Vztah mezi log P a povrchem, resp. objemem, molekuly

LEKCE 9 Kvantifikace H-vazeb Molekulová refrakce (MR) její interpretace Chromatografické metody hodnoc lipofility - druhy rozdělovací chromatografie, mechanismus - extrapolace na nulovou koncentraci modifikátoru - vztahy mezi log P a chromatografickými veličinami, využití chromatografických veličin v QSAR - moderní chromatografické metody v hodnoc lipofility

Vztah mezi log P a povrchem, resp. objemem, molekuly - souvislost hydrofobní interakce (entropických změn) s lipofilitou u nepolárních látek v serii alkylbenzenů (Yalkovski S.H. a Valvani S.C. (1976): log P = 0.0275 SA 0.863 14 0.996 0.071 (1) SA (surface area) mol.povrch (Pozor: systematická odchylka u rozvětvených alkylů geometrie molekuly je rovněž důležitá) Použit molekulový objem (Moriguchi a spol.(1975): log P = 2.51 V W + 0.23 60 0.980 0.228 (2) V W. van der Waalsův objem (lze vypočítat, Bondiho r*) *jsou tabelovány včetně korekcí na překryv valenč.orbitalů Kuchař, Rejholec: Využití kvant.vztahů mezi strukturou a biol.aktivitou, Academia 1987

V x. McGowanův objem, jednodušší výpočet z atomových příspěvků a korekce na vazbu, jsou tabelovány* *Dearden a spol. v: QSAR: Rational Approaches to the Design of Bioactive Compds, Elsevier 1991 pro 59 substituentů: V x = a.v W + b r = 0.979 U polárních látek použití SA nebo V W nestačí; Např. - interakce hydrofilních skupin lze kompenzovat použitím parametrů charakterizujících tvorbu H-vazeb

Kvantifikace H-vazeb V souvislosti s lipofilitou polárních látek (vztah k molekulovému povrchu) - původně vypracovány dva systémy pro hodnoc vlivu H-vazeb: 1) I H (Seiler). odvozeny z log P v systémech voda/n-oktanol, voda/cyklohexan Rozdílů mezi log P a log P L lze využít k charakterizaci tendence k tvorbě H- vazeb: log P L = log P SI H (1) log P L P v soustavě voda-lipofilní rozpouštědlo (cyklohexan) I H.. příspěvek vodíkových vazeb jednotlivého strukturního segmentu 2) V H (Moriguchi). z regr.vztahů logp vs, V W pro polární látky log (1/S) = 3.73 ( 0.26) V W 4.10 ( 0.22) V H 0.72 ( 0.26) (2) n = 156, r = 0.960, s = 0.373 I H a V H vzájemně nekorelují

Kvantifikace H-vazeb pokračování C d, C a (Raevsky).. vypočteny z termodynamických veličin (program HYBT) a tabelovány (odpovídají H-donorové a H-akceptorové aktivitě fragmentů) log P = 0.266 ( 0.030) a - 1.00 ( 0.10) SC a (1) n =2850, r = 0.970, s = 0.23 log S w = -0.258 ( 0.017) a + 1.08 ( 0.10) C a - 0.20 ( 0.09) C d (2) n = 142, r = 0.953, s = 0.38 a.. molekulární polarizabilita (vypočtena na základě aditivity) Raevsky.A. a spol. v: Molecular Modeling and Prediction of Bioactivity (Gundertofte, Jorgensen, eds), str. 221, Kluwer Academic, New York, 2000. Miller K.J.: J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 8533.

