METODY STUDIA PROTEINŮ

METODY

Metody studia bílkovin Studium struktury molekulární vlastnosti funkce katalytické aj. vlastnosti Podle potřeby a účelu izolace do potřebné čistoty studium in situ Isolace metody více či méně komplikované podle účelu čisté nativní bílkoviny pro studium vlastností event. farmakologii, hrubé isolace pro průmysl apod Isolační postupy separační metody

Proč izolovat enzymy Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory snížení aktivity cílových enzymů) V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina urokinasa, streptokinasa...) Možné problémy Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek) Malá množství cílového enzymu Labilita enzymu

Metody studia bílkovin Izolace přehled metod desintegrace materiálu preparativní centrifugace srážecí metody, jsou založeny na změně rozpustnosti membránové separace chromatografie preparativní elektromigrační metody elektroforéza krystalisace Analytické postupy včetně metod separačních elektroforéza a chromatografie v analytickém měřítku, spektrální metody absorpční disperzní chiroptické metody NMR rentgenostrukturní analýza, MS moderní metoda umožňující i štěpení řetězce další speciální metody

Metody stanovení koncentrace proteinů Metoda Rozsah (ng) Biuretová 0.5-5 Lowryho 0.05-0.5 UV - 280 nm 0.05-2 UV 205 nm 0.01-0.05 Bradfordové 0.01-0.05

Desintegrace materiálu (homogenizace)

Izolace membránových proteinů Membránové bílkoviny interagující integrální elektrostaticky hydrofobně zanořené transmembránové

1. vodné roztoky 2-5 násobek objemu vzorku doba extrakce 1-2 h až 24h stálé míchání vliv teploty ph Extrakce koncentrace solí, chelatačních látek vliv substrátů a kofaktorů 2. detergenty u enzymů vázajících se na buněčné částice žlučové kyseliny, SDS, Triton 3. organická rozpouštědla - delipidizace aceton, n-butanol, etanol, pyridín 4. jiné enzymy - autolýza, lysozym - rozrušení b. stěny, lipasa, fosfolipasa, proteolytické enzymy

Extrakce 5. stabilizátory - látky chránící enzymy 2-merkaptoethanol, cystein, dithiotreitol - chrání SH- skupiny před oxidací fenylmehansulfonylfluorid - inhibitor proteinas chelatační činidlo EDTA - pokud enzym neobsahuje kov HO H 2 C HC CH C H 2 SH OH SH dithiothreitol H 2 C HC HC C H 2 SH OH OH C H2 SO 2 F SH dithioerythritol fenylmethansulfonylfluorid (benzylsuldonylfluorid)

Rozpustnost proteinů je daná ph: rozpustnost je minimální v izoelektrickém bodě molekula má nulový náboj Iontovou silou: při zvyšující se koncentraci vzrůstá rospustnost (vsolovací efekt), po dosažení maxima prudce klesá (vysolování) Relativní permitivita (dielektrická konstanta): fyzikální konstanta kapalin - velikost elektrostatických sil, kterými na sebe působí nabité částice. Rozpouštědla s nižší RP než voda zvyšují tendenci molekul se shlukovat (snižují stupeň hydratace) Přítomnost látek tvořících s proteiny sloučeniny typu solí nebo koordinačních látek (ionty těžkých kovů) Teplota: rozpustnost s teplotou vzrůstá

Podle frekvence otáček Centrifugace běžná centrifugace (frekvence 15 000-21 000 min-1) ultracentrifugace (30 000-50 000 min-1) Podle dělení diferenciální cent. - centrifugace suspenze víckrát při narůstající odstředivé síle cent. v gradientu hustoty - zónová centrifugace Podle účelu - izopyknická centrifugace cent. analytická (stanovení molekulové hmotnosti) cent. preparativní

Centrifugace Diferenční centrifugace po homogenizaci. Zvyšující se centrifugační síla (násobky g) umožňuje oddělení těžšího materiálu od lehčího, případně se oddělí pevné částice od rozpuštěných v roztoku.

