodu [41]. V diagnosticky komplikovaných situacích lze využít i Bayesova teorému (zhodnocující matematicky míru apriori a aposteriori rizik) pro přesný výpočet reziduálních rizik CF v širší rodině probanda. Tuto relativně komplikovanou problematiku nebudeme v této publikace podrobně rozebírat a odkazujeme na nedávné instruktivní publikace [86]. Rodič s CF Pokud je jedním z rodičů pacient s CF, provádíme na našem pracovišti vyšetření 42 mutací genu CFTR u jeho partnera k dosažení co nejvyšší populačně specifické záchytnosti mutací (více než 92%). V případě, že jsou tyto mutace u partnera vyloučeny, má takto vyšetřený pár riziko 19

narození dítěte s CF cca 1: 625, což je však stále přibližně čtyřnásobně vyšší riziko než riziko populační, dané incidencí CF [86]. Zde opět doporučujeme podrobné ultrazvukové vyšetření plodu se zaměřením na hyperechogenitu jeho dutiny břišní v 18. 20. týdnu těhotenství. Partnerům nabízíme fakultativně i výkon invazivní prenatální diagnostiky, tedy odběr plodové vody s vyšetřením karyotypu plodu, molekulárně genetickým vyšetřením plodu a biochemickým vyšetřením plodové vody [41]. Molekulárně genetické vyšetření prokáže jednu z rodičovských mutací a plod bude vždy minimálně přenašečem mutace v genu CFTR. Po narození dítěte je opět indikováno provedení potního testu na pracovišti, které má podle mezinárodních doporučení CF Thematic Network zkušenost s více než 250 potními testy provedenými metodou Gibson-Cooke [87] ročně k dosažení spolehlivých výsledků [10,11]. Příbuzenské sňatky V rámci prekoncepční péče u příbuzenských sňatků je vhodné vyšetřit nejčastější mutace v genu CFTR. Toto doporučení vychází z principu autozomálně recesivního typu dědičnosti CF, kde konsangvinita rodičů zvyšuje riziko onemocnění dítěte CF nad riziko populační [10]. Prenatální screening mutací v genu CFTR u rodin bez rodinné anamnézy CF V roce 1997 poradní sbor expertů N.I.H. U.S.A. doporučil, že by se s molekulárně genetickým screeningem nosičů mutací v CFTR genu nemělo začít dříve než bude populační záchytnost mutací alespoň 95% (106. Genetic Testing for Cystic Fibrosis, NIH Consensus Statement, Online 1997, 14-16/IV, 15(4):1-37. odp.od.nih.gov/consensus/cons/106/ 106_ statement.htm) [75]. Doporučení pro populační screening nosičů CF byla rovněž publikována American Society of Human Genetics (www.faseb.org/genetics/ashg/ashgmenu.htm/) a Světovou zdravotnickou organizací (www.who.int) nebo Německou společností lékařské genetiky (http://www.forumhumangenetik.de/en/documents/gfh.htm?submit2=show+list). V případě současného stavu v České republice s 96% záchytností všech mutací (viz. Tabulka 1.) by se riziko nosičství CF screeningem snížilo z 1 : 26-30 na 1 : 189-260. Přibližně sedmkrát snížené riziko nosičství mutací u CF se může zdát jako dostatečně nízké, aby ospravedlnilo populační screening CF molekulárně genetickým vyšetřením. [86] Matematické modely však 20

prokázaly, že v populaci by bylo takto zachyceno velké množství izolovaných nosičů [10]. Navíc u většiny z těchto zachycených nosičů by byl jejich partner negativní a tak by míra záchytnosti CF byla snížena. Přesto by tak bylo možno celkově zvýšit efektivitu prenatálně genetické prevence CF. Při ~90% záchytnosti vyšetření mutací genu CFTR je reziduální riziko CF u párů, kde jeden z rodičů by byl pozitivní a druhý negativní, přibližně 2.7x (1 : 1000) zvýšeno nad obecné populační riziko dané incidencí CF (1 : 2700) v České republice [86]. V současné době se proto doporučuje screening asymptomatických nosičů CF: 1/ u jedinců s pozitivní rodinnou anamnézou CF, tj. u příbuzných probanda 2/ v případech nejasné diagnózy CF 3/ u vysoce uvědomělých a motivovaných jedinců i bez rodinné anamnézy CF V posledním případě se jedná o psychologické indikace u profesí, které přijdou dlouhodobě do styku s pacienty s klasickou formou CF, jako jsou například zdravotníci nebo studenti medicíny, kteří z pochopitelných důvodů chtějí znát, zda jsou nosiči mutací genu CFTR. Všechna tato vyšetření musí být provedena po podrobné a nedirektivní genetické konsultaci [10,86,104]. Nicméně i při více než 95% záchytnosti mutací genu CFTR zůstává problematika populačního screeningu CF stále kontroverzní, především z psychologického hlediska. Navíc poslední rozsáhlé sociologické průzkumy prokazují velmi nízké povědomí obecné populace o genetických onemocněních, strachu z nich a z případné stigmatizace celé rodiny [2]. Je nutné vzít v úvahu i případné náboženské a kulturní vlivy, především u neevropských populací. Psychologické a sociologické studie N.I.H. prokázaly, že největší zájem o screening nosičů CF je pouze před plánovaným těhotenstvím nebo v I. II. trimestru těhotenství (106. Genetic Testing for Cystic Fibrosis, NIH Consensus Statement, Online 1997) [69]. Z těchto důvodů by před započetím populačního screeningu měla být obecná populace podrobně seznámena s povahou CF, podstatou testu a jeho dopady, protože jinak hrozí riziko plošné iatrogenní psychické traumatizace velkého množství lidí. Navíc úroveň a rozsah genetických služeb je prozatím celosvětově (včetně České republiky) nedostačující pro genetické konzultace před a/nebo po screeningovém vyšetření CF. 21