Molekulová refrakce (MR) a lipofilita Molekulová refrakce: MR = [(n 2 1) / (n 2 + 2)]. MH/d (1) - přímo úměrná molekulovému objemu míra lipofility nebo stérického efektu Exper.stanov z indexu lomu n MR = 4paN A / 3 (2) - přímo úměrná elektronové polarizabilitě a - míra disperzních sil - - podílejí se na lipofilitě polárních látek Aditivně-konstitutivní charakter tabelované atomové inkrementy Přebytková molekulová refrakce (DMR): DMR = MR (látka) - MR (alkan se stejným V x ) (3) zavedena Abrahamem Abraham M.H. et al. J.Chem.Soc. Perkin Trans.2, 1990, 1451 - tabelovány pro 48 substituentů Dearden a spol. v: QSAR: Rational Approaches to the Design of Bioactive Compds, Elsevier 1991

Interpretace MR: - obtížná vzhledem k dichotomnímu charakteru MR - objem: stérický efekt - disperzní síly: lipofilita Při vyjádř stérického efektu: znaménko regresního koeficientu záporné, konkávní tvar nelineární závislosti (velmi nepravděpodobná) Při vyjádř lipofility: znaménko regresního koeficientu kladné, konvexní tvar nelineární závislosti Známy případy, kdy jsou disperzní síly vhodnější než lipofilita: a) vazba 4-aryl-b-D-glukosidů na concavalin A: log M 50 = 0.097 p + 2.37 19 0.664 0.095 (1) log M 50 = 0.019 MR + 2.23 19 0.950 0.038 (2) b) lokální anestetická účinnost a-arylalkylamidů dialkylaminooctové kyseliny: log (1/C) = 0.497 MR - 0.003 MR 2-20.18 (3) n = 12 r = 0.951 s = 0.161 F = 42.3 log (1/C) = 0.625 log P 0.057 (log P) 2 + 0.063 (4) n = 12 r = 0.797 s = 0.314 F = 7.8

Lipofilita v komplexním vztahu k relevantním interakcím Abrahamova rovnice Abraham M.H., Chem.Soc.Rev. 1993, 22, 73 Log K = m.v x + r.dmr + s.p 2 + a.sa 2 + b.sb 2 + c (1) V x hydrofobní interakce DMR disperzní síly (též značena R) p 2 parametr polarizovatelnosti (např. a) a 2, b 2 donor akceptorová aktivita log P = - 3.814 V x + 0.562 R 1.054 Sp 2 0.034 Sa 2 3.460 Sb 2 + 0.088 (2) n = 613 r = 0.997 s = 0.116 F 0.005 = 23162 Abraham M.H. et al. J.Pharm.Sci. 1994, 83, 1085 log k w = 3.484 V x + 0.409 R 0.955 p 2 0.038 Sa 2 3.092 Sb 2 + 0.066 (3) n = 35 r = 0.990 s = 0.221 F = 288 Lombardo F. et al. J.Med.Chem. 2000, 43, 2922

Druhy rozdělovacích chromatografií: - TLC - HPLC - kapilární elektrokinetická chromatografie (CEC) v proved reverzní fáze (mobilní fáze je hydrofilní) Předpoklady pro využití k hodnoc lipofility: 1. rozdělovací mechanismus 2. platnost LFER mezi chromatografickým a rozdělovacím systémem bvykle nejsou v plné šíři splněny Chromatografické veličiny odpovídající lipofilním parametrům: TLC: P S = (A M /A S ). [(1/R F ) - 1] (Martin et al.) (1) A M, A S průřezy mobilní a stacionární fáze; R F charakterizuje vzdálenost od startu R M = log [(1/R F ) - 1] (Bate-Smith & Westall) (2) log P S = R M + const (3) HPLC, CEC: P S = (V m /V S ). [(t r t 0 )/t 0 ] (4) log k' = log [(t r - t o ) / t o ] (odpovídá R M ) (5) log P S = log k'+ const (6) platí-li : log P = a.log P S + b (7) pak : log P = a'.r M (log k') + b (8)

Experimentální podmínky: TLC: stacionární fáze silikagel: chemicky modifikovaný, impregnovaný (parafin, silikonový olej, C8 C12 alkohol) - polyamid mobilní fáze voda (s ph upraveným pufrem) + modifikátor (aceton, methanol) HPLC: stacionární fáze náplňové, kapilární silikagel chemicky upravený (nejčastěji oktadecylsilanizací DS, též alkylnitril, endcapping) mobilní fáze - voda (s ph upraveným pufrem) + modifikátor (methanol, acetonitril) - omez interakcí se silanolovými skupinami: přídavek n-oktyl, n-decylaminu přídavek iontové sloučeniny (1-ethyl-3-methylimidazolinium BF 4 ) pro bazické látky Kaliszan R. et al., J. Chromatogr. A 2004, 1030, 263. CEC: stacionární i mobilní fáze obdobné jako v HPLC; kombinuje podmínky kapilární elktroforézy a HPLC - sloupec je pod elektrickým proudem o vysokém napětí něno přídavkem n-oktanolu do mobilní fáze (po případě nasyc vody n-oktanolem) standardizována ECD, EPA