Zónová ultracentrifugace Centrifugace Izopyknická ultracentrifugace

Srážecí metody/vysolování Vysolování: mnohé proteiny jsou méně rozpustné v roztocích s vyšší koncentraci solí vysolování lze provádět frakčně např. síranem amonným rozpustnost většiny bílkovin klesá s koncentrací roztoku (iontovou silou) lineární vztah mezi log rozpustnosti a iontovou silou log sol. = b - K sol. m b = rozpustnost bílkoviny při m = 0, K sol - směrnice přímky závislá na druhu soli, teplotě a ph

Srážecí metody/vysolování Globulíny v čisté vodě nerozpustné salting in efekt - vsolování - přídavkem soli se rozpouští salting out - vysolování - při určité koncentraci se opět vylučují

FRAKCIONACE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY Je založena na snižování dielektrické konstanty vodného prostředí odnímání hydratačního obalu není nutná dialýza nejvhodnější je aceton ph isoelektrického bodu nízká teplota frakcionace - změnou konc. rozpouštědla a ph

Dialýza Dialýza je proces při kterém se oddělují velké molekuly proteinů od malých molekul (např. solí) přes semipermeabilní membránu. Dializační sáček Koncentrovaný roztok Pufr (ústroj) Zahájení dialýzy V rovnováze

% Tepelná denaturace 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 teplota Bílkovina 1 Bílkovina 2

Chromatografické metody ionexová CHROMATOGRAFICKÉ METODY hydrofóbní gelová molekulová síta afinitní

Chromatografické metody Gelová chromatografie. Metoda slouží k oddělování velkých molekul od malých. Používají se kolony obsahující nerozpustné, ale vysoce hydratované polysacharidy dextran, agarosa nebo polyakrylamid. Malé molekuly vnikají do hydratovaných gelů a tím se zpožďují, kdežto velké molekuly prochází rychleji (nezpožďují se). Pořadí eluce molekul z gelu je : první velké, poté střední a nakonec malé molekuly. Používá se také k odsolování.

Gelová chromatografie na Sephadexu Využívá rozdílné velikosti molekul nosiče - polymery s póry o kontrolované specifické velikosti - Sephadexy (do 2.10 5 ), Sepharosa, Biogel (do 10 8 )

Gelová chromatografie na Sephadexu Využívá rozdílné velikosti molekul Oddělují se velké molekuly, které nepronikají dovnitř polymeru, od malých molekul, které pronikají dovnitř gelu a tím se zpožďují. Využití na odsolování (oddělení bílkoviny od solí) dělení bílkoviny podle velikosti molekuly stanovení molekulové hmotnosti

Chromatografické metody Chromatografie na iontoměničích. Proteiny se oddělují na základě náboje na jejich povrchu. Když má protein na povrchu kladný náboj při ph 7, váže se na kolonu polymeru obsahujícího karboxylátové skupiny, zatímco protein s negativním nábojem se neváže. Navázaný protein s kladným nábojem se uvolní přidáním chloridu sodného do ústoje, protože sodný iont kompetuje s kladným nábojem proteinu. Proteiny s kladným nábojem se váží na negativní náboj kolony (např. karboxymethylcelulosa). Naopak proteiny se záporným nábojem se váží na pozitivní náboj např. diethylaminoethylcelulosu DEAE.

- + Chromatografie na iontoměničích katex karboxymethylcelulosa - - - - - - - - + - + + - + - - - + - - - + - - - - + - - - - - + + - - - - - - + - - - - - - - - + - - - + - + - Celulosa nebo agarosa H 2 C Karboxymethylová (CM) skupina (ionizovaná forma) Celulosa nebo agarosa H 2 C H 2 C C H 2 N C O CH 3 + H O C H 2 CH 3 Diethylaminoethylová (DEAE) skupina (protonovaná forma)

Afinitní chromatografie Afinitní chromatografie spočívá ve vazbě proteinů na specifické chemické skupiny (afinanty). Např. enzym se může vázat na afinitní kolonu s navázaným kompetitivním inhibitorem. nosič - raménko (1-1,6 mm) - afinant -enzym

Afinitní chromatografie

Afinitní chromatografie 1. Analog substrátu Afinitní ligand + Enzym Nosič Raménko Enzym vázaný v aktivním místě 2. Imunoafinitní chromatografie Protilátka Proteinový epitop + Nosič Raménko Enzym vázaný na protilátku

Kvantifikace purifikačního protokolu fiktivní protein Stupeň Celkové Celková Specifická Výtěžek Stupeň purifikace proteiny aktivita aktivita (mg) (jednotky) (jednotky/mg) (%) Homogenizace 20 000 200 000 10 100 1 Vysolování 5 000 150 000 30 75 3 Chromatografie na iontoměniči 1 000 120 000 120 60 12 Gelová filtrace 100 80 000 800 40 80 Afinitní chrom. 2 60 000 30 000 30 3 000

