MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2011 LENKA KRUTILOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Detekce polymorfismů prionového genu asociovaného se scrapií u ovcí pomocí molekulárně genetických metod Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracoval: Lenka Krutilová Brno 2011

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Detekce polymorfismů prionového genu asociovaného se scrapií u ovcí pomocí molekulárně genetických metod vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

Abstrakt Bakalářská práce je zaměřena na shrnutí nejnovějších poznatků o možnostech detekce polymorfních variant prionového genu, asociovaných se spongiformní encefalopatií u ovcí pomocí molekulárně-genetických metod. První část je zaměřena na popis onemocnění transmisivních spongiformních encefalopatií u lidí. Druhá část popisuje tato onemocnění u zvířat. V práci jsou zmíněny i preventivní opatření v České republice a Evropské unii, která mají snížit riziko šíření těchto nebezpečných nemocí. Čtvrtá část shrnuje nejnovější poznatky ve studiu spongiformní encefalopatie u ovcí, zejména využitím molekulárně-genetických metod, jejímž cílem je detekce genotypů prionového genu asociovaného s tímto onemocněním. Klíčová slova: TSE, BSE, prion, CJD, genetika Abstract The thesis is aimed to summarise the latest knowledge about the possibilities of detecting polymorphic variants of the prion gene associated with spongiform encephalopathy in sheep by molecular genetic methods. The first part is focused on the description of the disease transmissible spongiform encephalopathies in humans. The second part describes the diseases in animals. In the work there are also mentioned preventive measures in the Czech Republic and in the European Union, which should reduce the risk of the spread of these dangerous diseases. The fourth part summarises the latest findings in the study of spongiform encephalopathy in sheep using especially molecular genetic techniques. Its aim is to detect the prion gene genotypes associated with this disease. Keywords: TSE, BSE, prion, CJD, genetics

Obsah OBSAH... 5 ÚVOD... 7 1 TSE... 8 1.1 TSE člověka... 9 1.1.1 CJD... 9 1.1.2 Nová varianta CJD (vcjd)... 10 1.1.3 Kuru... 12 1.1.4 Gerstmann Straussler Scheinker syndrom (GSS)... 13 1.1.5 Fatální familiární insomnie (FFI)... 14 1.2 TSE zvířat... 14 1.2.1 Scrapie... 14 1.2.2 CWD... 14 1.2.3 BSE... 17 1.2.4 Důležitá data o BSE... 17 2 BSE... 18 2.1 Co je BSE?... 19 2.2 Příčina vzniku BSE... 19 2.2.1 Odkud se vzaly priony?... 19 2.2.2 Příznaky... 21 2.2.3 Fáze nemoci... 21 2.3 Pozitivní případy v ČR... 21 2.4 Opatření v České republice... 23 2.5 Opatření v Evropské unii... 24 2.6 Testování BSE... 24 3 SCRAPIE... 25 3.1 Co je scrapie?... 25 3.2 Příčiny vzniku scrapie... 26 3.3 Testování scrapie... 26 3.4 Opatření v České republice... 26

3.5 Opatření v Evropské unii... 27 4 GENETICKÉ TESTOVÁNÍ BSE A SCRAPIE... 27 ZÁVĚR... 36 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY... 37 SEZNAM ZKRATEK... 40 SEZNAM OBRÁZKŮ... 42 SEZNAM TABULEK... 43

ÚVOD V dnešní době mají transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE), mezi které patří nejznámější nemoc BSE a scrapie, velký vliv na spotřebitele a konzumenty hovězího i skopového masa. V dřívějších dobách, kdy ještě nebyla problematika těchto nemocí tak medializovaná, vědělo o této chorobě jen pár zasvěcených odborníků. Po rozsáhlé medializaci, zejména v devadesátých letech minulého století, klesla v celé Evropě spotřeba hovězího masa. Všichni dostali strach, že se nakazí. Přitom jsme v České republice měli daleko přísnější podmínky na výrobu masokostní moučky než ve Velké Británii. U nás se vyráběla za tlaku 3 bary (300kPa) a 130 C, po dobu nejméně 20 - ti minut (kvůli zničení tehdy hojného antraxu sněti slezinné), které zlikvidovalo i tehdy neznámé priony. Jinde v Evropě stačila teplota okolo 100 C. Byly zakázány i tzv. domácí zabijačky skotu, a to proto, že některé tkáně (slezina, mícha aj.) patří mezi rizikové a musí se likvidovat jako rizikový materiál. Také by mohlo dojít k potřísnění tkání třeba mozkomíšním mokem, nebo míchou, takže by se riziko přenosu znásobilo. Začal platit i zákaz krmení býložravců masokostní moučkou. Podle zpráv z února letošního roku zvažují poslanci Evropského parlamentu o zrušení zákazu krmení prasat a drůbeže tímto krmivem. A právě moje bakalářská práce je zaměřena na tuto problematiku. 7

1 TSE TSE transmisivní spongiformní encefalopatie (přenosné houbovitě vyhlížející onemocnění mozku), jsou onemocnění člověka i zvířat, vzájemně přenosné z jednoho druhu na jiný druh (například ze skotu na člověka, nebo z ovcí na skot). Mezi nejznámější TSE patří BSE, scrapie, a u lidí Creutzfeldt Jakobova choroba (CJD), a taktéž její nová varianta (vcjd). Tyto nemoci způsobuje tzv. prion (PrpSc). Prion vzniká v těle živočicha z tzv. prionového proteinu (PrpC), který je součástí mnoha bílkovin v těle, například neuronů. Všichni savci mají tedy v těle prionový protein. Tato bílkovina plní důležitou úlohu při udržení běhu našich vnitřních hodin. Prionový protein se tedy podílí na tom, abychom se ráno probudili a večer si šli opět lehnout. (PETR, 2001) V případě onemocnění změní prionový protein svou prostorovou konfiguraci (lidově řečeno zašmodrchá se ). Jeho velmi nepříjemnou vlastností je, že působí jako matrice, podle které se změní prostorová konfigurace dalších prionových proteinů. Prionů díky tomu neustále přibývá, hromadí se v nervové tkáni nemocného zvířete a poškozují ji. Nervové buňky hynou, mizí a na jejich místě vznikají díry a ty dodávají postiženým částem mozku typický houbovitý nebo ementálový vzhled. (PETR, 2001) Mezi další onemocnění patří kuru, Gerstmann Straussler Scheinken syndrome a fatální familiární insomnie (FFI) u lidí, chronic wasting syndrome (CWS) u jelenů. Existuje ale i přenosná encefalopatie norků (mink encefalopathy) a encefalopatie koček. (PETR, 2001) 8