Mechanismus separace v rozdělovací chromatografii Záleží na charakteru stacionární (pevné fáze); důležitý je i charakter mobilní fáze TLC silikagel impregnovaný lipofilním rozpouštědlem: - rozdělovací mechanismus kontaminován absorpčním mechanismem (vliv silanol.skupin) Hulshoff + Perrin: ověř rozděl.mechanismu křemelina impregnovaná oleylalkoholem neplatí pro silikagel impregnovaný silikon.olejem Kuchař M. et al. J. Chromatogr. 1979, 167, 197. - silikagel chemicky upravený: - obdobný mechanismus jako v RP HPLC - silikagel chemicky upravený a impregnovaný: - významně omezen absorpční mechanismus HPLC (CEC*) separace probíhá mezi mobilní (vodnou) fází a alkyl.řetězci na povrchu silikagelu (v nich částečně absorbován organický modifikátor) rovnováha výsledkem řady interakcí nejvýznamnější: solut obklopen alkylovými řetězci (hydrofobní interakce), něny dalšími interakcemi solvofobní mechanismus vliv polárních skupin na linearitu *kapilární elektrokinetická chromatografie spojuje výhody HPLC a kapilární elektroforezy širší možnosti hodnoc látek s různými polárními skupinami

Chromatografie disociujících látek: (obdoba stanov rozděl.koeficientu) pro kyseliny: R M = R M exp + log (1 + 10 ph pk ) = R M exp + C D (1) pro báze: R M = R M exp + log (1 + 10 pk ph ) = R M exp + C D (2) (platí pouze za předpokladu, že disociovaná forma nepřechází do org.fáze) Korekce C D závisí na pk a ph, resp. DpH: pro kyseliny: DpH = pk ph pro báze: DpH = ph pk pro DpH > 2 C D = 0 proto výhodné měřit při ph, kdy je disociace potlačena (problém s bázemi) Extrapolace na nulovou koncentraci modifikátoru (R Mw, log k w ) Soczewinski a Wachtmeister (1962): R M je lineární funkcí slož mobilní fáze pro binární směs: R M = ф 1 R M1 + ф 2 R 2 M (3) kde ф 1 a ф 2 jsou objem.podíly složek mobilní fáze R M = a.c + b (4) kde C je objemová koncentrace modifikátoru Využití extrapolovaných hodnot obecně doporučováno směrnice ve vztahu chromatogr.veličina vs. log P se blíží 1 (srovnatelnost výsledků QSAR) Nevýhody: experimentálně pracné, časově náročné zvýš vlivu exper.chyby nelinearita kolem nulové koncentrace Zjednoduš: výpočet log k w ze dvou gradientových měř Snyder L.J., Dolan J.W., J. Chromatogr. A 1996, 721, 3

Závislost chromatografických veličin na koncentraci modifikátoru v mobilní fázi

Použití chromatografických veličin: a) ke stanov neznámých log P b) přímo jako parametrů lipofility V 1. případě nezbytný požadavek: lineární vztah mezi chromatografickou veličinou a log P prokázán na různých stacionárních fázích v TLC i HPLC statist.významnost stoupá se strukturní podobností serie látek (platí požadavky pro Colanderovu rovnici) Příklady: R TLC: stacionární fáze silikagel impregnovaný silikonovým olejem mobilní fáze pufr (ph 4.1) / 50 % acetonu skořicové kyseliny: n r s F log P = 2.498 R M + 3.456 8 0.990 0.147 309.4 aryloctové kyseliny: log P = 2.815 R M + 3.187 10 0.995 0.080 774.3 benzoové kyseliny: log P = 3.371 R M + 3.454 6 0.983 0.094 115.8 Celá série: n = 24, r =0.984, s = 0.099, F = 685 Y H

