NOVÁ METODA qpcr GENOTYPIZACE Z PERIFERNÍ LIDSKÉ KRVE U HEREDITÁRNÍ TROMBOFILIE

Vyšší odborná škola, střední odborná škola a základní škola MILLS, s.r.o. Čelákovice NOVÁ METODA qpcr GENOTYPIZACE Z PERIFERNÍ LIDSKÉ KRVE U HEREDITÁRNÍ TROMBOFILIE Diplomovaný zdravotnický záchranář Vedoucí práce: MUDr. et. RNDr. Petr Wagner Vypracoval: Lukáš Kocanda Čelákovice 2012

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval samostatně a všechny použité písemné i jiné informační zdroje jsem řádně citoval. Jsem si vědom, že doslovné kopírování cizích textů v rozsahu větším než je krátká doslovná citace je hrubým porušením autorských práv ve smyslu zákona 121/2000 Sb., je v přímém rozporu s interním předpisem školy a je důvodem pro nepřipuštění absolventské práce k obhajobě. 01. 04. 2012 Praha Lukáš Kocanda..

Poděkování Děkuji vedoucímu práce MUDr. et RNDr. Petru Wagnerovi a konzultantům RNDr. Petru Dráberovi, DrSc. a RNDr. Petru Matouškovi, PhD. za odborné vedení a vřelý přístup k absolventské práci. Dále bych chtěl poděkovat Hematologicko transfúznímu oddělení Oblastní nemocnice Kladno za poskytnutí kazuistik pacientů. Mé poděkování patří i všem blízkým z laboratoře Signální transdukce Ústavu molekulární genetiky AV ČR, v.v.i za podporu a trpělivost během vypracování mé práce.

OBSAH 1 ÚVOD... 10 2 CÍLE PRÁCE... 11 2.1 HLAVNÍ CÍLE... 11 2.2 DÍLČÍ CÍLE... 11 TEORETICKÁ ČÁST... 12 3 HISTORIE PCR... 12 4 KVANTITATIVNÍ PCR (QPCR)... 13 4.1 DETEKČNÍ SYSTÉMY... 14 4.2 ANALÝZA KŘIVKY TÁNÍ... 15 5 PRINCIPY A CYKLOVÁNÍ QPCR... 15 5.1 KOMPONENTY PCR... 16 5.2 PCR INHIBITORY... 17 6 KREV... 17 6.1 KREVNÍ PLAZMA... 17 6.2 ČERVENÉ KRVINKY... 18 6.2.1 Hemoglobin... 18 6.3 BÍLÉ KRVINKY LEUKOCYTY... 18 6.4 KREVNÍ DESTIČKY TROMBOCYTY... 19 6.5 KREVNÍ SKUPINY... 19 6.6 FYZIOLOGIE HEMOSTÁZY... 20 7 HEREDITÁRNÍ TROMBOFILIE... 21 7.1 MUTACE FAKTORU V LEIDENU A FAKTORU II PROTROMBINU... 21 7.2 MUTACE MTHFR A VZTAH K HOMOCYSTEINU... 22 8 GENOTYPIZACE... 23 8.1 IZOLACE DNA... 23 8.1.2 Příklad Izolace DNA komerčními kity... 24 8.1.3 Příklad Izolace DNA fenol chloroformovou metodou... 24 PRAKTICKÁ ČÁST... 26 9 CHARAKTER NOVÉ METODY QPCR... 26

9.1 ODBĚR KRVE A NÁSLEDNÁ KOMPATIBILITA REAKČNÍCH SMĚSÍ PRO QPCR... 27 9.2 NOVÁ METODA QPCR PRO LABORATORNÍ ÚČELY... 28 9.2.1 Srovnání antikoagulancií v metodách qpcr a PCR... 28 9.2.2 Použitelnost periferní krve pro genotypizaci laboratorních myší... 30 10 POUŽITELNOST NOVÉ METODY QPCR U ANALÝZ DĚDIČNÝCH MUTACÍCH HEREDITÁRNÍ TROMBOFILIE... 31 10.1 DETEKCE PRIMERŮ, GENOTYPIZACE, POUŽITELNOST X % KRVE VE VZORKU... 31 10.2 DETEKCE A GENOTYPIZACE JEDNOBODOVÉ MUTACE 1691G>A LIDSKÉHO GENU PRO FV LEIDENSKÁ MUTACE... 32 10.3 DETEKCE A GENOTYPIZACE JEDNOBODOVÉ MUTACE 20210G>A LIDSKÉHO GENU PRO FII PROTROMBIN... 34 11 TROMBOFILNÍ STAVY V ŽILNÍ TROMBOEMBOLICKÉ NEMOCI (TEN)... 35 11.1 INDIKACE VYŠETŘENÍ TROMBOFILIÍ... 37 12 KAZUISTIKA PACIENTŮ S TROMBOEMBOLICKÝM ONEMOCNĚNÍM ZPŮSOBENÉ RIZIKOVÝMI FAKTORY HT... 39 12.1 KAZUISTIKA Č. 1 PACIENT 34 LET, FV LEIDEN A F II PROTROMBIN MUTACE... 39 12.2 KAZUISTIKA Č. 2 PACIENTKA 35 LET, FV LEIDEN MUTACE... 40 12.3 KAZUISTIKA Č. 3 PACIENTKA 20 LET, FV LEIDEN MUTACE... 40 12.4 KAZUISTIKA Č. 4 PACIENT 37 LET, FV LEIDEN MUTACE... 41 12.5 KAZUISTIKA Č. 5 PACIENT 53 LET, FV LEIDEN MUTACE... 42 12.6 KAZUISTIKA Č. 6 PACIENTKA 39 LET, F II PROTROMBIN MUTACE... 43 12.7 KAZUISTIKA Č. 7 PACIENT 21 LET, FV LEIDEN MUTACE... 44 12.8 KAZUISTIKA Č. 8 PACIENTKA 38 LET, FV LEIDEN MUTACE... 44 12.1.2 Hodnocení kazuistik... 45 13 DISKUZE... 46 14 ZÁVĚR... 47 15 SUMMARY... 48 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 49 Příloha 1a 1b Příloha 2

Seznam zkratek ALT Alanin transamináza AST Aspartáttransamináza ATP Adenosintrifosfát BAS Bazofily BILC Bilirubin total cdna Komplementární deoyribonukleová kyselina C T Práh cyklu datp Deoxyadenosintrifosfát dctp Deoxycytidintrifosfát dgtp Deoxyguanosintrifosfát DNA Deoxyribonukleová kyselina dntp Deoxyribonukleotid trifosfát dttp Deoxythymidintrifosfát ECT Extracelurární tekutina EDTA K Draselná sůl kyseliny etylendiamintetraoctové F IX Serinová proteáza FR Fyziologický roztok F VIII Plazmatický glykoprotein F X Trombokináza F XI Plazmatický předchůdce tromboplastinu F XIII Fibrin stabilizující faktor FII20210G Primer na detekci F II Protrombinu, alela guanin FII20210A Primer na detekci F II Protrombinu, alela adenin FV506Q(A) Primer na detekci FVL, alela adenin FV506R(G) Primer na detekci FVL, alela guanin FVL Faktor V Leiden G/A Guanin / Adenin G/C Guanin / Cytosin Glu Glukóza

GMT Glutamatdehydrogenéza HAK Hormonální antikoncepce Hb Hemoglobin Ht Hematokrit HT Hereditární trombofilie HRM Higth Resolution melting Hz Heterozygot CHOL Cholesterol ICT Intracelurární tekutina KCl Chlorid draselný kda Kilodalton Lym Lymfocyty M Marker MCV Střední objem erytrocytů MgCl 2 Chlorid hořečnatý MgSO 4 Siřičitan hořečnatý MCH Střední hmotnost erytrocytů MCHC Střední koncentrace Hb v erytrocytech Mo Monocyty MPV Střední objem destičky mrna Messenger RNA (jednovláknová nukleotidová kyselina) Neu Neutrofily NH 4 ( 2 SO4) Síran amonný PCR Polymerázová řetězová reakce PDW Distribuční křivka destičky PLT Trombocyty qpcr Kvantitativní PCR RBC Erytrocyty RDW Distribuční křivka erytrocytů RNA Ribonukleová kyselina RT PCR Reverzně Transkripční PCR SDS Dodecylsulfát sodný

