Kapilární elektroforéza ve spojení s MS Spojení CE/MS - s pomocnou kapalinou - s kapalinovým spojem - bez pomocné kapaliny Spojení CE a MS Problémy spojení kapilární zónové elektroforézy a MS: - nekompatibilita separačních pufrů s MS (snižování signálu, kontaminace iont. zdroje) - vzájemné ovlivňování separačního napětí a sprejovacího napětí iontového zdroje (výhodou je zdroj, kde je na sprejovací kapiláře 0 V a napětí se vkládá na protielektrodu) - velmi nízké průtoky v CE omezení ve výběru iontových zdrojů (jen nano a mikro-esi; další iontové zdroje na úkor ředění pomocnou kapalinou -průtoky CE jsou dány EOF, který velmi závisí na ph* spojení CE a MS mezičlen s pomocnou kapalinou sheath-flow, liquid junction mezičlen bez pomocné kapaliny - sheathless Příklad: Separační napětí 27 kv, kapilára 75 cm x 50 m. EOF při ph 2,5 = 0.04 L/min. EOF při ph 9,0 = 0.21 L/min.
Mezičlen s pomocnou kapalinou sheath flow Nejčastěji používané typy mezičlenů pro CE-MS. Pomocná kapalina (sheath flow) proudí koaxiálně s koncem separační kapiláry a je na ní vloženo sprejovací napětí. Tento způsob umožňuje úpravu složení sprejovací kapaliny a tím překonání problémů s kompatibilitou. Citlivost je nižší než u řešení bez pomocné kapaliny, neboť dochází ke zředění zón. Výhodou je však robustnost mezičlenu a vysoká účinnost ionizace. Mezičlen s pomocnou kapalinou liquid junction Pomocná kapalina je pod tlakem dodávána pomocí rezervoáru v místě přerušení separační kapiláry. V rezervoáru je elektroda pro sprejovací i separační napětí. Citlivost je nižší než u řešení bez pomocné kapaliny, neboť dochází ke zředění zón. Výhodou je však robustnost mezičlenu a vysoká účinnost ionizace. Obrázek Chem. Listy 107, 949 (2013)
Mezičlen bez pomocné kapaliny sheathless Původní řešení spojení CE-MS. Začíná se znovu používat z důvodu vyšší citlivosti. Sprejovací napětí je vloženo na konec separační kapiláry. Zóny analytu nejsou zřeďovány a zachovává se tak rozlišení a koncentrace analytu. Nevýhodou je nutnost plné kompatibility separačního pufru s MS. Pracuje při velmi nízkých průtocích danými EOF (nl/min). Volba podmínek pro experimenty Podmínky analýzy Kapalné mobilní fáze rozpouštědla, aditiva, ph, průtok, dopant pro APPI Kompatibilita separačních systémů s MS Podmínky pro GC/MS Nastavitelné parametry iontových zdrojů Nečistoty, signál pozadí, matriční efekty Rutinní provoz přístrojů Obrázek: www.jantoo.com
Vhodné podmínky pro analýzu Podmínky, které zaručí optimální separaci v chromatografickém systému a zároveň optimální ionizaci (citlivost detekce hmotnostním detektorem). Podmínky pro LC(CE) a MS se mohou značně lišit a je nutno mezi nimi najít vhodný kompromis. To, co musí být kompatibilní, je mobilní fáze: složení (rozpouštědla, obsah solí, ph) a průtok Požadavky na kapalné mobilní fáze: - rozpouští analyty a umožňuje jejich chromatografickou separaci - snadno se zmlžuje, odpařuje, má nízkou solvatační energii -umožňuje ionizaci analytu - neposkytuje intenzivní signál pozadí - nekontaminuje a nezahlcuje iontový zdroj Kapalné mobilní fáze rozpouštědla ESI, Nano-ESI rozpouštědla, která podporují vznik iontů v roztoku, polárnější rozpouštědla voda, methanol, acetonitril, ethanol, tetrahydrofuran APCI, APPI rozpouštědla, která podporují přenos protonu v plynné fázi, polární i méně polární rozpouštědla voda, methanol, acetonitril, 2-propanol, aceton, chloroform, toluen, hexan
Kapalné mobilní fáze aditiva Pufry, ion-párová činidla apod. je lépe nepoužívat, případně v co nejnižších koncentracích. Aditiva by měla být těkavá. Vhodná aditiva: kyselina mravenčí,kyselina octová amoniak octan amonný, mravenčan ammoný uhličitan amonný Nevhodná aditiva: minerální kyseliny (fosforečná, sírová) alkalické hydroxidy, kvartérní amoniové báze, fosfátové pufry, TRIS pufry detergenty (např. SDS) Kapalné mobilní fáze aditiva a geometrie sprejování V případě použití vysoké koncentrace netěkavých solí v mobilní fázi klesá účinnost ionizace, zejména u zdrojů s geometrií v ose. Jiná uspořádání zajišťují větší robustnost.