Hlavní technický problém populačního screeningu nosičů s CF je podobný jako u screeningu nemocných s CF. Spočívá v tom, že není dosud možné paralelně vyšetřit všechny dosud známé mutace v genu CFTR v etnicky heterogenních populacích. Dosud je rovněž nevyřešena i reálná doba laboratorního vyšetření a náklady spojené s touto formou screeningu CF. Záchytnost příslušného screeningového testu by omezila i etnicita vyšetřovaných vzhledem k tomu, že spektrum vyšetřovaných mutací genu CFTR v rámci takto prováděného screeningu by bylo optimalizováno na většinovou populaci [11]. Vyšetření modifikujících genů a použití tzv. tříd mutací genu CFTR pro klinickou prognózu u CF V současné době se výzkumně studují genetické modifikátory u CF (například mutace v genech TGFbeta1[88], MBL2[89] nebo A1AT [19,90,91]), které ovlivňují nejrůznější aspekty či komplikace u klasické formy CF jaterní onemocnění (CFLD) [92,93] či diabetes mellitus (CFRDM) [94]. I přes určité úspěchy při nálezu statisticky signifikantních asociací je jejich využití při klinické prognostice dosud neopodstatněné. Ukazuje se, že asociace nalezené pro celé soubory nemocných ( kohorty ) nelze jednoznačně aplikovat pro jednotlivé ( konkrétní ) pacienty [95]. Podobné závěry platí i pro použití patogenetických tříd mutací [2] pro předpovězení průběhu CF u nově diagnostikovaných forem CF. U kojenců může však být rozdělení mutací na závažné (Třídy I-III) a mírné (Třídy IV-V) z hlediska jejich dopadu na pankreatickou dysfunkci u CF prognosticky významné [96,97] a může společně se vyšetřením koncentrací elastázy I. ve stolici podkladem pro indikaci pankreatické substituční terapie. Konečně využití typizace mutací v subjednotkách epitelového sodíkového kanálu (ENaC) zatím není diagnosticky využitelné [98]. Existují i onemocnění podobná CF, která jsou v důsledku mutací v non-cftr genech, ale tyto případy jsou velmi vzácné [99,100]. Mimo genetické vyšetření je velmi dobrým prognostickým znakem je i biochemický korelát v podobě koncentrace chloridů v potu. V zásadě platí, že čím vyšší jsou koncentrace chloridů v potu, tím závažnější je molekulární dysfunkce a tak i klinický průběh onemocnění [101,102,103] Názvosloví mutací v genu CFTR 22