T F Tkáňový faktor T04P2 0,4 M trehalóza, 2 M propandiol TEN Tromboembolické onemocnění T M Teplota tání UMG AV ČR, v.v.i. Ústav molekulární genetiky Akademie Věd České republiky UREA Močovina WBC Leukocyty WT Wild type

1 Úvod Polymerázová řetězcová reakce (PCR), z anglického slova; Polymeraze chain reaction, je široce využívaný způsob klonace fragmentů DNA. Na rozdíl od klasického způsobu, spočívajícího ve vpravení (ligaci) studovaného úseku DNA do plasmidu, v jeho následném vpravení do bakterií a množení bakterií, a tedy i plasmidu, v podmínkách in vivo, PCR představuje zásadně novou kvalitu klonace úseků DNA v podmínkách in vitro. Velikost a nukleotidové složení fragmentu DNA, amplifikovaného pomocí PCR, jsou určeny matricí (například úsek DNA, který se nachází v tak komplexním prostředí jakým je celá genomová DNA) a dvěma oligonukleotidovými očky (primery), které se specificky vážou na matrici a vymezují oblast amplifikace. Metodou PCR se často používá izolovaná DNA z lidské krve pomocí genotypitaze, jechž je metoda určení genetické výbavy, respektivě genetických (DNA) informací, týkající se zkoumaného znaku či znaků. Tato metoda se využívá v celé řadě diagnostických stanovení jako například určování přítomnosti mutantních genů (především v onkologii), detekce virových a bakteriálních infekcí a určování otcovství. Kromě určování přítomnosti genu (kvalitativní testy) je možné stanovit také počet kopií studovaného genu metodou kvantitativní RT PCR, z anglického slova; Real time. Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (označována také qpcr, z anglického slova; quantitative) je metoda založena na principu klasické PCR, umožňující však kvantifikaci sledovaného úseku DNA. Na rozdíl od běžné PCR, kde se analyzuje až výsledný produkt (amplifikovaná DNA) pomocí elektroforézy v agarovém gelu, je při qpcr zaznamenáván každý cyklus PCR ve skutečném čase. Záznam amplifikace je založen na principu fluorescence, kdy se používají sondy (fluorescenční látky), které se váží specificky nebo nespecificky na amplifikované DNA. Problémem při řadě těchto stanovení je nutnost izolace DNA z krve, která představuje časovou i finanční zátěž. Amplifikace DNA přímo z krve s využitím běžných metod PCR není možná, neboť krev obsahuje řadu komponent, které inhibují PCR/qPCR. Jedná se především o imunoglobuliny a hemoglobin, které inhibují amplifikační reakci i v malých množstvích. 10

2 Cíle práce 2.1 Hlavní cíle Charakteristika nové metody qpcr pro genotypizaci z periferní lidské krve Ověření použitelnosti qpcr z celé krve u detekce a genotypizace jednobodových mutací Faktoru V Leidenu a Faktoru II Protrombinu Trombofilní stavy v žilní tromboembolické nemoci a příkladné kazuistiky pacientů s rizikovými faktory způsobující TEN 2.2 Dílčí cíle Kompatibilita reakčních směsí s qpcr Nová metoda qpcr pro laboratorní účely 11

TEORETICKÁ ČÁST 3 Historie PCR Amplifikace fragmentů DNA pomocí PCR je laboratorní metodou využívající molekulárně genetické přístupy, jak na úrovni základního výzkumu, tak i diagnostické praxe. Tuto metodu objevil roku 1983 Dr. Kary Banks Mullis, který pracoval pro společnost Cetus Corporation, v souvislosti s analýzy mutací DNA. Myšlenkou Dr. Kary B. Mullise bylo amplifikovat jednotlivé úseky DNA pomocí přepisu a zmnožení DNA za krátkou dobu. Později se k Dr. Mullisovi připojili i zaměstnanci společnosti Cetus Co. Část týmu tvořili vědci, kteří se zabývali diagnostikou DNA a identifikací mutací lidského genomu. První článek popisující tuto metodu byl publikován v roce 1985 v časopise Science. Pracovní postup byl následující: malé množství DNA obsahující požadovaný gen, skupina volných oligonukleotidů a primery se vložily do zkumavky, která se zahřála na teplotu 100 C a poté zchladila. Ke směsi se následně přidala DNA polymerasa a tím došlo k syntéze DNA. Proces zahřátí a zchlazení se několikrát opakoval. Vzhledem k tepelné denaturaci DNA polymerasy ji bylo nutné přidat k reakční směsi před každým cyklem. Tento proces zajišťoval mnohonásobnou amplifikaci úseku DNA a jeho snadnější detekci. Avšak tento postup byl velmi neefektivní, jelikož vyžadoval neustálou pozornost a byl časově náročný. Dalším problémem byla spotřeba DNA polymerásy, která se vždy vkládala do zkumavky před jednotlivým procesem amplifikace, a tím se zvyšoval koeficient kontaminace vzorku. Proto bylo vynaloženo velké úsilí na konstrukci termocykléru a DNA polymerásy, která by byla termostabilní. Konstrukce termocykléru vznikla za spolupráce se společností PerkinElmer. Podařilo se také získat termostabilní DNA polymerasu, izolovánou z bakterie Thermus aquaticus žijící v termálních pramenech v Yellowstonenském národním parku. Spojení termocyklerů a termostabilní DNA polymerasy učinilo tuto metodu plně automatizovatelnou a nyní vyžaduje obsluhu při přípravě reakční směsi, zapnutí a poté vypnutí přístroje. 12

Díky těmto vylepšením se metoda stala také citlivější a přesnější. Technika PCR byla patentována firmou Cetus 28. července 1987 a jako hlavní vynálezce byl uveden Dr. Mullis. 4 Kvantitativní PCR (qpcr) qpcr je moderní technika umožňující rychlou, spolehlivou a citlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA nebo RNA. Real time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce přímo během reakce v reálném čase" pomocí fluorescenčních sond nebo barviv, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Real time PCR se provádí pomocí přístrojů zvaných cyklery, které umožňují jak provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu. Fluorescence je měřena během každého cyklu PCR a její intenzita je úměrná množstvím amplifikátu přítomného v reakční směsi. Kvantifikace se provádí prostřednictvím matematické analýzy amplifikačních křivek vzniklých vynesením naměřené fluorescence oproti pořadovému číslu příslušného cyklu. Amplifikační křivka má esovitě zakřivený tvar a lze ji rozdělit na 3 části: 1) pozadí background fázi: amplifikátu je málo a jeho fluorescence ještě nedosahuje měřitelných hodnot 2) exponenciální fáze: množství produktu exponenciálně roste (trvá asi 4 8 cyklů) 3) fáze plató: dochází k saturaci systému, množství amplifikovaného produktu se dále nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní. Používané matematické modely pracují s hodnotou zvanou C T ( threshold cycle"), která se rovná cyklu, kdy amplifikační křivka překročí zmíněný fluorescenční práh na počátku exponenciální fáze reakce. 13