Gelová elektroforéza Ověření úspěšnosti purifikace. Molekuly nesoucí náboj putují stejnosměrným elektrickým polem. Proces se nazývá elektroforéza. V biochemii můžeme takto dělit proteiny i nukleové kyseliny. Rychlost pohybu molekul v elektrickém poli závisí na síle el. pole (E), celkovém náboji molekuly (z) a frikčním koeficientu (f): v = E.z / f Proti elektrické síle E.z nesoucí molekulu s nábojem proti elektrodě s opačným nábojem působí viskozita jako projev interakce mezi putující molekulou a prostředím. Frikční koeficient f závisí na hmotnosti a tvaru molekuly a viskozitě prostředí (h ). Pro molekulu ve tvaru koule o poloměru r, platí: f = 6 p. h. r Elektroforéza se provádí na nosiči o konzistenci gelu nebo na papíře. Gel slouží současně jako molekulové síto.

Elektroforéza ELEKTROFORETICKÉ METODY elektrofokusace nativní elfo konvenční isotachoforéza dělení podle velikosti SDS - elfo elfo v gradientovém gelu

Uspořádání elektroforetické metody

Uspořádání elektroforetické metody typy analytická preparativní kontinuální diskontinuální nosiče agar škrob akrylamid

Uspořádání elektroforetické metody DISKONTINUÁLNÍ ELFO Zaostřující a dělící gel Gradientový gel Ve směru migrace se zvyšuje hustota gelu

Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE). O Akrylamid NH 2 + O N H H 2 C N H O N,N -Methylenbisakrylamid S 2 O 8 2- Persíran 2 SO 4 - Síranový radikál (iniciátor polymerace) CONH 2 CONH 2 CONH 2 CONH 2 O NH H 2 C O NH CONH 2 CONH 2 CONH 2 CONH 2

Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE). Provedení PAGE. Vertikální (shora dolů), molekuly se pohybují směrem k anodě (+). Velké molekuly se zpožďují, malé putují v čele. - Směs makromolekul (proteinů) Směr elektroforézy Elektroforeza + Porézní gel

SDS PAGE Modifikací je elektroforéza za podmínek denaturace SDS-PAGE. Denaturačním činidlem je dodecylsíran sodný (SDS) aniontový detergent. SDS štěpí téměř všechny nekovalentní vazby v proteinech. Aniont SDS se váže na hlavní řetězec polypeptidu (jedna molekula SDS na dvě aminokyseliny). Komplex denaturovaného proteinu s SDS získá záporný náboj, který je úměrný molekulové hmotnosti proteinu. O H 3 C O S O - Na + Dodecylsíran sodný O

Standardy Původní vzorek Nenavázané proteiny Eluované proteiny SDS PAGE Kromě SDS se přidává merkaptoethanol nebo dithiothreitol k redukci disulfidových vazeb. Po proběhnutí elektroforézy se proteinové pásy vizualizují. Nejčastěji se používá trifenylmethanové barvivo Coomasie blue nebo barvení stříbrem. Pohyblivost většiny polypeptidů je za těchto podmínek je přímo úměrná logaritmu jejich molekulové hmotnosti. Sledování čistoty proteinů

SDS PAGE Dělení podle velikosti molekul - uniformní náboj SDS se váže na peptidové vazby a zásadité skupiny proteinů 1.4 g SDS se váže na 1 g proteinů

Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie 1 2 3 4 5

Stanovení relativní molekulové hmotnosti proteinů 1. Pomocí SDS-PAGE elektroforézy 2. Ultracentrifugace 3. Gelové chromatografie 4. Hmotnostní spektrometrie

Ultracentrifugace Centrifugace se používá k oddělení hrubých směsí buněčných komponent. Při kvantifikaci rychlosti pohybu molekul v roztoku v centrifugačním poli používáme sedimentační koeficient (s) dle rovnice: s = m(1 nr)/f kde m je hmotnost částice, n je parciální specifický objem (reciproká hodnota hustoty částice), r je hustota média, f frikční koeficient (závisí na tvaru molekuly) (1 nr) vyjadřuje schopnost prostředí nadnášet částice Sedimentační koeficient se obvykle vyjadřuje v jednotkách: Svedberg (S); S = 10-13 s. Čím je hodnota S nižší, tím pomaleji částice sedimentuje. Na tomto principu je založena gradientová nebo jinak zonální centrifugace vedoucí k oddělení částic na základě hodnoty jejich sedimentačních koeficientů.