Obrázek č. 1: Vlevo zdravá bílkovina, vpravo zašmodrchaný prion (převzato z www.rozhlas.cz) Obrázek č. 2: Mozková tkáň napadená BSE (převzato z www.rozhlas.cz) 1.1 TSE člověka Mezi TSE člověka patří kuru, GSS, FFI, CJD a vcjd. Všechny tyto choroby jsou smrtelné. 1.1.1 CJD Po první světové válce si německý neurolog Alfons Maria Jakob (1884-1931) všiml podivného onemocnění u starších osob. Pacienty postihl rychlý nástup demence spolu s dalšími příznaky jako je záškub svalů, křeče a jiné poruchy pohybu. Při vyšetření mozku pod mikroskopem viděl mikroskopické dírky, které dávaly mozku vzhled houby. Právě tato pozorování se stala základem pro odborné označení nemoci jako spongiformní encefalopatie. (PETR, 2001) Své výsledky 9

uveřejnil v odborné literatuře v roce 1921. Ve stejné době se v lékařských publikacích objevil popis podobného onemocnění od německého neurologa Hanse Jakoba Creutzfeldta (1885 1964). Jak Jakob, tak i Creutzfeldt popsali nezávisle na sobě 6 případů. Podle jejich objevů dostala choroba název Creutzfeldt Jakobova. Tato nemoc postihuje lidi ve věku okolo 55 let. Charakteristickým znakem jsou počáteční výpadky paměti, k nimž se postupem času přidružují i další symptomy: změny nálady, nezájem o okolní dění, pokles pracovní aktivity, poruchy řeči, vidění, ztráta stability. Onemocnění končí vždy smrtí zhruba po půl roce od objevení se prvních příznaků. Četnost onemocnění je jeden až dva případy na 1 000 000 obyvatel. Jedná se tedy o velice vzácnou chorobu. Cest přenosu CJD je několik. Nejčastější z nich je tzv. sporadická forma, kdy se prionový protein samovolně pozmění na škodlivý prion. Další cestou přenosu jsou lékařské zákroky nebo léčení některých chorob, jako je například léčba poruchy růstu (zaznamenáno 75 případů), transplantace tvrdé pleny mozkové od mrtvých pacientů (registrováno 25 případů), nebo transplantace oční rohovky od pacienta nakaženého klasickou CJD. Tato forma se označuje jako iatrogenní. (PETR, 2001) 1.1.2 Nová varianta CJD (vcjd) První obětí této choroby se stal v roce 1995 Stephen Churchill z Velké Británie. Když zemřel, bylo mu 20 let. Při podrobnějším vyšetření se zjistilo, že jeho onemocnění se liší od klasické CJD. Ta postihuje vzácně i lidi, kteří nejsou starší 40 - ti let. Tito nemocní však tvoří jen 5% případů. V březnu roku 1996 byl ve Velké Británii hlášen výskyt deseti případů nové klinicko patologické varianty CJD (vcjd). (PETR, 2001) Shoda s epidemií BSE svědčila o možnosti vztahu mezi oběma onemocněními. Následně byly shromážděny důkazy, které tuto hypotézu podporují: 1. makakům, kterým byl do mozku naočkován materiál z mozku skotu uhynulého na BSE, byly pozorovány neuropatologické nálezy, které byly podobné nálezům lidí s vcjd 2. bylo prokázáno, že transgenní myši (myši, které mají pouze humánní gen prionové bílkoviny) jsou vůči BSE vnímavé 10

3. charakteristiky biologického kmene agens vcjd (definované podle přenosových charakteristik u inbreedních kmenů myší) a molekulárního kmene (definovaného podle typu prionové bílkoviny) jsou velmi podobné těm, které jsou pozorovány u zvířat, která se nakazila BSE ať už byla infikována experimentálně, nebo se nakazila přirozenou cestou - liší se však od charakteristik, které byly zjištěny u sporadických případů CJD). (POLANECKÝ, 2000) Protože panují dohady o délce inkubační doby, a také neznáme velikost lidské populace Velké Británie, která byla vystavena BSE a je vůči ní vnímavá, není možné odhadnout, jaký počet lidí bude v budoucnosti vystaven vcjd. (POLANECKÝ, 2000) Možné budoucí následky onemocnění CJD v lidské populaci byly proto projednávány na mezinárodní konferenci WHO v květnu roku 1996. Tam bylo také navrženo, aby byl ustanoven celosvětový dohled nad touto chorobou. Hlavním cílem WHO je zjištění výskytu případů vcjd. Dosažení tohoto cíle je možné nejlépe dosáhnout sledováním všech forem CJD, a to z těchto důvodů: 1. klinické příznaky vcjd se někdy nemusí lišit od příznaků jiných forem CJD. 2. zkušenostmi, které se získávají při identifikaci případů CJD by měly zvýšit schopnosti detekovat případy vcjd. (POLANECKÝ, 2000) Nová varianta má odlišné příznaky od klasické CJD. Jsou to například usazeniny fluoru v mozku, rozdíl v EEG. A hlavně pomalý průběh nemoci. Tabulka č. 1: Počty vcjd ve Velké Británii Rok Sporadická CJD vcjd 1995 35 3 1996 49 10 1997 59 10 1998 63 18 1999 61 15 2000 48 28 2001 52 20 (převzato z www.svscr.cz) 11

1.1.3 Kuru Sestupovali jsme podél potoka k vesnici Amusi. Když jsme procházeli kolem jednoho stavení, všiml jsem si malé holčičky, která seděla u ohně. Silně se třásla a trhala hlavou ze strany na stranu. Řekli mi, že je to oběť zlého kouzla. Bude se prý takhle třást ještě několik týdnů, nebude schopna se najíst a nakonec umře, cituje ve své knize Jaroslav Petr slova australského úředníka J. R. MacArthura, který pomáhal v Nové Guinei s budováním státní správy. (PETR, 2001) Na území kmene Fore narážel i na jiné lidi, které postihla tato neobvyklá nemoc. Nejprve se třásli, potom ochrnuli a zemřeli. V kmeni měli pro tuto nemoc název kuru, což v jejich jazyce znamená třas a smrtelné uřknutí (Foreové věřili, že je kuru důsledek černé magie). Lékař Vincent Zigas, pod jehož zdravotní péči spadal i kmen Fore, na základě svých výzkumů zjistil, že se kuru vyskytuje jen v tomto kmeni. Zkoušel různé léčebné postupy od polykání vitamínů, antibiotik, ale nic nezabíralo. Takže usoudil, že příčinou onemocnění je hysterie (lidé uvěřili zásahu černé magie a příznaky si vsugerovali). Obrázek č. 3: Příslušníci kmene Fore postižení chorobou kuru (převzato z www.osel.cz) Co nemoc způsobuje, rozluštil až v roce 1957 potomek slovenských přistěhovalců Carleton Gajdusek. Náhoda ho přivedla na myšlenku, že je kuru spojeno s kanibalismem, který byl v kmeni velmi hojný. Když odjel s výsledky do laboratoře v Melbourne, opět mu pomohla náhoda v podobě veterináře Williama Hadlowa, který se zabýval scrapií. Ten pod mikroskopem porovnával vzorky ovcí se scrapií a lidí s kuru, a zarazila ho nápadná shoda vzorků. Navrhl tedy Gajdusekovi, ať naočkuje vzorek pokusným zvířatům. Gajdusek si vybral šimpanze. 12

Teprve za dva roky se u šimpanzů projevily příznaky kuru. Gajdusek pojmenoval původce způsobující kuru jako pomalý virus, protože nástup choroby od projevení se prvních příznaků byl velmi pomalý. Tato teorie byla, jak se později ukázalo, mylná, ale i přesto dostal v roce 1976 Gajdusek Nobelovu cenu za objev infekční povahy prionového onemocnění kuru. Obrázek č. 4: Daniel Carleton Gajdusek (převzato z www.wellesley.edu) Obrázek č. 5: Mapa Papui Nové Guinei, ve které se vyskytlo kuru (převzato z www.osel.cz) 1.1.4 Gerstmann Straussler Scheinker syndrom (GSS) Nemoc byla popsána v roce 1936 třemi německými lékaři, po kterých dostala i své jméno. Projevuje se demencí a ztrátou pohyblivosti. Postupuje velmi pomalu. Je vyvolána poškozením genu pro prionový protein hned na několika místech. Zašmodrchaný prionový protein poškozuje především mozeček, tedy část mozku, řídícího kromě jiného i pohyb. (PETR, 2001) 13