Absolutní kvantifikace se používá např. u detekce specifických mikroorganismů. Je založena na zjištění existujících lineárních vztahů mezi logaritmem startovního počtu templátových kopií a C T příslušné amplifikační křivky. Pokud tedy amplifikujeme vzorek o neznámé koncentraci společně se sérií standardů o známé koncentraci, získáme kalibační přímku ( standard curve"), ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku. Relativní kvantifikace se používá ke stanovení míry genové exprese. Porovnává se tzv. relativní změna genové exprese neboli relativní expresní poměr v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku. C T amplifikační křivky daného genu se vždy normalizuje oproti C T housekeeping genu [Základní principy kvantitativní real time PCR, 13] 4.1 Detekční systémy Prvními látkami používanými pro detekci akumulace produktu během real time PCR reakce byla interkalační barviva (ethidium bromid, SYBR Green I), jejichž fluorescenční aktivita vzrůstá po vazbě na dvouřetězcovou DNA. Vzhledem k tomu, že během PCR vzniká dvouřetězcový produkt, jehož množství zpravidla výrazně převyšuje počáteční množství dsdna (z anglického slova; double standart ), lze pomocí interkalačních barviv sledovat průběh amplifikace. Velkou nevýhodou interkalačních barviv je skutečnost, že detekují veškerou dsdna přítomnou v reakční směsi včetně nespecifických produktů amplifikace (jako jsou např. tzv. primer dimer artefakty), které i při velmi pečlivé optimalizaci metody velmi často vznikají. Specifita detekce je navíc dána pouze sekvencemi primerů. Elegantní řešení co se týče detekce nespecifických produktů nabízejí často využívané oligonukleotidové sondy. Jedná se o fluorescenčně značené oligonukleotidy, které hybridizují s určitou cílovou sekvencí uvnitř amplifikovaného regionu a výrazně přitom zvyšují svou fluorescenční aktivitu. Jejich výhodou je vysoká specifita, jelikož detekce cílové sekvence probíhá ve 2 stupních na úrovni vazby primerů a rovněž na úrovni vazby sondy [Základní principy kvantitativní real time PCR, 13] 14

4.2 Analýza křivky tání Analýza křivky tání je metoda, která se používá po ukončení qpcr ke zjištění povahy produktů PCR. Ve spojení s oligonukleotidovými sondami lze s její pomocí provádět detekci polymorfismů a mutační analýzu vůbec, při použití interkalačních barviv se metoda používá k odlišení specifických a nespecifických produktů PCR reakce. Jako tání DNA označujeme proces separace komplementárních řetězců dsdna indukovaný zvyšováním teploty. Platí, že DNA taje nejrychleji v určitém rozsahu teplot blížících se tzv. teplotě tání (T M ). Tání DNA můžeme po skončení qpcr reakce sledovat tak, že roztok s DNA ochladíme na teplotu nižší než je očekávaná T M produktů, postupně ohříváme na teplotu vyšší než je očekávaná T M a měříme přitom fluorescenci. Platí, že fluorescenční aktivita oligonukleotidové sondy nebo interkalačního barviva je přímo úměrná množství dsdna přítomné v reakční směsi. Pokud vyneseme naměřenou intenzitu fluorescence proti příslušené teplotě, dostaneme tzv. křivku tání, která náhle strmě klesá v okolí T M. Teplota v inflexním bodě křivky se rovná teplotě tání a lze ji snadno zjistit po derivovaci křivky tání, kde se v grafu objeví jako vrchol peak". Detekce polymorfismů pomocí oligonukleotidových sond je založena na skutečnosti, že i jediná nekomplementární báze velmi změní T M sondy, přičemž sonda méně komplementárně taje při nižšní T M než sonda plně komplementární. Detekce nespecifických produktů při použití interkalačních barviv využívá předpokladu, že nespecifické produkty mají odlišnou (obvykle nižší) T M než produkty specifické [Základní principy kvantitativní real time PCR, 13] 5 Principy a cyklování qpcr První krokem je denaturace templátové DNA, obvykle při teplotě 95 C po dobu 2 5 min., avšak u vzorků bohatých na G/C oblasti je dentaruce prodloužena po dobu 15

10 min. Při kterém dojde k uvolnění vodíkových vazeb mezi bazemi komplementárních nukleotidů a vzniku volných polynukleotidových řetezců. Následující cyklus po ukončení počáteční denaturace, se skládá ze tří kroků: Denaturační fáze Zahřátí na teplotu 94 95 C po dobu 2 10 min. v závislosti na templátu, reakčním objemu a tloušt ce stěn zkumavky, aby došlo k oddělení všech dsdna na ssdna (z anglického slova single stanadrt ). Připojení primerů snížení teploty na 50 60 C po dobu 30 sek. až 2 min., kdy dochází k připojení primerů na komplementární úseky templátu. Polymerizace, extenze probíhá obvykle při teplotě 72 C a tím je cyklus ukončen. Produkty z denaturační fáze se stávají substrátem druhého cyklu. Tyto cykly se opakují řádově 30x 40x podle specifikace templátu. V každém cyklu dojde ke dvounásobení počtu kopií amplifikovaného úseku DNA. 5.1 Komponenty PCR Templátová DNA templát, který slouží jako vzor pro syntézu nových řetězců DNA. Primery oligonukleotidová očka jsou složena obvykle z 18 30 nukleotidů, která svou sekvencí odpovídají DNA templátu a vymezují úsek, který bude amplifikován. DNA polymeráza syntetizuje novou DNA ve směru 5 3 podle sekvence nukleotidů v templátu od místa primeru navázaného na templát až po jeho konec. Pufr zajišt uje optimální podmínky pro aktivitu DNA polymerázy. Deoxynukleotidtrifosfát dntp jsou stavebními kámeny pro syntézu nové DNA v PCR MgCl 2 důležitá komponenta nezbytná pro aktivitu Taq DNA polymerázy. Obvyklá koncentrace 1 3 mm. PCR voda ultra čistá voda (bez Dnáz), obecně se používá redestilovaná voda 16

5.2 PCR inhibitory PCR inhibitory jsou chemické látky, které bývají přítomné ve vyšetřovaných biologických vzorcích, nebo do nich vnikající při manipulaci. Jsou schopné zcela zastavit aktivitu DNA polymerazy a znemožnit amplifikaci nukleové kyseliny pomocí PCR. Nejčastěji uváděnými příklady PCR inhibitorů jsou prostředky používané na vysypávání gumových ochranných rukavic talek a škrobový pudr, nebílkovinná část molekuly hemoglobinu (Hem) a heparin. Existují však řada jiných inhibitorů, které mají za následek inaktivaci amplifikace DNA metodou PCR/qPCR. Seznam nejběžnějších PCR inhibitorů v laboratorní a diagnostické praxi: Etanol, NaCl, KCl, Sakrosyl, SDS, Isopropanol, Fenol, Hemoglobin, Heparin, 6 Krev Hlavní součástí vnitřního prostředí organismu je krev. Krev tvoří 7% tělesné hmoty (4,5 5 litrů). Muži mají více objemu krve oproti ženám, jelikož ženy mají větší podíl tukové tkáně [Mourek 2005, 2.] 6.1 Krevní plazma Nažloutlá kapalina, která obsahuje anorganické a organické látky. Hodnota ph plazmy je 7,4 a je velmi stabilní. U dospělého člověka je objem plazmy je 2,8 až 3,5 litrů. Hlavními kationty anorganických látek v krevní plazmě jsou: sodík (Na + ), draslík (K + ), vápník (Ca ++ ), horčík (Mg ++ ), anionty chloru (Cl ) a bikarbonátu (HCO 3 ). Ze stopových prvků je důležité železo, jód viz příloha č. 1a. Plazmatické bílkoviny (60 80 g/l), glukóza (3,3 6,1 mmol/l, laktát (0,5 2,2 mmol/l) a další látky glycidového metabolismu tvoří organické zastoupení látek. Krevní plazma obsahuje celou řadu dusíkatých látek (př. močovina, kyselina močová, kreatin, kreatinin, amoniak), které představují katabolity bílkovinného metabolizmu (nebílkovinný dusík) [Mourek 2005, 2.] 17