Substituované arylsulfanylbenzoové kyseliny: Z ( )n TLC: stacionární fáze silaniz.silikagel impregnovaný silikonovým olejem mobilní fáze pufr (ph 4.1) / 50 % acetonu HPLC: stacionární fáze - Thermoquest-Hypersil DS mobilní fáze pufr (ph 5.7) / 50 % acetonitril S 3-5 log P = 2.237 ( 0.360) log k + 4.841 ( 0.473) 20 0.971 0.243 319.2 (1) log P = 2.765 ( 0.346) R M + 6.933 ( 0.149) 20 0.982 0.191 529.6 (2) log k = 1.214 ( 0.114) R M + 0.940 ( 0.049) 20 0.992 0.057 1155.8 (3) Kuchař M. et al. Coll. Czech. Chem. Commun. 2004, 69, 2098. Arylethylamido deriváty aryloctových kyselin: X Z N log k = 0.299 ( 0.109) log P + 1.457 ( 0.625) 13 0.925 0.068 72.0 (4) log k = 0.273 ( 0.075) log P + 0.141 ( 0.099) I NH - 0.230 ( 0.226) s X - 1.422 ( 0.404) 13 0.973 0.041 73.2 (5) Kuchař M. et al. Eur. J. Med. Chem. 42, 2007, 1084-1094. n H Y H

Speciální úpravy: vysoká přesnost stanov log P (neutrálních látek) a log D (bazických látek): Lombardo F. et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 2922; 2001, 44, 2490. - stacionární fáze: bazicky deaktivovaný Supelcosil LC-ABZ - mobilní fáze: methanol/pufr + 0.25 % n-oktanolu - standardizována - srovnání s běžným DS silikagelem Neutrální látky: log P = 1.089 ( 0.097) log k w 0.543 ( 0.277) 27 0.914 0.556 126 (1) log P = 1.101 ( 0.039) log k w 0.005 ( 0.094) 27 0.985 0.238 803 (2) Neutrální a bazické látky: log D = 1.127 ( 0.023) log k w 0.208 ( 0.043) 90 0.982 0.309 2339 (3) Výhody proti exper.stanov log P: Nevýhody: - malé množství látky strukturní podobnost - rychlost stanov závislost na exp.podmínkách - nízká citlivost k nečistotám obtížná standardizace - velké rozmezí lipofility (cca 6 log P jednotek) - vysoká přesnost - velmi dobrá reprodukovatelnost - n nutná kvantitativní analytická metoda

2. Přímé použití chromatogr.veličin jako parametrů lipofility Řada monografií shrnuje výsledky využití chromatogr.veličin: Kaliszan R. Quantitative Structure-Chromatographic Retention Relationships, Wiley, New York 1987. Kuchař M., Rejholec V. Využití kvantitativních vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou, Academia, Praha 1987. Valko K. v: Separation Methods in Drug Synthesis and Purification (Valko K, ed.) Elsevier, Amsterdam 2000, str. 535-580. Příklady: Antiagregační účinnost aryloxoalkanových kyselin: X n r s F log (1/C) = 0.800 log P - 0.131 (log P) 2 + 0.344 I L + 0.163 E S + 0.683 23 0.958 0.080 50.2 (1) log (1/C) = 0.730 R M - 1.125 R M2 + 0.341 I L + 0.163 E S + 1.700 23 0.968 0.070 67.1 (2) Q H