1.1.5 Fatální familiární insomnie (FFI) Popsána byla v roce 1886. Je vyvolána poškozením genu pro prionový protein stejně jako GSS. Poškozený prionový protein se hromadí v thalamu, který se podílí na různých řídících funkcích. Postižení lidé neztrácí své duševní schopnosti, ale trpí pohybovými a hormonálními poruchami a mají narušený spánek. 1.2 TSE zvířat 1.2.1 Scrapie Česky klusavka. První zmínka o scrapii je z roku 1732 z Francie. Postihuje ovce, méně kozy. Scrapie (z angličtiny scrape škrábat se). Inkubační doba je 2 5 let. Mezi příznaky patří: na počátku plachost, hubnutí, vypadávání a vykusování vlny, později se přidávají poruchy koordinace pohybu, obrna a ochrnutí končetin. Oproti BSE, kde ve svalovině ani v mléce nebyly prokázány priony, jsou u klusavky infekční všechny orgány i tkáně. U březích ovcí se v důsledku vertikálního přenosu prionů tyto bílkoviny šíří navíc do plodových vod a obalů. Proto se narodí již infikované jehně a ostatní ovce se mohou nakazit pozřením infikované placenty. (COJECO, 2000) Opatření jsou podobná jako u BSE likvidace rizikových orgánů mozek, mícha, střevo, slezina, mandle. V České republice se prokázala scrapie v lednu roku 2008 v Libereckém kraji. Nebyl dosud popsán případ, že by klusavka byla přenosná na člověka. (COJECO, 2000) Obrázek č. 6: Ovce stižená scrapií (převzato z www.avma.org) 1.2.2 CWD CWD Chronic wasting disease (někdy se uvádí i CWS chronic wasting syndrome). Jedná se o prionovou chorobu jelenovité zvěře (chronické chřadnutí 14

jelenovitých). Toto onemocnění bylo prvně popsáno v roce 1967 u jelence ušatého (Odocoileus hemionus) v USA, a to konkrétně ve státě Colorado. Vnímavé druhy jsou: jelenec ušatý (Odocoileus hemionus), jelenec běloocasý (Odocoileus virginianus), los aljašský (Alces alces shirasi) a jelen lesní (Cervus elaphus). (STÁTNÍ VETERINÁRNÍ SPRÁVA ČESKÉ REPUBLIKY, 2010) CWD není přenosná na člověka a má jako jiné prionové choroby fatální průběh. Mezi příznaky patří ztráta plachosti, poruchy pohybu a koordinace pohybu, zvýšený příjem vody, a zvýšená salivace. Úhyn nastává 2-3 měsíce po propuknutí onemocnění. SVS ČR vydala směrnici na odběr vzorků jelena lesního a jelence běloocasého, jako vnímavých druhů na CWD. Monitoring byl zaměřen zejména na uhynulá, utracená, klinicky nemocná zvířata, zvířata poražena při autonehodách a zdravá poražená nebo zastřelená zvířata starší 18 měsíců věku. Z těchto zvířat byla jako vzorek pro vyšetření odebírána prodloužená mícha (obex), a následně byly tyto vzorky vyšetřeny pomocí rychlých imunologických testů (Rapid test) ve státních veterinárních ústavech. Celkově bylo v České republice vyšetřeno 733 zvířat z volně žijící populace a také z farmově chovaných stád. U žádného z nich nebyl zjištěn pozitivní výsledek. Obdobný výsledek monitoringu byl zaznamenán i v ostatních členských státech Evropské unie, které se tohoto monitoringu zúčastnily. Bylo vyšetřeno několik tisíc vzorků prodloužené míchy jelena lesního, jelence běloocasého nebo losa (ve Skandinávii) a nebyl zaznamenán ani jeden pozitivní případ na onemocnění CWD, a proto lze konstatovat, že se v Evropě toto onemocnění zatím nevyskytuje. (STÁTNÍ VETERINÁRNÍ SPRÁVA ČESKÉ REPUBLIKY, 2010) 15

Obrázek č. 7: Rozšíření CWD v severní Americe (převzato z www.avma.org) Tabulka č. 2: Přehled o počtu vyšetřených zvířat na CWD v České republice Jelen lesní (Cervus elaphus) a jelenec Rok běloocasý (Odocoileus virginianus) farmový chov volně žijící Pozitivní pří- pad CWD 2007 23 579 0 2008 37 81 0 2009 9 4 0 Celkem 69 664 0 16

1.2.3 BSE Tato choroba bude rozsáhleji popsána v další kapitole. Zde uvádím jen důležitá data týkající se BSE. 1.2.4 Důležitá data o BSE V roce 1982 Stanley Prusiner izoloval prion, a o tři roky později byly zaznamenány první případy BSE ve Velké Británii. V roce 1986 byla poprvé popsána BSE. Článek byl publikován v britském veterinárním časopise Veterinary Record, ve kterém byla poprvé uveřejněna zkratka BSE (bovinní spongiformní encefalopatie). V témže roce bylo diagnostikováno dalších 15 případů z různých částí Anglie. V roce 1988 bylo zaznamenáno dalších 2184 kusů nakažených BSE. V dalších letech nemocných zvířat rychle přibývalo. Růst kulminoval v roce 1992. Údaje o počtu zjištěných případů BSE během období 1992-2000 potvrzují, že v celé Evropské unii a Švýcarsku dochází od roku 1996 k postupnému ubývání případů. V roce 2000 se počet nových případů snížil oproti roku 1999 o 821 (tj. o 31 %) na 1 830. Během tohoto roku bylo potvrzeno 182 488 případů, z toho 179 441 (98,3 %) ve Velké Británii. V tomto roce tedy klesl počet nově zjištěných případů BSE v této zemi o 42,5 %. Do roku 2003 bylo v Británii přes 170 000 případů BSE u skotu ve více než 34 000 zemědělských podnicích. Od tohoto data se počet případů BSE snižuje. 17

Obrázek č. 8: Počet potvrzených případů BSE u dobytka ve Velké Británii (převzato z www.vesmir.cz) 2 BSE Bovinní spongiformní encefalopatie. Do češtiny bychom toto onemocnění mohli přeložit jako houbovitě vyhlížející onemocnění mozku. Obrázek č. 9: Porovnání zdravé mozkové tkáně pod mikroskopem ve srovnání s tkání postiženou kuru, klasickou formou CJD a scrapií (převzato z www.learn.genetics.utah.edu) 18