6.2 Červené krvinky Červená krvinka (erytrocyt) je buňka, která během svého vývoje ztratila buněčné jádro. Úloha erytrocytů je transport dýchacích plynů (tj. O 2 + CO 2 ). Erytrocyt má tvar připomínající cukrářský piškot na podélném řezu tzv. bikonkávní tvar. V krvi se objevuje jev, který se nazývá fyziologická anisocytóza. Jsou to malé i větší makrocyty spolu s menšími mikrocyty erytrocytů. Počet červených krvinek se liší u můžu a u žen. Muži mají 4,3 5,3. 10 12 /l krve a ženy 3,8 4,8. 10 12 l/krve. Tento rozdíl vzniká v pubertě a je podmíněn účinkem pohlavních hormonů. Červená krvinka stárne a zaniká rozpadem (hemolýzou) po 90 120 dnech života [Mourek 2005, 2.] 6.2.1 Hemoglobin Molekula hemoglobinu (Hb) se skládá ze čtyř podjednotek, každá podjednotka je tvořena ze dvou složek. Barevného hemu, který obsahuje železo a globin, což je proteinový řetězec. Množství Hb je u mužů 135 17 g/l, u žen 120 158 g/l krve. Denně se rozpadá asi 7 8 g hemoglobinu a také stejné množství vzniká. Hb na sebe váže kyslík reverzibilně (1 gram Hb váže přibližně 1,39 ml O 2 ). V praxi to znamená, že arteriální krev, která je nasycena kyslíkem, může přenášet okolo 200 ml O 2 v 1 litru krve. Hb vážící kyslík (oxyhemoglobin), předává na periferii kyslík tkáním a také přenáší i CO 2 ve vazbě na aminoskupinu proteinového řetězce. Tento derivát se nazývá karboxihemoglobin [Mourek 2005, 2.] 6.3 Bílé krvinky leukocyty Představují mobilní obranyschopnou jednotku organizmu. Mají schopnost tzv. fagocytózy (pohlcují a ničí bakterie a viry). Leukocyty se rozdělují na granulocyty a agranulocyty. Granulocyty se dělí podle barvitelnosti a velikosti granul na neutrofní, eozinofilní a bazofilní, oproti agranulocytům, kteří nemají granuly. Agranulocyty dělíme na monocyty a lymfocyty. Počet leukocytů v krvi je 4 9. 10 9 /l. viz příloha č. 1b. 18

Neutrofilní granulocyty jsou nejpočetnějším druhem leukocytů u dospělého člověka. Eozinofilní granulocyty mají velmi slabou fagocytární kapacitu. Fagocytují komplex alergen protilátka. Bazofilní granulocyty jsou málo pohyblivé a jejich granula obsahuje histamin a heparin. Významně se uplatňují při alergických reakcí. Monocyty žijí velmi dlouho, řádově několik let. V krvi cirkulují jako ještě nezralé buňky, které pak vycestují do tkání a tam dozrávají v makrofágy. Lymfocyty se dělí podle významu a funkce v imunitních reakcích na lymfocyty typu T, B a NK. T lymfocyty jsou odvozeny od thymu (brzlík), B lymfocyty od burzy Fabricií (lymfoidní útvar u ptáků). NK lymfocyty jsou tzv. nulové buňky, které nemají znaky antit ani B lymfocytů [Mourek 2005, 2.] 6.4 Krevní destičky trombocyty Jsou to nejmenší formované elementy krve. Trombocyty nemají jádro, ale mají tvar okrouhlých hladkých disků o průměru 2 4 µm. Počet trombocytů 150 400. 10 9 /l krve je celý život stejný avšak jejich životnost je velmi krátká (9 12 dní) a proto se musí neustále vyvijí. Destičky obsahují četné granule, jedním z granul je Alfa granula, která obsahuje faktory nutné pro hemokoagulaci a je významným růstovým faktorem, který podporuje hojení poraněné stěny cévní (vytvoření tzv. destičkového trombu vazokonstrikce). Postupem času dochází k fibrinolýze (trombus je odstraněn rozpadem trombocytů a fibrinů) a reparačně regeneračnímu procesu zhojení rány [Mourek 2005, 2.] 6.5 Krevní skupiny Z historického hlediska byl první, kdo objevil krevní skupiny vídeňský lékař Karl Landsteiner roku 1900, který však identifikoval pouze tři krevní skupiny. Za tento významný objev počátku 20. století obdržel roku 1930 Nobelovu cenu za medicínu a fyziologii. S objevem krevních skupin je pevně spjat český lékař neurolog a psychiatr 19

Jan Jánský, který roku 1906 jako první identifikoval všechny čtyři krevní skupiny na základě tzv. křížových experimentů s krevními séry viz tab. 1 Tab. 1 krevní skupiny Skupina Antigen Protilátky A A Anti B B B Anti A AB A i B Žádné O H Anti A i anti B Systém ABO je zastoupen aglutinogeny A a B (glykopoteiny) vázanými na povrch erytrocytů a všech buněk v těle. Aglutininy anti A a anti B jsou přirozené protilátky, které se vytváření až po narození, a to vždy opačně, než je antigen jedince (u skupiny A anti B, u skupiny B anti A) [Genetika Krevní skupiny a jejich dědičnost, 12.] 6.6 Fyziologie hemostázy Při porušení stěny cévní vzniká během několika minut tzv. primární destičková zátka. Primární destičková zátka je velmi křehká a rozpustí se, pokud není zpevněna, nebo připevněna fibrinovou sítí. Tvorba destičkové zátky je závislá na dostatečném množství a funkci krevních destiček. Fibrinové sítě tvoří koagulační systém, který stabilizuje destičkovou zátku a přemění ji na dostatečně pevné koagulum. Při poškození stěny cévní přichází krev do kontaktu s tkáňovým faktorem (TF) a dochází k vazbě Faktoru VII (FVII), která se tím aktivuje. Po aktivaci FVII s FT vzniká cesta tzv. zevního koagulačního systému (aktivace F IX a F X). Pro hemostázu in vivo je vnitřní koagulační systém méně důležitý. FIX a FX přemění FII (protrombin) na jeho aktivní formu trombin. Trombin aktivuje zpětně FXI a současně FV a FVIII, ty jsou pak akcelerátory FIX a FX. K aktivaci faktorů II, VII, IX a X dochází na povrchu destiček za přítomnosti Ca2+ iontů a tím je koagulační proces situován právě do místa poranění. Trombin je hemostatický protein, který přeměňuje fibrinogen na fibrin a aktivuje koagulační faktory. Tento proces se významně se podílí na aktivaci destiček. 20

Na povrchu endotelu se trombin váže na trombomodulin, čímž se účastní aktivace koagulačního inhibitoru proteinu C. Současně s aktivací koagulačního systému se aktivuje inhibiční systém. Antitrombin je nejdůležitější koagulační inhibitor, jeho aktivita je zaměřena proti aktivovaným faktorům X, trombinu a také F XII, XI a IX. Tato reakce je urychlována především za přítomnosti heparinu, ale i dalšími inhibitory jako jsou protein C a protein S. [Raušová 2005, 7] 7 Hereditární trombofilie Hereditární trombofile jsou dědičné rizikové faktory, které mají značný podíl na vzniku trombózy ve venózním nízkotlakém řečišti s následnou trombembolickou chorobou. Některé však mají souvislost se vznikem trombotických komplikací v arteriálním systému se se vznikem těhotenských komplikací př. opakované spontánní potraty ve 2. trimestu gravidity, porody mrtvých plodů, těžké intrauterinní růstové retardace plodu, preeklampsie a abrupce placenty. Trombotické komplikace jsou multifaktoriální povahy a na jejich vzniku se podílejí jak dědičné, tak získané rizikové faktory. Nyní jsou již známy mnohé genetické abnormality, které se podílejí na zvýšeném riziku trombofilie. Jejich kombinace přítomnost více než jednoho rizikového faktoru zvyšují riziko ještě významněji. Proces hemostázy vyžaduje rovnováhu mezi prokoagulačními a antikoagulačními faktory. Prvními popsanými genetickými protrombotickými rizikovými faktory byly deficity přirozeně se vyskytujících antikoagulačních proteinů, antitrombinu III, proteinu C a proteinu S, které však patří mezi vzácnější rizikové faktory, s výraznou genetickou heterogenitou. V současné době se pozornost obrací k relativně často se vyskytujícím polymorfismům, jako jsou faktor V Leiden a protrombinová mutace FIIG20210A, které ovlivňují riziko trombózy [Raušová 2005, 7] 7.1 Mutace Faktoru V Leidenu a Faktoru II Protrombinu Rezistence na aktivovaný protein C (APC resistence) představuje nedostatečnou nebo vůbec žádnou odpověď na aktivovaný protein C. Jedná se tedy o odolnost 21