Arylethylamidoderiváty aryloctových kyselin - inhibice biosyntézy LT B 4 : X Z N n log (1/C) = 5.936 ( 5.627) log P - 0.476 ( 0.471) (log P) 2-13.549 (1) n =9, r = 0.954, s = 0.068, F = 41.1, p = 0.01 log (1/C) = 4.491 ( 4.490) log k 4.912 ( 4.411) (log k) 2 + 3.930 ( 0.960) (2) n = 9, r = 0.865, s = 0.113, F = 12.8, p = 0.05 Arylethylamidoderiváty aryloctových kyselin inhibice vazby LT B 4 na receptory: log (1/C) = 7.044 ( 5.279) log P - 0.536 ( 0.467) (log P) 2-17.199 ( 14.785) (1) n =10, r = 0.963, s = 0.169, F 57.9, p = 0.05 log (1/C) = 6.467 ( 6.398) log k 5.336 ( 4.931) (log k) 2 4.129 ( 0.760) (2) n = 10, r = 0.936, s = 0.220, F = 32.7, p = 0.01 Pokles statistické významnosti viz vztah log k vs, log P: log k = 0.273 ( 0.075) log P + 0.141 ( 0.099) I NH - 0.230 ( 0.226) s 1 1.422 ( 0.404) (3) n = 13, r = 0.973, s = 0.041, F = 73.2, p = 0.01 Y H

Moderní chromatografické metody v hodnoc lipofility Chromatografie na imobilizovaných umělých membránách (IAM) Struktura membrány: fosfolipidová dvojvrstva orientace fosfolipidů, uhlovodíkové řetězce dovnitř; nejrozšířenější: fosfatidylcholin (zwitterion N +, P 4-3 ) - rozdíly proti n-oktanolu: membrány jsou anisotropní Důležité při průchodu ionizujících látek (prostorová orientace fosfolipidů) elektricky nabité (současná léčiva: 63 % ionizujících 14.5 % kyselin 67.6 % bazí 17.9 % amfolytů)

IAM stacionární fáze: silikagel s vázaným n-propylaminem, na němž je přes řetězec dikarboxylové kyseliny vázán glycerofosfatidylcholin (PC) P N + k povrchu silikagelu endcapping NH 2 skupin a) H-propinovou kyselinou - IAMPC-MG b) C 3 a C 10 kyselinou - IAMPC-DD2 a) IAMPC.MG endcapping H-propionovou kyselinou b) IAMPC.DD2 - endcapping C3 a C10 kyselinou c) IAMPC.DD - bez glycerin.můstku, endcapping C 3 a C 10 kyselinou - mobilní fáze: voda, popř. jako modifikátor acetonitril, methanol nevhodný (methanolýza) obvykle extrapolace na nulovou koncentraci log k w

Vztahy mezi IAM kolonami: MG (přes H-propionovou kyselinu) nejméně lipofilní, DD (C 10 dikarboxylová kys.) nejlipofilnější Mezi MG a DD2 (obě s glycerinovým můstkem) velmi dobrá korelace Příklad: log k (DD2) = 0.864 ( 0.063) log k (MG) + 0.480 ( 0.069) 18 0.960 0.118 Mezi MG a DD (chybí glycerin.můstek) pouze pro nepolární látky b-adrenolytika: Vztahy k log P, log D, resp. log k z HPLC: log D = 2.055 ( 0.206) log k IAMw 1.560 ( 0.123) 10 0.962 0.320 (1) log k C18 = 1.869 ( 0.287) log k IAMw 1.271 ( 0.179) 9 0.926 0.412 (2)

Cyklopropylaminotriaziny: R 1 N H N N R 2 HPLC: Waters RP 8; methanol/pufr ph 7.4 log P = log D (při ph 7.4) log P = 0.948 ( 0.193) log k w 0.081 ( 0.508) 18 0.778 0.423 24 (1) IAMC: IAMPC-MG (nejméně lipofilní); pufr ph 7.4 log P = 1.391 ( 0.082) log k IAM + 0.957 ( 0.09) 18 0.973 0.154 286 (2) Ducarme A. et al. Eur. J. Med. Chem. 1998, 33, 215. N Využití log k IAM v QSAR: Fenothiaziny antihemolytická účinnost: IAMC: IAMPC-MG, pufr ph 7.0 log (1/C) = 1.126 ( 0.174) log k IAM 3.266 ( 0.266) 8 0.935 0.102 (3) log (1/C) = 0.405 ( 0.130) log D + 3.662 ( 0.416) 7 0.812 0.170 (4) Kaliszan R. et al. Eur. J. Med. Chem. 1994, 29, 163.