2.1 Co je BSE? BSE je nervové onemocnění skotu, které způsobuje prion (název prion byl odvozen z anglického protein infectious dotvořeno přesmyčkou). Původně to měl být proin, jelikož se jedná o složeninu obou slov, ale slovo proin se Stanleymu Prusinerovi nelíbilo, prion zněl mnohem lépe. (WIKIPEDIE, 2011) 2.2 Příčina vzniku BSE S největší pravděpodobností se hovězí dobytek nakazil pomocí masokostní moučky vyrobené z ovcí, které uhynuly na scrapii. Tato teorie je ze všech nejpravděpodobnější, a je také vědecky podložená. Protože se odvětví lékařství a genetiky neustále zdokonaluje a uvádí se nové a nové postupy, není vyloučeno, že se s postupem času dočkáme jiné teorie, která bude ta správná. To ovšem neznamená, že je tato teorie špatná, může být jen jakýmsi klíčem k dalšímu poznání. Teorií, ať už více či méně pravdivých je ale větší množství, některé jsou už opravdu tak bizarní, že si myslím, že je lidé vymysleli proto, aby byli zajímaví, a mluvilo se o nich. 2.2.1 Odkud se vzaly priony? Na tuto otázku existuje mnoho teorií, vědecky podložených i bizarních. Jediné, na čem se vědci shodují, je, že se priony dostaly do těla skotu po krmení masokostní moučkou z těl ovcí, které uhynuly na scrapii. Masokostní moučka se zkrmovala skotu mnohem dříve, než se objevila BSE, a žádné zvíře se nenakazilo. Přenos způsobila pravděpodobně ekonomická krize v 70. letech minulého století, kdy se šetřilo všude, tudíž i ve výrobě této krmné směsi. V této době se snížila teplota výroby, a to mohlo způsobit, že priony, které byly do té doby bezpečně likvidovány (i když se o nich samozřejmě nevědělo), přežily a způsobily BSE. Další názor je takový, že se priony sice dostaly ke skotu pomocí masokostní moučky, ale nebyly to ovčí priony, nýbrž priony skotu. Zastánci této teorie předpokládají, že se mohly priony vytvořit v těle skotu spontánně mutací (to by bylo možné), a že tyto krávy, když uhynuly, posloužily výrobě masokostní moučky, priony odolaly a nakazily se tak další krávy. Zastánci této teorie ale nevěří, že se BSE rozšířila kvůli tomu, že byl změněn technologický postup ve výrobě této krmné směsi. Zastávají názor, že 19

priony přežijí téměř vše, a že i před krizí byly ovčí priony v masokostní moučce přítomny, ale nedělo se nic, protože se skot nemohl ovčími priony nakazit. Tato teorie se zamlouvala mnohým představitelům tehdejší britské vlády. Antilopí teorie: Tým vědců z Nového Zélandu vedený Rogerem Morrisem je přesvědčen, že zdroj prionů je potřeba hledat někde jinde, a to až v Africe. Morris podrobil údaje o šíření BSE v Británii analýze pomocí nejnovějších počítačových modelů. Pokaždé mu vycházela jako nejpravděpodobnější zdroj prionů divoká zvířata a nikoli ovce nakažené scrapií a krávy stižené mutací. (PETR, 2001) Jako ideální kandidáti mu vyšly antilopy, které byly do Británie dovezeny v 70. letech a měly prionovou chorobu. Když tyto antilopy uhynuly, nikdo se nad tím nepozastavil. Předpokládalo se, že se jen neadaptovaly na evropské klima, a možná proto se po příčině úhynu důkladně nepátralo. Pak se z části jejich těl vyrobila masokostní moučka, která byla dodána skotu, a ten se poté nakazil BSE. Existují ale i mnohem bizarnější teorie. Některé z nich dokonce odmítají, že by BSE způsobovaly priony. Zde uvádím některé z nich: Orgánofosfátová teorie: Podle anglického farmáře Marka Purdeyho způsobili BSE výrobci pesticidů. Podle něj se pesticidy dostaly do míchy skotu díky střečkům, kteří kladli svá vajíčka na jejich hřbet. Také tvrdil, že se s podáváním pesticidů dostalo do zvířete velké množství manganu, a tím bylo narušeno vnitřní prostředí organismu. U zdravých zvířat se prionový protein váže na ionty mědi, u nemocných se naváže na mangan a tím se naruší jeho klasické prostorové uspořádání. Někteří zastánci tvrdí, že za vším stojí výrobci pesticidů, kteří se snaží ututlat svoji vinu. Tato teorie se však zdá přitažená za vlasy, protože proč by státy vynakládaly tolik prostředků na boj s BSE a zároveň kryly tyto velkovýrobce? Další teorie mluví o BSE jako o autoimunitním onemocnění, kdy imunitní systém nerozezná rozdíl mezi vlastní somatickou buňkou a cizím agens, a tím zničí vlastní tkáně. Tato teorie by byla i možná, jenže je tu otázka, co by donutilo imunitní systém k tomu, aby začal ničit sám sebe? Byl by to nějaký podnět zvenčí (třeba záření), nebo by to byl stres či nemoc, co by zapůsobilo jako spouštěč? (PETR, 2001) Řepková teorie: Tato teorie je poněkud rozdvojená, a zní takto: z řepky po vylisování oleje zůstanou výlisky, které se zkrmují. Tyto výlisky obsahují velké 20

množství selenu, který postihuje nervové buňky. BSE by mohla být tedy způsobena otravou selenem. Druhá část teorie zní, že skotu neškodí tolik zvýšení hladiny selenu, jako jeho následný pokles, když se přestane krmit řepkovými krmivy. Skot by tedy trpěl abstinenčními příznaky, jelikož by byl zvyklý na vysoké dávky selenu. Dalšími bizarními teoriemi jsou například mimozemský původ prionů, fononová teorie, nebo zahlcení organismu bílkovinou. (PETR, 2001) Můj osobní názor na vznik různých teorií je, že se většina lidí snaží přiživit na kauze BSE a tím si užít svých 15 minut slávy. Teorie sice může stát na reálných základech, ale její rozvinutí je už většinou přitažené za vlasy. 2.2.2 Příznaky BSE má dlouhou inkubační dobu 3-6 let, délka je 2 6 týdnů. Onemocnění vždy končí smrtí. Začátky onemocnění nejsou výrazné, projevuje se neklid zvířete, podráždění, lekavost, abnormální chování záchvaty zuřivosti, napadání jiných zvířat, pocity strachu. 2.2.3 Fáze nemoci Nemoc probíhá ve dvou fázích: 1. fáze tzv. prodromální stádium - priony jsou v těle nakaženého zvířete, ale ještě se nestihly namnožit. Zvíře normálně žere, ale i tak hubne, zhoršuje se laktace. Později se začínají projevovat nervové poruchy a odchylky v chování. 2. fáze klinicko manifestační stádium trvá asi půl roku. U zvířete už se projevuje postižení centrální nervové soustavy, straní se skupiny, trpí zvýšenou lekavostí, dráždivostí a zuřivostí. Období klidu a projevů nemoci se může střídat. Dále jsou patrné psychomotorické projevy zvíře stojí nakřivo, má rozkročený postoj a kymácivou a strnulou chůzi. Další příznaky jsou nepřirozené zvuky, a skřípání zubů. Později dojde k paralýze a zvíře umírá. (MILUCHOVÁ, 2007) 2.3 Pozitivní případy v ČR První případ byl diagnostikován v roce 2001 v malé vísce jménem Dušejov, která se nachází na Jihlavsku. Byl udělán i kontrolní test, který pozitivní výsledek potvrdil. Aby byl výsledek průkazný, odeslaly se materiály do německého 21