koagulačního systému vůči inhibičnímu vlivu proteinu C na koagulačně aktivní faktory Va a VIII. Vrozená APC rezistence je v 95% případy vyvolána jednobodovou mutací v genu pro koagulační faktor V. V evropské populaci jsou nejčastější mutace 1691G>A tzv. Leidenská mutace způsobující záměnu argininu za glutamin v pozici 506 FV a 1091G>A tzv. Cambridge mutace způsobující záměnu argininu za threonin v pozici 306 FV. Velmi vzácná v naší populaci je pak mutace 1090A>G tzv. Hong Kong (záměna argininu v pozici 306 za glycin). Faktor V Leiden má normální prokoagulační aktivitu, ale nedá se proteolyticky štěpit aktivovaným proteinem C. Faktor tak zůstává ve své aktivované podobě a nedochází k jeho inaktivaci. Tím se rozvijí hyperkoagulační stav a zvyšuje se roziko trombózy. Leidenská mutace s 5,7 8,3% výskytem v evropské populaci je nejčastejším vrozeným rizikovým faktorem trombóz. Polymorfismus genu pro tvorbu protrombinu v 5. exonu, spojený s vysokou hladinou protrombinu, je další z vrozených příčin trombotických stavů. Podobně jako u APC rezistence je i tento defekt vyvolán jednobodovou mutací. Jedná se o záměnu G za A v pozici 20210 protrombinového genu (20210G>A). Ačkoli se jedná o mutaci v oblasti 3 netranslatované oblasti genu, dochází k jejímu projevu díky větší stabilitě mrna. Heterozygoti s touto mutací mají zvýšenou hladinu protrombinu zhruba o 30%. Frekvence této mutace v evropské populaci se pohybuje kolem 2%. 7.2 Mutace MTHFR a vztah k homocysteinu Enzym nazvaný methylentetrahydrofolátreduktáza (MTHFR) má velký význam v metabolismu homocysteinu. Homocystein je neesenciální aminokyselina, která vzniká v organismu jako sekundární produkt metabolismu esenciální kyseliny methioninu. Při normálně fungujícím metabolismu v buňce se vznikající homocystein rychle přeměňuje v dále zužitkovatelné a neškodné látky. Bodovými mutacemi v genu pro MTHFR vzniká enzym se zvýšenou termolabilitou a se sníženou aktivitou a významně souvisí s vyšší hladinou homocysteinu v plazmě. Homocystein působí cytotoxicky na endoteliální buňky, inhibuje buněčnou proliferaci a stimuluje proliferaci buněk hladkého svalstva v cévách. Homocystein má velký podíl a podporu protrombotické aktivity v cévním řečišti, což má za následek vznik aterosklerózy a 22

trombózy. Polymorfismus spočívá v záměně adeninu za cytosin v 1298 nukleotidu. Nejčastější mutací tohoto genu je bodová mutace (substituce) C (cytozin) za T (tymin) v pozici 677 (C677T), což má za následek substituci aminokyseliny alaninu (Ala=A) za valin (Val) na místě 223 v peptidickém řetězci Klinické biochemie, 9] [Krajská nemocnice Liberec, odd. 8 Genotypizace Genotypizace je detekce zkoumaného genu. V řadě diagnostických, výzkumných a vývojových laboratoří se genotypizace často provádí za účelem identifikace geneticky modifikovaných organismů (laboratorní zvířata) a diagnostika onemocnění. 8.1 Izolace DNA Pro izolaci DNA se používá řada postupů. Část tkáně, nebo např. leukocyty izolované z periferní krve, se zpravidla nejprve lyzuje pomocí kitů a pak se DNA očistí od bílkovin a dalších kontaminujících látek. Může se tak dít chemicky (např. hydrolýzou bílkovin pomocí proteolytických enzymů, jejich denaturací apod.) i fyzikálně (na základě různé afinity DNA a kontaminantů k různým látkám). V současnosti se nejčastěji používají tři metody: Izolace DNA vazbou na silikátovou kolonku: Využívá se vysoké afinity DNA k silikagelové náplni v chromatografické kolonce. DNA se v přítomnosti vysoké koncentrace solí naváže na silikát, zatímco kontaminující látky kolonkou protečou. DNA se pak vymyje např. destilovanou vodou nebo zředěným pufrem. Izolace DNA fenol chloroformovou metodou: Jde o zlatý standard, který se i přes jistou pracnost a nepohodlnost (práce s toxickými a zapáchajícími látkami) stále používá, neboť je spolehlivý, levný a poskytuje velmi čistou DNA. Izolace DNA komerčními kity: tato metoda izolace pomocí kitů je z hlediska nenáročnosti času velmi využívaná, však bývá dražší. 23

8.1.2 Příklad Izolace DNA komerčními kity Komerční kit DNA Lego kit od společnosti Top Bio, s.r.o Izolace DNA z neseparované krve. 1. Odebrat krev do antikoaglulancia (EDTA, Citrát sodný) 2. Do 1,5 ml zkumavky Eppendorf (Epp.) vpravit 1 ml DNA vazebného pufru, 50 µl DNA bind partikulí (po extensivním protřepání a míchání). 3. Směs inkubovat 10 min; intenzivně protřepat (vortex) každé 2 min. 4. Zkumavky stočit na mikrofuze 30 sec. 5. Peletu DNA bind a nukleových kyselin postupně opláchnout: 1 x 1 ml DNA vazebný pufr 2 x 1 ml promývací pufr 1 x 1 ml acetonu Každý oplachovací krok spočívá v přidání odpovídajícího roztoku, vortexování 5 sec, centrifugaci 30 sec a odsání supernatantu. Po opláchnutí v acetonu vysušit peletu 10 min při 56 o C. K vysušené peletě přidat 100 µl elučního pufru, vortexovat a inkubovat 10 min. při 56 o C; dojde k uvolnění DNA z DNA bind. Vzorek centrifugovat 1 min na mikrofuze a supernatant s DNA (přibližně 1 µg) přenést do nové zkumavky. Pro PCR lze použít 1 10 µl takto izolované DNA. Celková doba přípravy je odhadnuta na cca 20 30 min. 8.1.3 Příklad Izolace DNA fenol chloroformovou metodou Izolace DNA z části ocásku pro určení genotypu laboratorních myší 1. Odstřihnout část ocásku (0,3 0,5 cm) laboratorní myši a vložit je do 1,5 ml Epp. zkumavky 2. Předem si připravit vodní lázeň na 55 C, Lyzační pufr a Proteinázu K 3. Do zkumavky s ocáskem napipetovat 0,5 ml Lyzačního pufru a 35 µl ProteinázyK 4. Vortex a vložit do vodní lázně při teplotě 65 C 5. Inkubace ve vodní lázni minimálně 12 hod. 24