Kapalné mobilní fáze ph Elektrosprej: bazické látky - detekce pozitivně nabitých iontů (MF kyselá, ph aspoň 2 jednotky pod pka) kyselé látky - detekce negativně nabitých iontů (MF bazická, ph aspoň 2 jednotky nad pka) Odezva (účinnost ionizace) je závislá na ph mobilní fáze. Pro techniky, které vyžadují jako první krok odpaření (APCI, TS, PB) je výhodnější, pokud je analyt neutrální (vyšší těkavost). Pro ESI je výhodnější, aby byla látka v roztoku ionizována (desorpce iontu). Pokud se optimální ph pro separaci liší od optima pro detekci, je možná pokolonová úprava ph. Kapalné mobilní fáze ph ESI spektra 2 -microglobulinu (11860.4 Da) ph 6.0: nedenaturující podmínky, protein ve sbaleném stavu, méně míst pro protonizaci ph 2.4: denaturující podmínky, protein v rozbaleném stavu, více aktivních center pro protonizaci, vyšší protonizace v nízkém ph DOI: 10.1039/B417724J
APPI: role dopantu Přímá fotoionizace analytu (M) v APPI je většinou málo účinná -> pro zvýšení signálu se používá dopant (D) D + hv D + + e - M + D + M + + D fotoionizace dopantu IE D < energie fotonu charge exchange, výměna náboje; IE M < IE D v přítomnosti protického rozpouštědla (solvent S) se tvoří protonované molekuly D + + n S (D-H) + S n H + M + S n H + [M+H] + proton transfer, výměna protonu; PA S > PA D PA M > PA S Dopanty: aceton, chlorbenzen, toluen, anisol Kr 10.6 ev Kapalné mobilní fáze - průtok Odezva (účinnost ionizace) je závislá i na průtoku mobilní fáze. Různé iontové zdroje pracují optimálně jen v určitém rozmezí průtoků: velmi nízké průtoky (nl/min, jednotky L/min): nanoelektrosprej nízké průtoky (desítky až stovky L/min): elektrosprej střední průtoky (do 1 ml/min): elektrosprej, APCI, APPI vysoké průtoky (do 2,5 ml/min): APCI, APPI Rozměry kolony je vhodné přizpůsobit optimu použitého iontového zdroje. Alternativně je možno splitovat (dělit tok) část analytu jde do odpadu- nebo zvýšit průtok pomocnou kapalinou zředění chromatografických zón
Kompatibilita separačních systémů s MS Reverzní chromatografie, RP-HPLC vodně-organické nebo organické mobilní fáze, nízké koncentrace těkavých pufrů, ph většinou 2-8 velmi dobrá kompatibilita s ESI (nanoesi), APCI, APPI Normální chromatografie NP-HPLC organické mobilní fáze bez pufrů a úpravy ph většinou dobrá kompatibilita s APCI a APPI Iontově párová chromatografie vodně-organické nebo organické mobilní fáze s přídavkem iontověpárového činidla omezená kompatibilita s ESI, iontově-párové činidlo potlačuje signál (nejsou volné ionty). Pokud je tento separační systém nezbytný, pak lze použít trialkylamonium acetát (pro anionty) nebo perfluorované karboxylové kyseliny (pro kationty). Podmínky pro GC/MS Mobilní fáze v GC je velmi dobře kompatibilní s MS detekcí (EI/CI) - nosný plyn He (lepší čerpání vakua, inertní) -průtoky ~ 1 ml/min Zpoždění sběru dat ( solvent delay ) iontový zdroj (filament) se zapíná až po eluci píku solventu (zabrání se poškození filamentu) další podmínky pro GC/MS analýzu stejné jako u GC s ostatními typy detektorů - čištění iontového zdroje, výměna oleje v rotační pumpě