Tübingenu. Ve zdejších laboratořích rovněž prokázali tuto nákazu. Kvůli BSE bylo v Dušejově poraženo 134 kusů krav, které byly následně testovány. Všechny výsledky byly negativní, BSE měla jen kráva, která byla utracena nejdříve. Utrácí se tzv. kohorta vrstevnic, to znamená, že krávy, které se narodily ve stejném období jako kráva nemocná, se dohledají (mohou být totiž i v jiném zemědělském podniku) a utratí. Tyto krávy jsou o rok starší nebo mladší než postižený kus. Jelikož existuje povinnost chovatele každý nově narozený kus evidovat, není dohledání tak složité. Do roku 2011 bylo v České republice prokázáno 30 případů BSE, testováno bylo 1 666 854 kusů skotu. Testovaných kusů bylo velké množství, přičemž bylo zjištěno jen 30 pozitivních případů. Takže šance, že zrovna vaše kráva bude mít BSE je 1:55 000. Tabulka č. 3: Přehled o počtu vyšetřených zvířat na TSE v České republice Pozitivní Pozitivní Pozitivní Rok Skot případy BSE Ovce případy TSE u ovcí Kozy případy TSE u koz 2001 114 146 2 2002 175 435 2 1 155 16 102 0 2003 210 456 4 2 970 12 274 0 2004 200 873 7 1 063 9 86 0 2005 170 857 8 447 1 216 0 2006 174 470 3 1 097 0 113 0 2007 160 420 2 2 839 1 163 0 2008 157 270 0 994 16 328 0 2009 156 472 2 582 0 172 0 2010 146 455 0 726 0 150 0 Celkem 1 666 854 30 11 873 55 1 604 0 (převzato z www.svscr.cz) 22

Obrázek č. 10: Mapa pozitivních nálezů BSE v České republice (převzato z www.svscr.cz) 2.4 Opatření v České republice Monitorování BSE začalo v roce 1991, kdy byla založena Národní referenční laboratoř pro TSE. Vyšetřovala se ale jen zvířata, která měla příznaky nervového onemocnění. Vyšetření bylo prováděno histologicky. Na konci roku 2000 bylo zahájeno vyšetření zdravých kusů. V České republice se testuje metodou Western Blot. Vyšetření provádějí SVÚ Jihlava a Praha, později k nim přibyl ještě SVÚ Olomouc. Na BSE se vyšetřuje skot starší 30 měsíců při normální porážce. Při nucené porážce se věk skotu snižuje na 24 měsíců. Dále se musí vyšetřit všechna zvířata poražená mimo jatka, uhynulá a utracená zvířata, zvířata podezřelá z nákazy BSE a zvířata, která byla utracena v důsledku nákazy BSE v chovu. Všechna tato zvířata musí mít minimálně 24 měsíců. Navíc je stále platný zákaz používání masokostní moučky pro krmení přežvýkavců. A na jatkách se odstraňuje tzv. specifický rizikový materiál (SRM), což jsou mandle, lebka, mícha přežvýkavců starší 12 měsíců, dále ileum (kyčelník) skotu staršího 12 měsíců, a slezina ovcí a koz. Toto nařízení platí od 1. října 2000. 23

2.5 Opatření v Evropské unii Evropská unie používá obdobná opatření jako Česká republika. Ve všech členských státech EU odstraňují jatky a asanační ústavy tento specifický rizikový materiál: lebku (včetně mozku a očí), tonzily, míchu a ileum (kyčelník) skotu staršího 12 měsíců, lebku (včetně mozku a očí), tonzily a míchu ovcí a koz starších 12 měsíců, a slezinu ovcí a koz všech věkových kategorií. 2.6 Testování BSE Testování se v ČR i EU provádí metodou Western Blot od firmy Prionics Check. Tato metoda je založena na detekci určitého proteinu ve směsi různých proteinů. Pojmenování metody vzniklo jako analogie k metodě Southern Blot, která byla vyvinuta k detekci DNA. Později byla upravena k detekci RNA a pojmenována jako Northern Blot. Analogický postup pro přenos proteinů byl proto nazván Western Blot. (WIKIPEDIE, 2011) Princip a postup metody Western Blot: 1. Elektroforéza předchází vlastnímu western blotu, nejčastěji jde o SDS - PAGE elektroforézu. (WESTERN BLOT, 2011) Vzorkem může být směs proteinů, nebo může jít o vzorek tkáně, který musíme napřed zhomogenizovat, než jej naneseme na gel. Tyto vzorky se pak označují jako lyzáty (vznikly lýzou buněk a přitom se uvolnily proteiny). Obrázek č. 11: Princip elektroforézy (převzato z www.klouda.webpark.cz) 2. Blotování proteiny se z gelu musí přenést na membránu, která je nejčastěji celulózová. Přístroj je řešen jako systém anoda katody. Na anodu se položí papír, který se namočí do pufru, na něj se dá membrána, gel a poté znova namočený papír. Následně se dá připravený vzorek do přístroje reagovat. 24

3. Reakce proteinu s protilátkou membrána se nechá inkubovat s látkou, která zamezí navázání proteinu na membránu. Poté se přidá látka, která s proteinem specificky reaguje. Necháme je spolu inkubovat a přidáme sekundární protilátku, která je označena. 4. Vyvolání blotu a výsledek peroxidasa je použita ve spojení s chemiluminiscenční látkou. Luminiscence je v místech, kde se primární protilátka navázala na hledaný protein. Jako každá metoda má i tato své klady a zápory. Kladem je jednoduchá identifikace proteinu. Záporem je mít primární protilátku, na kterou se protein naváže. I pořizovací cena přístroje není zrovna nízká, takže blotování je záležitostí větších firem nebo univerzit. 3 SCRAPIE Scrapie patří stejně jako BSE mezi transmisivní spongiformní encefalopatie. Byla poprvé pozorována ve Velké Británii u ovcí v roce 1732. Scrapie u koz byla diagnostikována až ve 40. letech minulého století. 3.1 Co je scrapie? Je to chronické, smrtelně probíhající onemocnění ovcí a koz, které způsobují priony, jež změní svoji prostorovou konfiguraci (lidově řečeno zašmodrchají se ). České pojmenování klusavka vzniklo podle jednoho z příznaků ovce při klusu vysoko zvedají nohy. Scrapie se vyskytuje zejména u ovcí ve věku 2-5 let. Mezi příznaky patří úporné drbání a škrábání se (ovce má na některých místech vykousanou vlnu), následují změny chování otupělost, agresivita, nervozita. Jsou patrné i změny postoje, třes hlavy, špatná koordinace pohybu, klopýtání, ochablost pánevních končetin, neschopnost stát. Později zvíře výrazně hubne a uhyne. Léčba v současné době neexistuje. Diagnostika se provádí stejně jako u BSE posmrtným vyšetřením. U klusavky jsou na rozdíl od BSE infekční všechny tkáně. Dokonce je prokázán i vertikální přenos z bahnice na jehně, takže se další ovce mohou nakazit, sežerou li infikovanou placentu. Geneticky vnímavá k tomuto onemocnění jsou zejména plemena Suffolk a Hampshire. Proto se u těchto plemen využívá tzv. 25