6. Po 12 hod. inkubaci napipetovat do zkumavky 0,5 ml fenolu ph 8 7. Vortex a následná chlazená centrifugace při 12 13 000 rpm po dobu 5 min. 8. Odebrat supernatant a přenést jej do nové 1,5 ml Epp. zkumavky 9. K supernatantu nepipetovat 0,2 ml Chloroformu a 0,2 ml fenolu ph 8 10. Vortex a 5 min. chlazená centrifugace při 12 13 000 rpm 11. Opět odebrat supernatant a přenést do nové 1,5 ml Epp. zkumavky 12. Napipetovat 0,5 ml etanolu a 50 µl 4 M acetátu sodného ph 6 13. Inkubace v 20 C po dobu 1 hod. Po hodinové inkubaci zkumavku centrifugovat (5 min.) při 12 13 000 rpm a odsát supernatant a zbylý centrifugovaný pelet z DNA ponechat. 14. Napipetovat 0,8 1 ml 70% etanolu a centrifugovat (5 min.) při 13 000 rpm 15. Znovu odsát supernatant a ponechat centrifugovaný pelet s DNA 16. Vložit do točícího vakua a inkubovat po dobu 15 min. 17. Po inkubaci v točivém vakuu, přidat do zkumavky 100 200 µl dienizované vody (dh 2 O) 18. Konečná 15 minutová inkubace v termostatu při 65 C Z měření koncentrace DNA pomocí spektrofotometru Odhadovaný čas: 14 hodin Tato izolace DNA z myšího ocásku je osvědčená metoda používaná ve výzkumných laboratořích. Jde sice o pracnou a časovou záležitost, ale výsledkem je čistá DNA s výtěžností 30 110 ng/µl v objemu 100 200 µl. 25

PRAKTICKÁ ČÁST 9 Charakter nové metody qpcr Pro stanovení DNA metodou PCR se často používá izolovaná DNA z lidské krve. Tato metoda se využívá v celé řadě diagnostických stanovení jako například určování přítomnosti mutantních genů (především v onkologii), detekce virových a bakteriálních infekcí a určování otcovství. Kromě určování přítomnosti genu (kvalitativní testy) je možné stanovit také počet kopií studovaného genu metodou kvantitativní PCR. Problémem při řadě těchto stanovení je nutnost izolace DNA z krve, která představuje časovou i finanční zátěž. Amplifikace DNA přímo z krve s využitím běžných metod PCR není možná, neboť krev obsahuje řadu komponent, které inhibují PCR. Jedná se především o imunoglobuliny a hemoglobin, které inhibují amplifikační reakci i v malých množstvích. Hlavním cílem této práce bylo navržení nové metody qpcr genotypizace z periferní lidské krve. V práci byl využit nový poznatek, že krevní inhibitory PCR je možné blokovat, pokud se do reakční směsi přidají aditiva typu trehalózy [Horáková et al., 2011, 3.]. V práci bylo optimalizováno složení reakční směsi pro PCR (přidání různých koncentrací trehalózy a dalších aditiv, tetraalkylammonium chlorid [Kovářova and Dráber, 2000; Shaik et al., 2008, 4.]. Navíc bylo zjištěno, jaké množství celé krve PCR toleruje a jaké jsou optimální antikoagulační látky (heparin, EDTA, citrát sodný). Součástí práce bylo i zjištování kompatibility reakčních směsí s qpcr kde narůstá problém s působením inhibitorů (především hemoglobinu) nejen na vlastní amplifikační reakci, ale také na detekci fluorescenčních DNA barviv typu SYBR green I. Konečná práce byla zaměřena na ověření použitelnosti této metody při detekci a genotypizaci jednobodových mutací pro Faktor V Leiden a Faktor II Protrombin (Hereditární trombofilie) způsobující tromboembolické onemocnění. 1. Kompatibilita reakčních směsí pro qpcr 2. Použitelnost metody pro laboratorní účely 26

3. Použitelnost metody při detekci a genotypizaci mutací Faktoru V Leidenu a Faktoru II Protrombinu u Hereditární trombofilie z celé krve 4. Příkladné kazuistiky pacientů s tromboembolickým onemocněním 9.1 Odběr krve a následná kompatibilita reakčních směsí qpcr Odběr krve byl proveden u třech dobrovolných dárců v ordinaci MUDr. Steppanové v areálu Akademie Věd ČR v Praze. Odběr jsem provedl ze střední kubitální žíly (v. mediana cubiti) za účasti zdravotní sestry, krev byla dělena do tří odběrových zkumavek typu SARSTEDT Monovette EDTA K (2,7 ml), Coagulation s Citrátem sodným (3 ml), zkumavky s přídavkem Heparinu 10 µl/1 ml krve (5 mj) v celkovém objemu 3 ml krve/15 mj. Heparinu a zkumavky Serum Gel (7,5 ml) pro sérum z krve. Následně proveden vortex a rozplnění do předem připravených PCR zkumavek po 200 µl v každé znich. Od každého typu PCR zkumavek bylo umístěno do + 4 C k přímému testování a zbylé pcr zkumavky byly umístěny do 70 C pro další možné testování. U kompatibility jsem srovnával reakční pufr PP Plain, který řada z klinických laboratoří využívá díky svým aditivům umožňující přímou elektoforézu a nově navržený T04P2 SG (Sybr green) pufr. Také jsem použil odlišné primery bohaté na oblasti GC lidského genu. PP Plain SG (Sybr green) byl ve složení 2 x koncentrovaný: 150 mm Tris HCl, ph 8,8 (25 o C), 40 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 µm datp, 400 µm dctp, 400 µm dgtp, 400 µm dttp, 100 U/ml Taq DNA polymerázy, stabilizátory a aditiva. Nově navržený pufr T04P2 2 x koncentrovaný: 20 mm Tris HCl, ph 8,8 (21 C), 10 mm KCl, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 2 mm MgSO 4, 0,1 % Triton X 100, 200 µl dntps, 25 U/ml Taq DNA polymerázy, 22 nm anti Taq mab. První set primerů s označením RET GC f:cccgcactgagctcctacac 94 C (5 min.), RET GC primer r: GGACGTCGCCTTCGCCATCG 94 C (30 sek.), 60 C (30 sek.), 72 C (45 sek.) x 40 cycles 72 C (5 min.) [Horáková et al., 2011, 3.]. Druhý set primerů GC 71,5%: f GGTCGCCGACATCCACTC/r TGCTCCGGGAACAGAACCT. Periferní lidskou krev jsem použil od dárců v antikoagulacii Heparin. 27

Vyhodnocení: Experimenty dokládají, že bez přidání PCR enhanceru betain spolu s trehalosou a propandiolem je výsledná reakce negativní, pouze při vyšší koncentraci betainu (1,5M) je signál na elektroforézním gelu a vícekrát ředěná krev min. 2 x 5 x ředění. Avšak u zobrazení C T křivek v jednotlivých cyklech qpcr byly signály negativní. Naopak u T04P2 SG pufru, PCR produkty aktivní již v nižších koncentracích krve (7,5, 5, 2,5%) bez přidání betainu. Po přidání různě ředěného betainu (0,5, 1, 1,5M) se zvýšila finální koncentrace krve. U zobrazení C T křivek na qpcr byla zobrazena stupnice stability krve. Jako výsledek kompatibility PCR mixů mohu doporučit pouze T04P2 pufr s PCR enhancery 0,5M betain, 0,4M trehalosou, 0,2M propandiolem s použitím 5, 2 a 1% krve tj. ředění 2 x, 4x, 10x obr. 1 Obr. 1 (vlastní) elektroforézní gely A B 5% 2,5% 10% F. 7,5% 5% 2,5% 0 0,5 1 1,5 0 0,5 1 1,5 M 0 0,5 1 1,5 0 0,5 1 1,5 0 0,5 1 1,5 0 0,5 1 1,5 M Betain PP Plain pufr T04P2 pufr Obr. 1 2 % eletroforézní gely v 1 x TBE. A. Elektroforézní gel zobrazuje využití komerčního master mixu PP Plain s přidáním různě ředěného betainu 0 1,5 M (molární) a s koncentrací 5 2,5 %periferní lidské krve. B. Elektroforézní gel zobrazuje využití T04P2 master mixu s různě ředěným betainem 0 1,5 M a stupnici ředění periferní lidské krve od 2,5 do 10 %. M = marker, který určuje molekulová hmotnost fragmentů (490 kda kilodaltonů). 9.2 Nová metoda qpcr pro laboratorní účely 9.2.1 Srovnání antikoagulancií v metodách qpcr a PCR EDTA K draselná sůl kyseliny etylendiamintetraoctové je antikoagulační činidlo, které váže vápenaté ionty a tím blokuje kaogulační kaskádu. Ve zkumavkách typu EDTA K2 jsou erytrocyty, leukocyty a trombocyty stabilní po dobu 24 hodin od odběru. Tyto zkumavky se používají pro molekulárně biologické testy z plné krve. 28