Ultracentrifugace Relativní molekulová hmotnost proteinů může být stanovena přímo z tzv. sedimentační rovnováhy při které se částice centrifugují nízkou rychlostí, tak, že sedimentace je v rovnováze s difůzí. Metoda je poměrně přesná a na rozdíl od SDS-PAGE nedenaturační při zachování kvartérní struktury. Hodnoty S (Svedberg = 10-13 s) a molekulové hmotnosti některých proteinů Protein Hodnota S Molekulová hmotnost Cytochrom c 1, 83 12 310 Myoglobin 1, 97 17 800 Trypsin 2, 50 23 200 Malátdehydrogenasa 5, 76 74 900 Laktátdehydrogenasa 7, 54 146 200

MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of Flight-Mass Spectrometry) Princip metody: Proteinový vzorek je smíchán s matricí - tvorba krystalů Krystaly vystaveny laserovému paprsku vznik jednou nabitých iontů proteinu Ionty analyzovány v analyzátoru doby letu (t (m/z)1/2) MATRICE PRO MALDI organické látky zajišťující ionizaci látek O O HO CN OH HO OH OH a-kyano-4-hydroxyskoøicová kyselina 2,5-dihydroxybenzoová kyselina

MALDI-TOF MS Intens. [a.u.] 4000 Hovězí sérový albumin 3000 Mr=66350 2000 1000 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 m/z

METODY STUDIA NUKLEOVÝCH KYSELIN

Určení sekvence DNA Sekvenování DNA (tsekvenace či sekvencování, mnohdy také čtení DNA) souhrnný termín pro biochemické metody, jimiž se zjišťuje pořadí nukleových bází (A, C, G, T) v sekvencích DNA Základní strategie určení sekvence DNA chemická (selektivní štěpení Maxam-Gilbert) biochemická (syntéza, dideoxy metoda - Sanger)

Metody sekvencování nukleových kyselin Strategie sekvencování: Štěpení polymerů na specifické fragmenty, které mohou být celé sekvencovány. Určení pořadí nukleotidů každého fragmentu. Sestavení překrývajících se fragmentů tak, aby došlo k rekonstrukci původního polymeru. Enzymy: restrikční enzymy - nukleasy (endonukleasy a exonukleasy). Restrikční endonukleasy typu II rozpoznávají a štěpí palindromovou sekvenci DNA.

Maxam Gilbertova metoda M&G nebo též chemické sekvenování Chemická metoda Specifické (téměř) štěpení řetězce činidly Pracná, málo efektivní, ale univerzální a nezávislá Modifikace bazí DMS puriny hydrazinolýza pyrimidinů krátká sekvence DNA 5' konci radioaktivně označena fosforem 32 P. vzorek - na pět částí a každá je vystavena chemikáliím, které specificky štípají sekvenci DNA v každé z pěti nádob docíleno různě dlouhých sekvencí DNA

Maxam Gilbertova metoda Štěpení řetězce v místě této báze G DMS, piperidin A+G kyselina mravenčí, piperidin T+C hydrazin, piperidin T hydrazin + NaCl, piperidin

Maxam Gilbertova metoda PAGE elektroforéza seřazení sekvence podle své délky: nejdále v gelu doputují ty nejkratší sekvence. Autoradiografie - sekvence z gelu s 5' koncem označeným radioaktivním fosforem patrné jako svítící proužky Vyhodnocení pozice proužků ve srovnání s ostatními proužky vyhodnocuje - původní řazení nukleových bází ve vzorku DNA.

Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu Dělení fragmentů nukleových kyselin elektroforézou Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, PAGE. Výsledkem je restrikční mapa. Jamky pro nanesení vzorku Vzorek Pufr Gel - Katoda Stojan Směr elektroforézy Pufr + Anoda

Maxam Gilbertova metoda

Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera Metoda ukončení řetězce neboli dideoxymetoda Enzym DNA polymerasa I z E. coli (enzym podílející se na replikaci bakteriální DNA). Jednovláknová DNA jako templát a čtyři deoxynukleosidtrifosfáty (dntp): datp, dctp, dgtp a dttp. Krátký polynukleotid primer, který je komplementární 3 koncem templátu DNA a stává se 5 koncem nového řetězce. Syntéza DNA je zakončována specifickými nukleotidy. Reakční směs také obsahuje označenou sloučeninu, buď jeden z dnts nebo primer. Označení může být radioaktivním isotopem (např. 32P) nebo fluorescenčně.

Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera Metoda ukončení řetězce neboli dideoxymetoda Klíčovou komponentou je malé množství 2, 3 -dideoxynukleosidtrifosfátu (ddntp), který nemá 3 -OH. Když je tato komponenta vřazena do syntetizovaného polynukleotidu, řetězec je ukončen. O - O - O - BÁZE O - P O O P O O P O O CH 2 H H O H OH H H 2,3 -Dideoxynukleosidtrifosfát

Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera Reakce katalyzovaná DNA polymerasou TEMPLÁT TEMPLÁT 5 5 P P P P P P P P P P P P P P 3 3 G A a G T G A a A a T DNA polymerasa I G A a G T G A a A a T C T C A a C T C T C A a C T PP i OH + + PPP OH PPP OH +... OH + PPP OH +... P P P P P P P 5 PRIMER dctp dgtp 5 PRIMER dgtp

Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera TEMPLÁT: PRIMER: 3 CCGGTAGCAACT 5 5 GG 3 datp + ddatp dctp dgtp dttp datp dctp + ddctp dgtp dttp datp dctp dgtp + ddgtp dttp datp dctp dgtp dttp + ddttp GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT A C G T A G T T G C T A C C 3 5 Sekvence komplementární k templátu DNA

Metoda sekvencování DNA dle F. Sangera

Sangerova metoda Sangerova metoda má mnoho alternativ fluorescenční detekce čtyři terminační nukleotidy jsou značeny každý jiným fluorescenčním barvivem reakce může probíhat v jedné zkumavce, pruhy v gelu se po ozáření excitačním zářením zobrazují v různých barvách podle typu nukleotidu v místě terminace místo čtyř zkumavek lze použít jenom jedinou, tzv. kapilární elektroforéza může být do velké míry automatizována a tedy velice zrychlena

Sangerova metoda Sangerova metoda má mnoho alternativ fluorescenční detekce

Využití kapilární elektroforézy pro sekvenování excitace emise jedné ze 4 vlnových délek podle typu fluorescenčního barviva, kterým je označen právě procházející nukleotid kapilára naplněná polyakrylamidovým gelem zkumavka s fluorescenčně značenými produkty sekvenování

Automatické sekvencování DNA. Na primer v každé ze čtyř reakčních směsí jsou připojena fluorescenční barviva. Každá ze čtyř barevných křivek reprezentuje elektroforézou oddělený fragment s jedním dideoxynukleotidem. Barevné fragmenty: Zelená = ddatp, červená = ddttp, černá = ddgtp a modrá = ddctp.

Sekvenování genomu Frederick Sanger 1975 - Dideoxy sekvenační metoda 1977 osekvenoval Φ-X174 (5,368 bp) 1980 dostal druhou Nobelovu cenu za chemii Později (polovina 80-tých let) osekvenoval bakteriofága λ pomocí shotgun metody (48,502 bp)

Sekvenování genomu 1986 Leroy Hood: první automatický sekvenátor 1990 započat projekt sekvenování lidského genomu (předpokládaná doba 15 let) 1995 John Craig Venter sekvenoval první bakteriální genom 1996 první eukaryotický genom (kvasinka) sekvenován Leroy Hood John Craig Venter

1997 sekvence E. coli Sekvenování genomu 1998 Caenorhabditis elegans genom (první multicelulární genom) 1999 lidský chromozom 22 sekvenován 2000 Drosophila melanogaster genom 2001 Human Genome Sequencing: předběžná sekvence lidského genomu duben 2003 Lidský genom. Sekvence myšího genomu. duben 2004 Sekvence krysího genomu

Sekvenování genomu genomy jsou rozsáhlé sekvenování lidského genomu (Human Genome Project) stálo téměř tři miliardy amerických dolarů nově patentované technologie snižují cenu stanovení sekvence genomu na 100 000 dolarů, v některých případech dokonce na pouhých 1000 dolarů.