genotypizace, kterou se stanoví genotyp prionového proteinu a vnímaví jedinci se vyřadí z chovu. 3.2 Příčiny vzniku scrapie Pravděpodobnou příčinou je mutace ovčího prionového proteinu. Po úhynu ovce bylo její tělo dáno do kafilérie a zpracováno na masokostní moučku, přičemž nemusely být priony zcela zničeny a dál infikovaly jiné ovce, kterým se masokostní moučka zkrmovala. 3.3 Testování scrapie Testování probíhá stejně jako u BSE metodou Western Blot. Začátkem 60. let minulého století byl proveden první laboratorní přenos na myši to umožnilo detailnější studium TSE. (BELAY, 2001) 3.4 Opatření v České republice Specifický rizikový materiál (SRM) u ovcí je: lebka (včetně mozku a očí), mícha a mandle zvířat starších 12 měsíců, a slezina a kyčelník (ileum) zvířat všech věkových kategorií. Na základě vyhlášky č. 286/1999, je již od 1. 1. 2000 odstraňován specifický rizikový materiál z potravinového řetězce. SRM se odstraňuje na jatkách a k úplné likvidaci dochází v kafilériích. Již od 60. let minulého století platí v ČR přísné parametry na zpracování těl uhynulých zvířat na masokostní moučku. Tyto parametry byly 130-140 C, při tlaku 3 bary po dobu 3 minut. Bylo to kvůli nákaze snětí slezinnou (antrax). O prionech se tehdy samozřejmě nevědělo. Dne 30. 9. 1996 rozhodla Ústřední nákazová komise o sjednocení parametrů v souladu s nařízením Evropské unie, a od tohoto data jsou parametry nastaveny takto: teplota 133 C, tlak 3 bary, doba trvání 20 minut. Od roku 1991 je v ČR zákaz krmení přežvýkavců masokostní moučkou. Toto nařízení bylo později rozšířeno na úplný zákaz krmení masokostní moučky všem přežvýkavcům. 26

Dále se na základě zákona o krmivech č. 91/1996, ve znění pozdějších předpisů uskutečňuje kontrola mícháren a výroben, aby nedošlo ke kontaminaci krmiv. 3.5 Opatření v Evropské unii Výrazněji se neliší od opatření v ČR. Patří tam také odstraňování SRM a zákaz zkrmování masokostní moučky. V Evropské unii platí stejné podmínky při zpracování masokostní moučky jako v České republice. 4 GENETICKÉ TESTOVÁNÍ BSE A SCRAPIE DNA a genetické testy jsou základními nástroji pro vymýcení klusavky. Genetická predispozice pro ovčí scrapii je založena na malých rozdílech v peptidové sekvenci pro prionový protein. (HEATON, 2010) Prionový protein je infekční, když se přemění jeho běžné membránové proteiny na infekční patologický konformační izomer, nazývaný PrPSc, který má jinou třírozměrnou strukturu (3D). (ATKINSON, 2005) Tato vlastnost má z molekulárního hlediska zásadní význam pro rozpoznání TSE. Všechny TSE jsou infekční a mohou být přeneseny především z potravin (Creutzfeldt Jakobova choroba), mohou vzniknout i dědičnou mutací v PrPC (10 15%), nebo z neznámých důvodů (cca 85%). U některých by se mohlo jednat o nově zjištěnou mutaci. (ATKINSON, 2005) Zatím sice nebyla pozorována, ale i u zvířat by mohlo dojít, stejně jako je tomu u lidí, ke vzniku nové sporadické formy onemocnění. Proto je literatura se sporadickým výskytem podrobněji studována, i když se zatím tento výskyt objevil jen u lidí. Sledování TSE se provádí pomocí mezinárodní metody nazvané Imunoblot, ve stavu post mortem. Bohužel neexistuje žádná metoda, která by umožňovala vyšetření u živých zvířat. (ATKINSON, 2005) Gen způsobující náchylnost k experimentální scrapii se nachází na chromozomu 2. Dvě alely PRNP (PRNPa a PRNPb) kódují odlišné PRPS, které se liší u aminokyselin 108 (leucin a fenylalanin) a 189 (threonin a valin). (WESTAWAY, 1995) Inkubační doba je závislá na izolovaném prionu a kmeni, který je naočkován. 27

S některými izoláty, jako je kmen Rocky Mountain Laboratories (RML), je PRNb alela kodominantní s prodlouženou inkubační dobou u klusavky, zatímco alela A22 má u myší delší inkubační dobu. Obrázek č. 12: Šíření kmenů scrapie je závislé na sekvenci aminokyselin (převzato z www.sciencedirect.com) V USA již od roku 1952 pracují na úplném vymýcení klusavky. Existují na to i dva programy: Národní program vymýcení klusavky (NSEP the National Scrapie Eracation Program) a Certifikační program stád scrapie (SFCP Cand the Scrapie Certification Program), které spolupracují na vymýcení klusavky z ovčích a kozích stád. (APHIS, 2009) NSEP je povinný a založený na podávání zpráv o zvířatech až do jejich původních stád, kde se narodila. Naopak SFCP, který byl založen v roce 1992, je program dobrovolný. (APHIS, 2009) Přírodní klusavka u ovcí a koz je známá dlouhodobě, ale o mechanismu jejího šíření se dlouho diskutovalo. Experimentální přenos scrapie ovcí na laboratorní hlodavce umožňuje vědcům zkoumat neobvyklou povahu prionu a řešit, jakým způsobem dochází k přenosu. (WESTAWAY, 1995) V následné biochemické studii byla identifikována protein rezistentní proteáza o molekulové hmotnosti 27-30 kda, která byla označena jako PrP 27-30. Genetická analýza poukazuje na to, že je PrPSc hlavní, a možná jediná varianta 28

prionu. (WESTAWAY, 1995) Izolací klonované DNA (cdna) bylo zjištěno, že PrP 27-30 je odvozen od PrPSc, a že oba u nakažených i zdravých zvířat vyjadřují souvislost s glykolipidem, bílkovinou PrPC. Abnormální prionový protein je částečně odolný vůči trávení proteinázy (PrPres). (LÉZMI, 2004) Všechny vzorky, které jsou hodnoceny, jsou ovlivněny tím, jak dlouho po smrti zvířete byly sesbírány. Vzhledem k hospodářské důležitosti vznikly obavy, že spolehlivost testů na TSE bude horší, pokud bude horší kvalita tkáně. Silně rozložená nervová tkáň nemůže být vyhodnocena imunohistochemicky ani histologicky, protože je narušena tkáňová struktura. Autolýza neovlivňuje testy, které detekují proteinázu, rezistentní patogenní izoformu proteinového genu PrPres. Je předpokládáno, že dlouhodobé působení tepla může mít větší vliv, než bylo původně bráno v úvahu. (TRIANTIS, 2007) Western Blot metoda a metoda specifických protilátek je směřována na základní globulární doménu prionového proteinu. Tři úlomky je možné oddělit podle relativní molekulové hmotnosti odpovídající diglykosylové, monoglykosylové a neglykosylové PrPres. U ovcí experimentálně infikovaných BSE byly nalezeny vysoké úrovně diglykosilované PrPres. Zvířata nakažená klasickou BSE a klusavkou je nyní možné odlišit podle různě velkých glykoforem PpPres (PrPres). U některých studií byla zjištěna možnost nižší hmotnosti u vcjd na rozdíl od jiných forem CJD. Toto bylo také zjištěno u ovcí, experimentálně nakažených BSE, když bylo provedeno srovnání s ovcemi nakaženými klusavkou. U imunohistochemických přístupů sloužících ke zjištění BSE bylo dosaženo toho, že charakterizuje epitopy v abnormálním prionovém proteinu, také v neuronech a fagocytárních buňkách, lymforetikulárním systému a mozku. (LÉZMI, 2004) Pomocí různých specifických peptidových protilátek, namířených na PK štěpení oblasti PrP, byla rozsáhlejší hydrolýza odhalena v těle makrofágů (TBMs), lymfatické tkáni a mozku ovcí experimentálně nakažených BSE. Tyto výzkumy naznačují, že PrPres u zvířat, nebo lidí, kteří se nakazili BSE je více citlivé na zacházení než PrPres u zvířat nakažených scrapií. Větší část N-terminální sekvence PrPres je odstraněna proteolytickou úpravou a vede ke ztrátě epitopů. (LÉZMI, 2004) 29