Citrát sodný obvykle označuje sůl kyseliny citronové se třemi sodíkovými atomy v molekule (citronan (tri)sodný, C 6 H 5 Na 3 O 7 ). Používá se pro zabránění hemokoagulace v podmínkách in vitro. Heparin je antikoagulační činidlo, které aktivuje antitrombiny (AT), čímž blokuje koagulační kaskádu, takže nevznikne krevní sraženina a sérum, ale plná nesrážlivá krev. Existují tři základní druhy heparinu tj. lithný, amonný a sodný. AT antitrombiny látky, které na různých úrovních (inaktivace trombinu) tlumí krevní sražení koagulaci. Testy provedeny na termocykléru zn. Real plex Eppendorf a vyhodnoceny pomocí výpočtu C T, křivky tání a elektorforézního gelu pod UV světlem. Stanoven reakční objem 25 µl. T04P2 SG (Sybr Green) 12,5 µl, 0,8 µl RET GC_gcr primer, 1,7 µl PCR voda, 7,5 µl, (ne)přidání 5M Betainu (různě ředěného) a 2,5µl krve s antikoagulanciem Heparin (22,5 mj.), EDTA K, Citrát sodný ve finální a ředěné koncentraci 10, 5, 2,5% krve. Nastavení teplot v cykléru: 95 C denaturační fáze po dobu 10 min., 94 C 15 sek., 56 C 15 sek. a 72 C 2 min. v počtu 40 cyklů (kvantifikační fáze), konečná fáze křivka tání. Vyhodnocení: Stabilita u antikoagulancií Heparinu, EDTA K a Citrátu sodného pro účely qpcr bylo zjištěno, že lze využít EDTU K a Citrát sodný pouze při max. 2% finální koncentraci krve, nejlépe však u 1 0,5% koncetraci. Hodnoty fluorescence (C T ) byly srovnatelné u obouch studovaných antikoagulancií s pozitivními fragmenty na elektroforézním gelu. Při použití heparinu byly však pozitivní fragmenty pouze u 2,5% ředěné krve. Avšak přidáním PCR enhanceru betain s koncentrací 0,5 1 M PCR reakci zlepšilo (pozitivní PCR produkt u 10% konc. krve), ale snížilo kvantitativní PCR reakci důsledkem vyššího objemu hemoglobinu v krvi. Závěrem lze říct, že u stability testovaných antikoagulancií pomocí izolace DNA je možno využít všechny dosavadní testované antikoagulancia s periferní lidskou krví ředěnou 5 až 10 x. 29

9.2.2 Použitelnost periferní krve pro genotypizaci laboratorních myší Laboratorní myši 4.1 KO x Bl.6, PAG x Bl.6 a NTAL x Bl.6 s typem genu wildtype WT divoká alela, která se běžně vyskytuje v populaci a podmiňuje normální fenotypový znak v diploidní buňce (obr. 2). Krev odebrána z v. facialis pomocí metody odběru krve Goldenrod Animal Lacent. U těchto testů jsem užil antikoagulancium Heparin při odběru 2,5 U / 250 µl krve. Krev byla dále zpracována a ředěna ve fyziologickém roztoku (FR) v poměru 1:3, 1:7 a 1:15. Reakční objem master mixu stanoven na 24 µl pro dané primery WT. T04P2 SG. 12,5 µl, 0,25 µl Exon 4R/4F, 2 µl PAG 1, 1 µl PAG Zeo, 0,25 µl 344/345 a 11/8,5 µl pcr H 2 O. Nastavení teplot v cykléru DYAD: 95 C denaturační fáze po dobu 10 min., 94 C 15 sek., 56 C 30 sek. a 72 C 1 min. v počtu 40 cyklů (kvantifikační fáze). Obr. 2 (vlastní) genotypizace laboratorních myší A B C 4x 8x 16x D M 4x 8x 16x D M 4x 8x 16x D M 4.1 KO x Bl.6 PAG KO x Bl.6 NTAL KO x Bl.6 Obr. 2 1 % elektroforézní gel v 1 x TBE. A. Použití primerů pro kmen myší 4.1 KO x Bl.6 s ředěním periferní myší krve 4 16 x + kontrolní vzorek DNA (D) vy izolované z myšího ocásku kmene myši. B. Použití primerů pro kmen PAG KO x Bl.6 s ředěním periferní myší krve 4 16 x + kontrolní vzorek DNA (D) vy izolované z myšího ocásku kmene myši. C. Použití primerů pro kmen myší NTAL KO x Bl.6 s ředěním periferní myší krve 4 16 x + kontrolní vzorek DNA (D) vy izolované z myšího ocásku kmene myši. Vyhodnocení: Výsledky dokládají, že nová metoda qpcr z periferní krve je použitelná pro laboratorní účely v oblasti genotypizace laboratorních myší. Srovnatelná s metodou izolace DNA z ocásků a tkání. Ovšem za přispění master mixu T04P2 a zvýšení doby denaturačního cyklu s teplotou 95 C. Přispění této metody se zkrátí čas pro vyhodnocení zkoumaného genotypu (odbourání přípravy DNA) a zamezí se stresový faktor u laboratorních myší. 30

10 Použitelnost nové metody qpcr u analýz dědičných mutacích Hereditární trombofilie 10.1 Detekce primerů, genotypizace, použitelnost X % krve ve vzorku Pro tento test jsem použil vybrané zástupce pacientů s mutacemi i bez rizikových faktorů V Leiden a II Protrombin. Krev odebraná z v. m. cubity separovaná do 2,7 ml SARSTEDT Monovette EDTA K zkumavky. Krev byla zamražena v 70 C, pro protokol experimentu byla krev ředěna 1:7 (jeden díl krve a sedm dílů vody). Byly zakoupeny šestice primerů podle článku [Endler G. 2001, č. 5] k detekci a genotypizaci genů pro mutaci Faktoru V Leidenu a Faktoru II Protrombin od firmy Generi Biotech, naředěny na požadovanou koncentraci 100pmol/µl (0,1µM/µl) viz Tab. 4., zamraženy v 20 C. Sestava protokolu: Reakční objem 5 x 25µl 5 x PCR reakce pro každý genotyp zvlášt. T04P2 SG/ PlainPP SG 12,5µl, 0,1µl FV506R (1pmol/25µl), 0,1µl FV506Q (1pmol/25µl), 0,125µl FVcommon (1,25pmol/25µl), 0,05µl FII20210G (5pmol/25µl), 0,2µl FII20210A (20pmol/25µl), 0,2µl FIIcommon (20pmol/25µl), 10,725/11,25/11,05µl pcr voda a 1µl krve s antikoagulanciem EDTA K. Z předešlých PCR testů (viz kapitola 9.2.1 Srovnání antikoagulancií v metodách qpcr a PCR) bylo zjištěno, že krev s EDTA K se musí minimálně 5 až 10 x ředit ve finální koncentraci. Pro tento test byla finální koncentrace krve 1:7. Nastavení teplot v cykléru Roto Gene Q: 95 C denaturační fáze po dobu 10 min., 94 C 20 sek., 54 C 30 sek. a 72 C 1 min. v počtu 35 cyklů (kvantifikační fáze), konečná fáze křivka tání 94 C 72 C 10 sek. Cílem experimentu bylo ověření nově zakoupených primerů a srovnání tří zástupců pacientů s mutací a bez mutace faktoru V Leiden a dvou zástupců faktoru II protrombinu. Obr. 3 Tab. 4 Sekvence primerů, PCR produkt a koncentrace primerů pro detekci mutací FVL a Protrombinu Mutace/alela Sekvence primerů PCR produkt Koncentrace FV506R / 1691G 5 AACAAGGACAAAATACCTGTATTCATC 3 233 kda 1 pmol/25µl / 2 pmol/50µl FV506Q / 1691A 5 GTCTGTCTGTCTCTTTCAAGGACAAAATACC 3 246 kda 1pmol/25µl / 2 pmol/50µl FVcommon 5 CGCAGGAACAACACCATGAT 3 1,25pmol/25µl / 2,5 pmol/50µl FII20210G / 20210G 5 CACTGGGAGCATTGAGGCGC 3 180 kda 5pmol/25µl / 10 pmol/50µl 31