Nastavitelné parametry iontových zdrojů ESI: průtoky nebulizačního a sušícího plynu kvalita a stabilita spreje, účinnost desolvatace napětí na sprejovací kapiláře ovlivňuje sprej a účinnost ionizace, polarita podle sledovaných iontů (pozitivní nebo negativní) napětí na prvcích iontové optiky ve zdroji fokusace iontů, in-source fragmentace. APCI: průtoky nebulizačního a sušícího plynu kvalita a stabilita spreje, účinnost desolvatace teplota odpařovače -účinnost desolvatace napětí (proud) pro koronový výboj ovlivňuje účinnost ionizace, polarita podle sledovaných iontů (pozitivní nebo negativní) napětí na prvcích iontové optiky ve zdroji fokusace iontů, in-source fragmentace. EI: napětí na prvcích iontové optiky fokusace iontů Ladění přístroje Nastavení iontové optiky a dalších parametrů přístroje tak, aby se získal za daných podmínek maximální signál (poměr S/N) pro daný analyt. Sleduje se i tvar signálu (symetrie píku, rozlišení apod.) Ladit je možno ručně po jednotlivých parametrech nebo automaticky (dle možností ovládacího softwaru). Kalibrace hmotnostní škály spektrometru Hmotnostní škálu spektrometru je nutné kalibrovat. Kalibrace se provádí ze změřeného spektra směsi látek se známými poměry m/z. Kalibrační směsi: Spektrum kalibrační směsi obsahující kofein, peptid MRFA a Ultramark 1621 (Thermo Finnigan). polyethylenglykoly klastry NaI, CsI směsi peptidů Ultramark TM (fluorované fosfazeny) komerční směsi PFK pro EI
Nečistoty, signál pozadí, matriční efekty Pro LC/MS měření je důležité používat velmi čisté chemikálie. Rozpouštědla (MF) by měla být uchovávána ve skle. Pozor na kontaminaci změkčovadly z plastů (plastové nádobí, hadičky, rukavice), krémů na ruce apod. Běžné kontaminanty: ftaláty, sebakáty, adipáty, fenylfosfáty, silikony, polyethylenglykoly O OH + O Ion m/z 149 typický pro ftaláty Polyethylenglykoly z laboratorních latexových rukavic Provoz přístrojů Požadavky na laboratoř: - stálá teplota (klimatizace) - odtah par z vakuového systému (a zdroje) - stabilní napájení (záložní zdroje UPS) - zdroj zmlžovacího plynu (dusík) vysoké čistoty pro API zdroje -z tlakové lahve (~1 TL na 1 den) - generátor dusíku - tank na kapalný dusík s odpařovačem - zdroj kolizního plynu (Ar pro QQQ, He pro IT) vysoké čistoty - z tlakové lahve -příprava velmi čisté vody pro MF, případně destilovna rozpouštědel
Provoz přístrojů Pravidelné činnosti a údržba - kalibrace hmotnostní škály - čištění iontového zdroje, optiky (analyzátoru) - výměna oleje v rotační pumpě, filtrů v generátoru N 2 - údržba datasystému Přehled intrumentace Výrobci přístrojů Ceny přístrojů Systémy LC/MS v ČR
Přehled významných výrobců Výrobce Q QqQ IT Lin IT TOF QqTOF IT TOF sektor Orbitrap ICR Agilent x x x x x AB SCIEX x x x x x Bruker x x x x x x Jeol x x x Leco x x Shimadzu x x x Thermo x x x x x x x Waters x x x x x Orientační ceny MS instrumentace (2012)
Instrumentace Agilent 6300 Series 3D iontová past Synapt -ion mobility trojitý kvadrupól- TOF Bruker maxis Q-TOF LTQ Orbitrap iontová past-orbitrap Pegasus 4d GCxGC -TOF AB 4000 Q TRAP trojitý kvadrupól iontová past Kolik hmotnostních spektrometrů je v ČR? ~ 600 Hmotnostních spektrometrů v ČR Počet instalací do roku 2013: LC/MS: 315 GC/MS: 233 ostatní (MALDI-MS, ICP-MS atd.: 100 1 spektrometr/ 17 tis. obyvatel 1 spektrometr/ 130 km 2 Podklady: M. Holčapek, zástupci firem
LC/MS systémy v ČR Počty přístrojů v roce 2012 (celkem 272). Zdroj: M.Holčapek, Škola MS Aplikace MS detekce v separačních metodách
Forenzní analýza: benzodiazepiny ve vlasech Příprava vzorku - dekontaminace vzorku v isooktanu - sušení, mletí -přídavek vnitřního standardu - sonikace, inkubace v pufru 12 hodin - extrakce org. rozpouštědly delorazepam HPLC/MS: - kolona Luna C18 (150 1 mm, 5 μm), 40 C - gradientová eluce, průtok 100 μl/min. A: 0.1% kyselina mravenčí ve vodě B: 0.1% kyselina mravenčí v acetonitrilu - detekce HRMS ESI, orbitrap nordiazepam Anal Bioanal Chem (2011) 400:51 67 Forenzní analýza: benzodiazepiny ve vlasech -současná identifikace a kvantifikace 28 benzodiazepinů - 50 mg vzorku koncentrace ve vlasech: - kvantifikační limity 1-10 pg/mg až 1 600 pg/mg - linearita do 1 000 pg/mg Anal Bioanal Chem (2011) 400:51 67