Definování rozdílu mezi PrPC a PrPSc mají zásadní význam pro replikaci prionů. Byly vyloučeny možnosti, že všechny izoformy proteinového genu jsou důsledkem proteinového sestřihu. Genů, které kódují prionový protein, je nejvíce v pěti vedlejších skupinách kódujících exonů. (WESTAWAY, 1995) Byla provedena i studie zkušebních metod, která prokazovala neexistenci rozdílů v genetické výbavě bahnic s různými genotypy PrP. Byly analyzovány genetické hodnoty zejména pro produkci mléka u alely ARR. Genotypizace byla provedena na 204 bahnicích plemena Lacaune. Bahnicím byly odebrány vzorky v horní a dolní polovině ocasu pro odhad plemenné hodnoty (EBV). (PARADA, 2007) Populace plemene Lacaune, která byla použita k této studii, se nachází v severní části Navarry (Španělsko) a čítá 4000 ovcí. Tato populace je také zařazena do španělského výzkumného projektu zaměřeného na charakterizaci PrP genu u různých plemen ovcí. Většina plemen zapojených do projektu byla místní masomléčná plemena. Lacaune je sice plemeno francouzské, ale je do této studie zahrnuto kvůli významnému zastoupení ve španělském mléčném průmyslu. V současné době je 50% plemen mléčných ovcí ve Španělsku zahraničního původu, nebo se jedná o křížence. Zvířata, kterým byly odebrány vzorky, byla rozdělena do dvou skupin podle nejlepší plemenné hodnoty (B-EBV) a nejhorší (W- EBV). Genetické programy založené na návaznosti genotypu klusavky a prionového proteinu probíhají v několika zemích. V Evropské unii jsou PrP genotypy určeny s odkazem na aminokyseliny na kodonu 136, 154 a 171 prionového genu. Nalezené genotypy byly rozčleněny do 5 skupin podle náchylnosti na scrapii. Toto rozdělení bylo vytvořeno pro NSP národní program pro scrapii (National Scrapie Plan). Tento systém klasifikace byl použit i ve Velké Británii. Tyto programy jsou důležité proto, že zvýhodňují výběr z nejodolnějších genotypů a mají dopady na produkci. (PARADA, 2007) Epidemiologie klusavky, která vznikla přirozeným způsobem, má podobný mechanismus jako bodové mutace nesoucí v lidském kódování PrP gen (PRNP), který může způsobit familiární prionové choroby u lidí, však nebyl dosud zaznamenán u přirozené klusavky ovcí. (WESTAWAY, 1995) Prusiner a jeho kolegové zjistili, že prion odolává mnohým inaktivačním postupům, které mění nukleové kyseliny a proto mohou být bez detekovatelné DNA. (COLLEE, 2006) 30

O prionu je také známo, že je velmi malý a prochází malými pórovými filtry, je pozoruhodně tepelně stabilní a odolný vůči širokému rozsahu chemických látek včetně formaldehydu při testování v surové směsi homogenátu z mozku. Přes tyto vlastnosti byly vymyšleny účinné fyzikální a chemické metody, které jsou používané v nemocnicích a pitevnách. (COLLEE, 2006) Glykoprotein, který je součástí všech membrán u člověka i u savců, je označen jako PrPC (celulární). Písmeno C vyjadřuje normální formu proteinu vyjádřeného v mnoha typech buněk, zejména buněk mozku. Abnormální forma je označena jako PrPSc Sc kvůli tomu, že byl původně spojen se scrapií ovcí, ale dnes je všeobecně používán u všech TSE. Epidemická situace BSE a dalších spongiformních encefalopatií v důsledku dopadu na zdravotní stav lidí ještě zdůraznila nutnost sledování této choroby po celé Evropě, Českou republiku samozřejmě nevyjímaje. Dozor byl zaměřen hlavně na posmrtné vyšetření centrálního nervového systému zvířat s klinickými příznaky podobající se TSE. BSE může být diagnostikována histopatologicky (HP) u mozkových částí se spongiformními změnami, imunohistochemicky (IHC), nebo testováním rezistentní proteázy prionového proteinu buď přímo v případě BSE pomocí metody Western blot, či nepřímým imunoblottingem u scrapie pomocí preparátu SAF scrapie associated fibrils, nebo vizualizací SAF pomocí elektronové mikroskopie. V ČR se testuje BSE metodou western blot. Testování provádí SVÚ Praha, Jihlava a Olomouc. Studie o BSE poskytují naší populaci přesné údaje pro její monitorování. Takováto studie by proto měla být součástí každého programu zabývajícího se detekcí a sledováním BSE, protože má velkou roli pro budoucí sledování a hlavně vymýcení této nemoci. Histologická a imunohistochemická technika je práce dlouhodobá a intenzivní. Jejich nevýhodou je, že je zapotřebí delší doby k získání diagnózy. Proto se vědci na celém světě snaží o vyvinutí rychlejších a účinnějších metod. Metoda western blot má přesnější a rychlejší výsledky než metoda histologická, ovšem má tu nevýhodu, že je samozřejmě finančně náročnější a tudíž ji provádí jen specializované laboratoře. (SCHALLER, 1998) Uvádím zde praktické využití rychlé metody western blot, která byla vyvinuta pro masový odběr vzorků mozkových tkání odebraných na přítomnost PrPSc. Pozitivní vzorky sestávají ze vzorků skotu nebo ovcí, u kterých byly 31