FII20210A / 20210A 5 ATGAATAGTAATGGGAGCATTGAGGATT 3 209 kda 20pmol/25µl / 40 pmol/50µl FIIcommon 5 ATGTGTTCCGCCTGAAGAAGTGGA 3 20pmol/25µl / 40 pmol/50µl Vyhodnocení: Výsledky dokládají, že sestava zakoupených primerů od firmy Generi Biotech je vhodná pro detekci a genotypizaci mutací faktorů V Leiden a II Protrombinu při spuštění klasické PCR metody a vyhodnocení eletroforézním gelem. Tato kombinace navržených primerů podle článku [Endler G. et al. 2001, č. 5] může být použita i k vědeckému výzkumu v monitoringu 2D elektroforézních agarových gelů, avšak pro svoji časovou délku není vhodná pro lékařské nebo laboratorní vyšetření. V lékařském a laboratorním vyšetření se usvědčila metoda qpcr viz kapitola 10.2 a 10.3. Obr. 3 (vlastní) Detekce mutací FVL a FII Protrombinu A B C D E 233 kda 246 kda 209 kda 180 kda N Mt N Mt N Mt N Mt N Mt FV 1691G FV 1691A FV 1691G>A PT 20210G PT 20210G>A Obr. 3. Elektroforézní gel 2% v 0,5 x TBE. A. Přirozený homozygot FV 1691G (N: wild type alela 233 kda). B. Homozygot mutant FV 1691A (Mt: mutanční alela 246 kda). C. Heterozygot mutant 1691G>A (N: wild type alela 233 kda, Mt: mutanční alela 246 kda). D. Přirozený homozygot PT G20210G (N: wild type alela 180 kda). E. Heterozygot mutant PT G20210G>A (N: wild type alela 180 kda, Mt: mutanční alela 209 kda). Amplifikační křivky viz. Obr. 9 A, B, C, obr. 10 A, B. 10.2 Detekce a genotypizace jednobodové mutace 1691G>A lidského genu pro FV Leidenská mutace Krev odebrána od 40 pacientů z KNL, a. s., odd. Klinické biochemie. Odběr proveden z cubitální žíly (v. m. cubita) do EDTA K3 zkumavek o objemu 3 ml v období mezi březnem až červnem 2011. Odd. Klinické biochemie provedlo analýzu pomocí kapilárních setů pro určení mutace Faktoru V Leidenu. Z 67% se amplifikační kapiláry 32

hojně využívají v klinických laboratořích za pomocí reakčních kitů (př. Factor V Leiden kit). Analýza se provádí podle křivek tání. Metoda však využívá izolaci DNA z periferní krve, čož má za následek finanční a časovou náročnost. Předáno celkem 31 vzorků kreve pro WT mutaci (1691G), 8 vzorků pro Hz. mutaci (1691G>A) a 1 vzorek pro MUT mutaci (1691A). Krev uchována na suchém ledu a převezena do laboratoře odd. Signální transdukce, ÚMG AV ČR, v.v.i. v Praze, kde jsem provedl srovnávací testy. Sestava protokolu: Reakční objem 2 x 25µl 2 x PCR reakce pro každý genotyp zvlášt. T04P2 SG 12,5µl, 0,1µl FV506R (1pmol/25µl), 0,1µl FV506Q (1pmol/25µl), 0,15µl FVcommon (1,5pmol/25µl), 11,25 µl pcr voda a 1µl krve. Krev ředěna 8 x tj. finální koncentrace 0,5%. Nastavení teplot v cykléru ROCHE Ligthcycler 480: 95 C denaturační fáze po dobu 10 minut, 94 C 20 sek., 54 C 30 sek. a 72 C 1 minuta v počtu 35 cyklů (kvantifikační fáze), konečná fáze křivka tání 94 C 10 sek., 40 C 10 sek. a 85 C měření intenzity fluorescence. Cíl tohoto protokolu stanoven na srovnání této metody s metodou kapilárních setů. Vyhodnocení: Test vyhodnocen podle amplifikačních křivek (C P ) oproti křivkám tání (T M ) v cykléru ROCHE LigthCycler 480**, jelikož tato metoda neumožňuje vyhodnocení křivek tání v důsledku fluorescenčně specifických hybridizačních sond, které hybridizují s mutovanou sekvencí (mutovaná a wild tipe alela se od sebe liší různou teplotou křivky tání a intenzitou fluorescence), **ale využívám sekvenčně nespecifické detekce na odlišné mobilitě molekul DNA (odlišení heterozygotů od homozygotů) lišící se odlišnou intenzitou fluorescence viz obr. 4 A, B, C. V příkladu lze říct, že krev, která má obě specifické alely Faktoru V Leidenu se naváží na primery FV FV506R G a FV506Q A, tím vznikne dvojí nárůst fluorescence alel 1691G>A, obr. 4 C, pokud krev obsahuje pouze alelu 1691G je nárůst fluorescence pouze u této alely a u alely značící mutaci 1691A je nárůst negativní obr. 4 A. V opačném případě při mutaci genu je nárůst fluorescence u alely značící mutaci 1691A, obr. 4 B, wild tipe alela je negativní. 33

V příloze 2 jsou zobrazeny amplifikační křivky testovaných pacientů (31 přirozených homozygotů (WT), 8 heterozygotů (Hz.) a jeden mutantní homozygot (MUT) = 40 vzorků). Srovnání těchto výsledků s metodou pomocí amplifikačních kapilár používaných v KNL, a. s. na odd. Klinické biochemie je odlišná díky časové nenáročnosti, přípravě vzorků k detekci bez izolace DNA z periferní krve, která je finančně zatěžující. Obr. 4 (vlastní) Amplifikační křivky mutace Faktoru V Leidenu A B C 1691G 1691A 1691G>A 1691A 1691G Obr. 5 A zobrazuje wild tipe alelu (přirozený homozygot) 1691G s fluorescenčním nárůstem 26,48 C 1,79. B mutantní alelu 1691A s fluorescenčním nárůstem 26,23. C specifická alela 1691G>A značící heterozygota 28,14 C 29,66 C. 10.3 Detekce a genotypizace jednobodové mutace 20210G>A lidského genu pro FII Protrombin Krev použita ze stejných vzorků pacientů z KNL, a. s., odd. Klinické biochemie, jako při analýze Faktoru V Leidenu viz kapitola 10.2 Analýza z KNL, a. s. byla provedena s výsledky 37 vzorků kreve pro WT mutaci (20210G) a 3 vzorky pro Hz. mutaci (20210G>A). Sestava protokolu: Reakční objem 2 x 25µl 2 x PCR reakce pro každý genotyp zvlášt. T04P2 SG 12,5µl, 0,05µl FII20210G (5pmol/25µl), 0,2µl FII20210A (20pmol/25µl), 0,2µl FIIcommon (20pmol/25µl), 11,25 µl pcr voda a 1µl krve. Krev ředěna 8 x tj. finální koncentrace 0,5%. Nastavení teplot v cykléru ROCHE Ligthcycler 480: 95 C denaturační fáze po dobu 10 minut, 94 C 20 sek., 54 C 30 sek. a 72 C 1 minuta v počtu 35 cyklů (kvantifikační fáze), konečná fáze křivka tání 94 C 10 sek., 40 C 10 sek. a 85 C měření intenzity fluorescence. Cíl tohoto protokolu byl stanoven na srovnání této metody s metodou kapilárních setů. 34