Analýza potravin: mykotoxiny v potravinách Příprava vzorku -přídavek vnitřního standardu - extrakce v acetonitrilu/vodě/k. octové - centrifugace, naředění mobilní fází Aflatoxin B1 HPLC/MS: - kolona Gemini C18 150 4.6 mm, 5-μm částice, 25 C -předkolona C18 4 3 m. - gradientová eluce, 1 ml/min A: methanol/voda/k. octová 10:89:1, 5 mm octan amonný B: methanol/voda/k. octová 97:2:1, 5 mm octan amonný - detekce ESI-MS/MS (MRM) na Q-trap 4000 Aflatoxin G1 Anal Bioanal Chem (2007) 389:1505 Analýza potravin: mykotoxiny v potravinách - metoda pro 87 analytů v plesnivých potravinách - limity detekce 0.02-225 μg/kg - nalezeno 37 fungálních metabolitů koncentrace: až 33 mg/kg potraviny Anal Bioanal Chem (2007) 389:1505
Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách Příprava vzorku - filtrace vody - ředění v případě vody z ČOV Estron HPLC/MS: - kolona Acclaim PA2, 3 um, 3x150 mm (stabilní ve 100% vodě) - gradientová eluce, 0.2 ml/min A: acetonitril B: 1 amoniak ve vodě - detekce ESI-MS/MS (QqQ) Estradiol Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9 Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách - prekoncentrace analytů na SPE koloně IonPac NG1, 4x35 mm, 2.5 ml vzorku - odstranění nečistot (30% acetonitril ve vodě) - vypláchnutí mobilní fází, separace na analytické koloně - regenerace SPE kolony (90% acetonitril ve vodě) Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9
Environmentální analýza: hormonálně aktivní látky ve vodách -plně automatická metoda pro on-line SPE prekoncentraci - kvantifikace 5 estrogenů a 4 androgenů ve vodách - MRM v negativním módu pro estrogeny, v positivním pro androgeny - limity detekce 0.1-2.5 ng/l. The - poměrně nízké výtěžnosti pro androgeny 32% - 60% Journal of Chromatography A, 1281 (2013) 9 Metabolomika Metabolity Metabolom: soubor intra- i extracelulárních nízkomolekulárních látek v živém systému, které se účastní metabolických reakcí, a které jsou nezbytné pro růst a normální funkci buňky Metabolomika: komplexní analýza metabolomu za konkrétního fyziologického nebo vývojového stádia organismu,tkáně či buňky GC/MS: - vysoká separační účinnost - ideální pro analýzu slož.směsí - souběžná analýzu různých tříd látek - reprodukovatelnost - nevhodné pro termolabilní metabolity - nutná derivatizace netěkavých látek LC/MS - vysoká citlivost -umožňuje analýzu termolabilních metabolitů -průměrné chromatografické rozlišení - efekty spojené s matricí vzorku - omezené informace o struktuře Chem. Listy 105, 745 (2011)
Metabolomika rostlin: GC/MS Příprava vzorku: kritický krok analýzy. Zahrnuje zastavení veškerých biochem. procesů (rychlé zmražení při -60 C, inaktivace enzymů), odstranění lipidů, derivatizace pro GC/MS Nat Protoc. 2006;1(1):387-96. Metabolomika rostlin: GC/MS GC/MS komplexní chromatogramy s velkým množstvím píků různých intenzit, velmi častá koeluce. Pro určení retenčních časů a spekter koeluujících látek se provádí dekonvoluce záznamu: Retenční časy stejných látek se mírně mění vzorek od vzorku nutná normalizace pomocí referenčních látek (uhlovodíky, FAMEs) retenční indexy Vyhodnocení dat pomocí statistických metod (např. PCA). 10.5936/csbj.201301013
CZE/MS analýza peptidů Enzymaticky štěpený krysí H1 protein směs peptidů CZE/MS - sep. pufr : 0.1% kys.mravenčí -průměr kapiláry : 30 μm - sheathless porézní nanoesi- MS Výhody CZE/MS: Vyšší citlivost Vyšší separační účinnost Kratší analýza doi: 10.1021/ac2010372