diagnostikovány klinické příznaky BSE nebo klusavky, respektive ze vzorků, které byly určeny v Referenčním centru BSE ve švýcarském Bernu (BRC), nebo Veterinary Laboratory Agency (VLA) ve Weybridge ve Velké Británii. (SCHALLER, 1998) Diagnóza je potvrzena ve všech případech histologicky, a to buď imunohistochemicky u vzorků z BRC, anebo elektronovou mikroskopií u vzorků z VLA. Negativní vzorky byly odebrány zvířatům, jež měla příznaky podobné spongiformním encefalopatiím, ale ve skutečnosti jim poté byla diagnostikována jiná neurologická onemocnění, jako je například listerióza, metabolická encefalitida, degenerace Purkyňových nebo jiných nervových buněk. Jednalo se o zdravá mladá zvířata mladší šesti měsíců ze Švýcarska, a 286 krav, narozených, chovaných a poražených v zemích, které jsou prosté BSE. (SCHALLER, 1998) Pro menší studie byly vzorky odebrány k posouzení specifičnosti a citlivosti s ohledem na definované oblasti mozku. Vzorky byly odebrány ze středního mozku, mozečku a prodloužené míchy. Pro potvrzení klinicky nemocných nebo zdravých zvířat se provádí odběr z prodloužené míchy, která slouží i jako oblast odběru pro histologické vyšetření. Bylo zjištěno, že kůra mozečku obsahuje méně PrPSc, než oblast mozkového kmene. (SCHALLER, 1998) Většinou však tkáň mozečku a mozkového kmene nebyla k dispozici pro western blot, proto byla prodloužená mícha stanovena jako celek. A rostrální a kaudální části byly použity pro western blot. Pro studie, které se dělají ve větším měřítku, je odebráno více vzorků z jednoho zvířete, a tím se také zvyšuje variabilita. (SCHALLER, 1998) Klinicky zdravé krávy ze stáda, kde se vyskytla BSE, byly utraceny v rámci švýcarského programu pro tlumení BSE. Přibližně polovina těchto zvířat prošla před porážkou neurologickým vyšetřením kvůli této chorobě, a všechna vyšetření byla negativní. Vzorky byly odebrány z prodloužené míchy. Příprava vzorků mozková tkáň, která byla získána při pitvě, nejpozději však do 24 hodin, a zmražená při - 70 C. Poté musí být tkáň kvůli udělání vzorků rozmražena a opět zmražena. Velikost vzorků se pohybuje od 0,1 do 1,3g. Následně jsou vzorky předány firmě Prionics Check pro provedení analýzy western blot. Vzorky jsou napřed homogenizovány pomocí Prionics pufru, a pomocí polytron homogenizátoru (OMNI GLH, OMNI International), s jednorázovými otáčkami 20 000 ot./min. po dobu jedné minuty. Poté je přidána proteáza (2 U/ml proteinázy 32

K), a inkubuje se při 47 C po dobu 30 minut. Pro western blot je homogenit zředěn v poměru 1:1 v SDS pufru (také je od firmy Prionics), zahřeje se na 96 C po dobu 5 minut a je provedena elektroforéza na polyakrylamidovém gelu obsahujícím SDS (pomocí Bio-Rad Mini-Protean systém Novex nebo 12% gel NuPAGE prefabrikátů) na 200 V po dobu jedné hodiny. Tím pádem jsou proteiny převedeny na membrány polyvinyliden difluorid (PVDF), při 150V a teplotě 4 C po dobu jedné hodiny a jsou přeneseny na desku s elektrodami. (SCHALLER, 1998) V této fázi mohou být identifikovány podle zbarvení, kdy se v 0,025% (w/v) Ponceau S rozpustí v 0,25% kyselině octové. Nespecifická vazebná místa bílkovin jsou zablokována inkubací v PVDF tlumícím roztoku po dobu 30 60 minut při pokojové teplotě. Rezistentní PrP proteázy jsou detekovány pomocí monoklonální protilátky (MAb) 6H4. Při ředění 1:5000 po dobu 2 hodin při pokojové teplotě, nebo po dobu 12-18 hodin při +4 C. Následuje inkubace s protilátkami vázanými na alkalické fosfatázy (AP). AP aktivita se zvýrazní pomocí použití 0,25mm CDP-Star (Tropix Inc) ve 20 mm Tris-HCl, 1 mm MgCl2, ph 9,8. PrPSc se vyznačuje rezistencí částí dílčí proteázy N - terminálních 60 až 70 aminokyselin je štěpeno, zatímco zbytek je neporušená bílkovina. To vede ke snížení molekulové hmotnosti z cca 35 na 27-30 kda. Zvíře je proto považováno za pozitivní, když protein v jádře o hmotnosti 27-30 kda je přítomen i po ošetření proteázou. Obrázek č. 13: Metoda Western Blot. 1) BSE u ovcí, 2) klasická scrapie, 3) BSE u skotu, 4) zdravá kráva (převzato z www.escope.prionics.com) 33

Obrázek 14: Soustava pro gelovou elektroforézu (převzato z www.kenickbiochem09.wikispaces.com) Obrázek č. 15: Kit pro analýzu BSE a scrapii (převzato z biorad.com) 34

Obrázek č. 16: Znázornění SRM u krav a tkání, kde se nevyskytují priony (převzato z www.niah.affrc.go.jp) Obrázek č. 17: Geofrafický přehled zemí, ve kterých byl zjištěn minimálně jeden případ BSE od roku 1989 do roku 2004 (převzato z www.emedicine.medscape.com) 35

ZÁVĚR Ve své bakalářské práci jsem se zaměřila na problematiku týkající se BSE, scrapie a jiných prionových chorob zvířat a lidí, patřící mezi tzv. transmisivní spongiformní encefalopatie. Tyto choroby mají význam jak pro chovatele skotu, ovcí a koz, ale i pro spotřebitele. Tato problematika nabývala rozměrů především v devadesátých letech, kdy z důvodu výskytu BSE nejen ve Velké Británii, ale i v celé Evropské unii rapidně klesla spotřeba hovězího a skopového masa. V ČR byl první případ zaznamenán v roce 2001, a až do dnešního dne bylo evidováno 30 případů této choroby, což je ve srovnání s Velkou Británií, která je kolébkou BSE minimum. Protože byl vydán zákaz zkrmování masokostní moučky hospodářským zvířatům, nemyslím si, že se bude počet případů zvyšovat, a to i přesto, že poslanci EU zvažují zrušení zákazu krmení masokostní moučky prasatům a drůbeži. Otázek kolem této problematiky je stále velmi mnoho, vědci se shodují pouze na tom, že TSE způsobují priony. Proto jsem se snažila ve své práci shrnout moderní vědecké poznatky z tohoto oboru. 36

PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY APHIS, 2009: Scrapie Flock Certification Program USDA Scrapie Programs. Databáze online [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.aphis.usda.gov/publications/animal_health/content/printable_version/f s_scrafcp.pdf> ATKINSON H. P., 2005: Bovine spongiform encephalopathy (BSE): Its context in New Zealand and new tests. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://pdfserve.informaworld.com/709449 919964398.pdf> BELAY G., 2001: Přehled TSE u zvířat. In Transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE) prionové choroby člověka a zvířat. Sborník ze semináře pořádaného ústavem mikrobio- logie a imunologie FVL VFU Brno, mikrobiologickým ústavem LF MU a FN U svaté Anny v Brně. Noviko, a.s., Brno, 40 s. COJECO, 2000: Scrapie. Encyklopedie online: [cit. 2011-03-31]. Dostupné na: <http://www.cojeco.cz/index.php?id_desc=84998&s_lang=2&detail=1&title=scrapi e> COLLEE J. G., 2006: Variant CJD (vcjd) and Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.cwd.cc/variant%20cjd%20%28vcjd%29%20and%20bovine%20sp ong iform%20encephalopathy%20%28bse%29_part%202.pdf> HEATON P. M., 2010: Ovinelreference materials and assays for prion genetic testing. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2876147/pdf/1746-6148-6-23.pdf> LÉZMI S., 2004: Comparative Molecular Analysis of the Abnormal Prion Protein in Field Scrapie Cases and Experimental Bovine Spongiform Encephalopathy in Sheep by Use of Western Blotting. Databáze online: [cit. 2011-01-10]. Dostupné na: <http://jvi.asm.org/cgi/reprint/78/7/3654> 37