Syntéza oligonukleotidů Syntéza na pevné fázi Monomery s aktivovanými a chráněnými skupinami První zakotven na nosiči Deblokace reagujících skupin Vazba Promývání Cyklický proces - automatizace Příprava primerů Komerční záležitost Umělé geny

Syntéza oligonukleotidů Monomery s aktivovanými a chráněnými skupinami

Syntéza oligonukleotidů

Polymerase chain reaction - PCR technika umožňující v krátkém čase namnožit daný kus DNA bez pomoci buněk užívá se, pokud je DNA velmi malé množství nebo je DNA znečištěna za několik hodin je schopna metoda PCR vyprodukovat kolem miliardy kopií DNA vedle vysoké rychlosti je na metodě PCR impozantní její selektivita. známe-li příslušné sekvence, PCR je schopna vybrat z dlouhé molekuly DNA oblast, která má být namnožena, například konkrétní gen objevil Kally Muris 1983, o 10 let později obdržel Nobelovu cenu. Metoda se dnes běžně užívá v mnoha laboratořích

Význam analytický diagnostika, forenzní analýza, preparativní - pomnožení materiálu, cílené mutace, umělé geny atd. Polymerase chain reaction - PCR metoda PCR se sestává ze tří kroků, při kterých se množství DNA zvětšuje exponenciálně klíčovým enzymem je DNA-polymeráza z Thermus aquaticus, žijícím v horkých pramenech Yellowstonského národního parku tato polymeráza nese název Taq polymeráza, je odolná vůči vysokým teplotám a zůstává aktivní přes mnoho cyklů

Polymerase chain reaction - PCR Potřeby pro PCR DNA, která má být namnožena Taq polymeráza zásoba primerů, ohraničujících cílovou sekvenci. zásoba datp, dctp, dgtp, dttp MgCl 2

Polymerase chain reaction - PCR První krok krátké zahřátí celé směsi na 94 o C -96 o C teplem se poruší vodíkové vazby a oba řetězce DNA se oddělí

Polymerase chain reaction - PCR Druhý krok ochlazení směsi na 50 C 65 C. ochlazení umožní primerům se navázat na cílovou DNA vodíkovými můstky podle pravidel komplementarity primery jsou krátké, synteticky vyrobené molekuly jednořetězcové DNA (20-30 nukleotidů), které jsou komplementární ke koncům DNA, která má být amplifikována primery tak determinují místo na DNA, které má být zmnoženo

Polymerase chain reaction - PCR Třetí krok DNA-polymeráza může přidávat nukleotidy k 3 koncům primerů, jako při obvyklé replikaci směs je zahřáta na 72 C

Polymerase chain reaction - PCR směs je znovu ohřáta a začíná nové kolo cyklu každé kolo trvá pouze asi 5 minut výsledkem je dvojnásobné množství cílové DNA, dlouhé i stovky párů bází tento tříkrokový cyklus je následně opakován znovu a znovu. za třicet cyklů je možno teoreticky obdržet miliardu kopií

Polymerase chain reaction - PCR

Kvantitativní PCR Schéma RT PCR Sledování fluorescencí, kvantifikace Využití fluorescence, 3 -exonukleasové aktivity Taq polymerasy

Využití reverzní transkriptázy Syntéza cdna Modifikace PCR

Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Klonování je produkce násobku identických organismů odvozených od jednoho předka. Klon je soubor buněk obsahujících vektor nesoucí žádanou DNA. Metoda dovoluje připravit větší množství DNA, které nelze získat např. izolací z bakteriální kultury. Genové inženýrství. naklonování ovce Dolly v roce 1997 - jádra přenesená do oocytu pocházela z epitelu mléčné žlázy dospělé ovce

Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Způsoby amplifikace segmentu DNA: Specifický fragment DNA vytvořený restrikčním enzymem, technikou PCR (polymerázová řetězové reakce) nebo chemickou syntézou. Fragment je vnesen do jiné DNA molekuly označené jako vektor, obsahující nezbytnou sekvenci k přímé replikaci DNA. Vektor nesoucí vloženou DNA je inkorporován do buněk, kde je replikován. Buňky obsahující požadovanou DNA jsou odděleny. Klonovací vektory. Nejčastěji plasmidy, kruhové DNA molekuly od 1 po 200 kb z bakterií nebo kvasinek. (kb = 1 000 párů bází dvojšroubovice nebo 1 000 bází jednovláknové DNA).

Součásti klonovacího vektoru Počátek replikace Dominantní selekční marker (obvykle gen, který uděluje hostitelské buňce rezistenci k léčivům) Nejméně jedno unikátní restrikční místo místo štěpení, které je přítomno pouze jednou a leží v oblasti vektoru, které nenaruší ani počátek replikace ani selekční marker. V současnosti používané klonovací vektory obsahují seskupení unikátních restrikčních míst nazývané polylinker nebo mnohočetné klonovací místo.