Názvosloví mutací v genu CFTR by se nyní mělo principiálně řídit současnými všeobecně akceptovanými návrhy pro jednotné názvosloví mutací od Human Genome Variation Society (HGVS) http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/. Nicméně většina mutací v genu CFTR byla identifikována již dlouho před publikováním součastných návrhů na standardizované názvosloví. Z tohodo důvodu je praktické používat původní názvosloví [104] a to tak, jak je dosud používané v databázi CFGAC (viz. výše), které je navíc v současné době celosvětově uznávané a spolupracujícími klinickými pracovišti široce akceptované (viz. Tabulka 1). K tomu, aby se předešlo chybným interpretacím, by měl výsledkový protokol obsahovat odkaz, podle které nomenklatury (standardní = původní nebo progresivní = genomické) se označení vykazovaných mutací řídí. Velmi dobrý konvertor Mutalyzer mezi oběma názvoslovími lze nalézt na webové stránce www.lovd.nl/mutalyzer. Závěr Specializované genetické poradenství a molekulárně genetické vyšetření nejčastějších mutací v genu CFTR by měly být integrální součástí diagnostického procesu u pacienta s CF a jeho rodiny. Genetické poradenství v graviditě je nedirektivní a vždy respektuje přání rodiny. Naším cílem je zlepšit kvalitu života pacientů s CF a jejich rodin ve spolupráci s dalšími specialisty Center CF v České republice a nabízet superkonziliární služby v této oblasti. Poděkování Podpořeno VZFNM 00064203(6112) a projekty EU: EuroGentest / EuroCareCF. Literatura 1. Davis PB. Cystic fibrosis since 1938. Am J Respir Crit Care Med. 2006;173:475-82. American College of Medical genetics, 2006 edition: Technical Standards and Guidelines for CFTR Mutation Testing http://www.acmg.net/pages/acmg_activities/stds-2002/cf.htm 2. Welsh MJ, Ramsey BW, Accurso F, Cutting GR. Cystic fibrosis.in: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. 8 th ed. New York: McGraw-Hill, 2001; 5121-5188 3. Cutting GR. Cystic Fibrosis In Principles and Practice of Medical Genetics Eds. Rimoin DL, Connor JM, Pyeritz RD (Churchill Livingstone, New York) 131: 26852717, 1997 23

4. Věra Vávrová a kol. Cystická fibróza, Grada 2006 5. Kosorok MR, Wei W, Farrel PM. The incidence of cystic fibrosis. Statistics in Medicine 1997; 15: 449462 6. Houštěk J, Vávrová V. K výskytu cystické fibrosy pankreatu v ČSSR. ČsPediatrie 1962; 17: 445451 7. Holubová A., Balaščaková M., Skalická V., Piskáčková T., Vávrová V., Kračmar P., Gonsorčíková L., Lebl J., Macek M.Jr., Votava F., Novorozenecký screening cystické fibrózy v České republice - závěry pilotní studie; Čes.- slov. Pediat., 2007, roč. 62, č.4, s. 187-195 8. K. Southern, A. Munck, R. Pollitt, G. Travert, L. Zanolla, J. Dankert-Roelse, C. Castellani A survey of newborn screening for cystic fibrosis in Europe; Journal of Cystic Fibrosis 2007, Volume 6, s 57-65 9. Dequeker E, Cassiman JJ. Evaluation of CFTR gene mutation testing methods in 136 diagnostic laboratories: report of a large European external quality assessment. Eur J Hum Genet 1998; 6 :165175 10. Dequeker E, Cuppens H, Dodge J et al. Recommendations for quality improvement in genetic testing for cystic fibrosis European Concerted Action on Cystic Fibrosis. Eur J Hum Genet 2000; 8: S2- S24 11. Girodon Boulandet, E, Cazeneuve, C, Goossens M. Screening practices in the CFTR Gene ABCC7. Human Mutation 2000; 15: 135149 12. Zielenski J, Rozmahel R, Bozon D et al. Genomic DNA sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. Genomics 1991; 10: 214228 13. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science 1989; 245: 10731080 14. Riordan JR, Rommens JM, Kerem B et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 1989; 245: 10661073 15. Rommens JM, Iannuzzi MC, Kerem B et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 1989; 245: 10591065 16. Bobadilla JL, Macek Jr M, Fine, Farell P. Cystic fibrosis: a worldwide analysis of CFTR mutations - correlations with incidence data and application to screening. Hum Mutat 2002; 19: 575-606 17. The molecular genetic epidemiology of cystic fibrosis. Report of a joint meeting of WHO/ECFTN/ICF(M)A/ECFS http://www.who.int/genomics/publications/en/ and WHO Geneva, Human Genetics Programme WHO/HGN/CF/WG/04.02. 18. Serre JL, Simon-Bouy B, Mornet E, et al. Studies of RFLP closely linked to the cystic fibrosis locus throughout Europe lead to new considerations in population genetics. Am J Hum Genet 1990; 84: 449-454. 19. Zielenski J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 2000; 67:117-33. 20. Mickle JE, Cutting GR. Genotypephenotype relationships in cystic fibrosis. Med Clin North Am 2000; 84: 597607 21. Rave-Harel N, Kerem E, Nissim-Rafinia M et al. The molecular basis of partial penetrance of splicing mutations in cystic fibrosis. Am J Hum Genet 1997; 60:87-94. 22. Audrezet MP, Chen JM, Raguenes O, et al. Genomic rearrangements in the CFTR gene: extensive allelic heterogeneity and diverse mutational mechanisms. Hum Mutat. 2004; 23:343-57. 23. Ferec C, Casals T, Chuzhanova N et al. Gross genomic rearrangements involving deletions in the CFTR gene: characterization of six new events from a large cohort of hitherto unidentified 24