N-Alkyl a N-acylaminotriaziny potenciace tremoru: R 1 N N N N log PCTR = 1.111 ( 0.295) log k IAM 1.032 ( 0.180) (log k IAM ) 2 + 1.880 ( 0.149) (1) n = 15, r = 0.878, s = 0.306, F = 20 log PCTR = 2.421 ( 0.395) log P 0.635 ( 0.087) (log P) 2 0.216 ( 0.437) (2) n = 15, r = 0.922, s = 0.247, F = 34 Ducarme A. et al. Eur. J. Med. Chem. 1998, 33, 215. v QSAR farmakokinetických dat b-adrenolytik: log k IAM a log D srovnatelné; log k C18 horší korelace Kaliszan R. et al. Eur. J. Med. Chem. 1994, 29, 163. N R 2

Speciální stacionární fáze - bazicky deaktivované, vhodné pro organické báze nevyžadují přídavek maskovacích aminů (Supelcosil ABZ +, Zorbax Extend C 18 ) - viz Lombardo et al. - vysoká korelace s log P (standardizována) možnost zvýšit ph až na 11.5 - mobilní fáze: voda + acetonitril, methanol Stella C. et al. J. Sep. Sci 2002, 25, 1351 - monolitické kolony (silikagel, polystyren, polymetakryláty) porézní vhodné pro separaci peptidů log k = f (log P, log VdW) k predikci retenčních časů peptidů - mobilní fáze: voda + acetonitril + 0.1 % kys.trifluoroctové Baczak T. et al. J. Proteome Res. 2005, 4, 555 - micelární kapalinová chromatografie (MLC) speciální typ konvenční RP HPLC, - mobilní fáze: roztok povrchově aktivní látky (anion, kation, neutrální) nad její CMC Na taurocholát, Na-deoxycholát, Na-dodecylsulfát - mechanismus separace: dvě rozdělovací rovnováhy vodná fáze vs. micely a vodná fáze vs. C 18 stacionární fáze Fuquet E et al. J. Chromatogr. A 2002, 942, 237.

Shrnutí - log k z imobilizovaných umělý membrán mohou často lépe vystihovat rozdělovací rovnováhu v přirozeném biologickém systému než log k z HPLC či R M hodnoty z TLC - vhodnost log P (log D) ve srovnání s log k z IAM zřejmě závisí na charakteru biologického systému - lineární vztahy k log P jsou obvykle statisticky významné - vývoj nových chromatografických systémů využitelných pro hodnoc lipofility stále pokračuje

Zápočtový test A (13. dubna 2011) 1. Popište společné a rozdílné znaky originálních a generických léčiv 2. Uveďte výhody a nevýhody biotechnologických léčiv 3. Popište hlavní etapy klinického hodnoc originálního léčiva 4. Vyjmenujte a stručně charakterizujte hlavní metody vyhledávání vůdčích struktur 5. Co jsou profarmaka (prodrugs), uveďte alespoň jeden příklad 6. V rovnici charakterizující vztah mezi log kapacitních faktorů log k (HPLC) a log rozdělovacích koeficientů vypočítejte meze spolehlivosti regresních koeficientů na odpovídající hladině statistické významnosti p s použitím hodnot t a standardních odchylek s pro jednotlivé regresní koeficienty: log k = 0.273 (...) log P + 0.141 (...) INH - 0.230 (...) s1-1.422 (...) n = 16, r = 0.973, s = 0.041, F = 73.2, p = 0.01 hodnoty s: 0.0245; 0.0324; 0.0740; 0.3274 7. Jaké znaménko mají konstanty s substituentů přitahujících elektrony a jakému typu reakce odpovídá záporná hodnota konstanty r? 8. Vysvětlete proč je závislost biologické účinnosti na lipofilitě obecně nelineární a jak lze vypočítat optimální lipofilitu v parabolickém modelu?

Zápočtový test A (13. dubna 2011) 9. Které mezimolekulární interakce zařazujeme mezi tzv. slabé interakce 10. Vypočítejte fragmentovou metodou log P následujících látek: a) 4- ethoxy-3-hydroxy-a-methylskořicové b) efedrinu H c) 2-(N-methylamino)ethanol (N-methylethanolamin) H N H H N log P exp = -0.94 H H log P exp = 0.93