Restrikční enzymy

Tvorba rekombinantní DNA (rdna)

Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Laboratorní plasmidy jsou relativně malé kruhové DNA, snadno se replikující, nesoucí geny specifické rezistence k jednomu nebo více antibiotikům a obsahující jedno nebo více míst pro restrikční endonukleasu, kam může být zavedena cizí DNA. Např. E. coli plasmid označený puc18 (2,69 kb) reprezentuje klonovací vektor (puc znamená plasmid Universal Cloning). Používá se ke klonování DNA do velikosti 10 kb. Obsahuje 13 restrikčních míst, tři geny rezistence k ampicilinu, lacz kódující enzym b-galaktosidasu. Bakteriofág l je vektor klonující DNA do 16 kb.

Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky Rekombinantní DNA neboli chiméra (podle řecké mytologie obluda se lví hlavou, kozím tělem a hadím ocasem) složená DNA. Ligace (vazba). DNA segment, který má být klonován má obvykle lepivé konce. DNA ligasa je enzym katalyzující spojení segmentu DNA s klonovacím vektorem. Transformace exprese chimerního plasmidu do hostitelské bakterie.

Konstrukce rekombinantní DNA molekuly

Inzerce DNA do plasmidu

Namnožení DNA Molekulární klonování in vivo - pomocí prokaryot (bakterie, např. E. coli), - pomocí eukaryot (kvasinky), - pomocí buněk savců rostoucích v tkáňových kulturách. Molekulární klonování in vitro - procesem polymerázové řetězové reakce (PCR)

TRANSFORMACE baktérii a kvasinek přímý přenos genetické informace z okolí do organismu buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Hemorheae influenze atd. všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: A) ELEKTROPORACE B) CHEMICKÁ METODA buňky se pořádně promyjí dih 2 O smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou také v dih 2 O a vloží do elektroporátoru buňky se ošetří roztokem rubidné a vápenaté soli, které způsobují větší permeabilitu membrány DNA se smísí s těmito buňkami a provede se tzv. HEAT SHOCK (45 sec. 42 C) EFEKTIVITA NÁROČNOST

Technologie rekombinantní DNA - klonovací techniky

Schéma bakteriální transformace

Transformace cizí DNA do bakterie Úspěšnost transformace cizí DNA je sledována na základě marker genů, které novou buněčnou kolonii odlišují na kultivačním mediu od kolonií bez přenesené DNA. Marker geny: pro rezistenci vůči antibiotiku; b-galaktosidasy (enzymy štěpící galaktosu na laktosu a glukosu) zajišťující barevnou odlišnost kolonií atd.

Transformace a selekce transformovaných buněk Selekce oddělení pouze těch hostitelských organismů, které byly transformovány a obsahují správně konstruovaný vektor. V případě plasmidového vektoru lze provést výběr za použití antibiotik a nebo chromogenních látek. Např. lacz gen v puc18 plasmidu kóduje enzym b-galaktosidasu, který štěpí bezbarvou látku X-gal na modrý produkt. E.coli transformované nemodifikovaným puc18 plasmidem tvoří modré kolonie. V případě, že plasmid obsahuje cizí DNA inkorporovanou do jeho polylinker regionu, jsou kolonie bezbarvé, protože kódující sekvence lacz byla přerušena netvoří se funkční b-galaktosidasa.

Transformace a selekce transformovaných buněk Bakterie, do kterých nebyl vnesen plasmid jsou také bezbarvé. Tyto bakterie mohou být odděleny přidáním antibiotika ampicilinu do růstového média (plasmid obsahuje gen rezistence k ampicilinu).

Příprava rekombinantního proteinu

Usnadnění izolace rekombinantního proteinu nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy): His-tag pro metal chelatační chromatografii (Ni) FLAG epitope - tag DYKDDDDK (Sigma; specifická protilátka) CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) CBD - cellulose binding domain

Genová knihovna DNA knihovny - kolekce klonovaných DNA fragmentů genomu určitého organismu (cdna), které jsou skladovány uvnitř hostitelských organismů (zejména bakterií). cdna (copy DNA, complementary DNA) je získávána přepisem z mrna pomocí enzymu reverzní transkriptázy.