SACHARIDY Analytické úkoly: stanovení dominantního sacharidu v určitém materiálu (sacharosa v cukrovinkách, škrob v cereáliích, glykogen v mase ) nutriční hodnota potraviny, výrobku, (stanovení celkového obsahu všech sacharidů je neobvyklé) stanovení určitého sacharidu, jehož obsah souvisí s použitím určité suroviny (přídavek škrobu v kysaných mléčných výrobcích ) stanovení sumy určité skupiny sacharidů se společnou vlastností (redukující cukry, aldosy, pentosy ) stanovení jednotlivých monosacharidů a oligosacharidů identifikace původu suroviny, důkaz falšování potravin sledování průběhu technol. procesů (fermentace) stanovení jednotlivých polysacharidů stanovení vlákniny identifikace sacharidové složky glykosidů, glykolipidů, glykoproteinů 1
MOOSACHARIDY A OLIGOSACHARIDY: KVALITATIVÍ A SEMIKVATITATIVÍ AALÝZA Chemické zkoušky používané k důkazům cukrů Molischova reakce: roztok cukru + α-naftol +H 2 SO 4 červenofialové zbarvení reagují všechny sacharidy kromě 2-deoxycukrů reakce s Fehlingovým činidlem (CuSO 4 +vinan sodno-draselný+a) záhřevem cukru s činidlem vzniká cihlově červený Cu 2 O reakci dávají jen redukující cukry a je nespecifická (reagují také aldehydy...) reakce s Tollensovým činidlem (amoniakální roztok oxidu stříbrného) 2 Ag(H 3 ) 2 +RCH=O 2 Ag + RCOOH 4 + 3H 3 + H 2 O Planární chromatografie cukrů Chromatografické materiály papír celulosa (TLC) silikagel (TLC), někdy impregnace kys. boritou... Činidla pro detekci cukrů: anilin+difenylamin+h 3 PO 4 (modré, zelené, červené skvrny) naftoresorcinol+h 2 SO 4 anisaldehyd+ H 2 SO 4 anilin+kys. ftalová, trifenyltetrazoliumchlorid... 2
TLC cukrů příklady Vrstva Mobilní fáze Dělené cukry Detekce celulosa CH 3 COOEt-pyridin- H 2 O (6:3:1) Lac, Gal, Glc, Fru anilin-ftalová kys. silikagel CH 3 C-H 2 O (85:15) Raf, Mel, Lac, Mal, Sach, Gal, Glc, Fru, Xyl, Rha, drib anilin- difenylamin- H 3 PO 4 Bu-iPr- 0,5% H 3 BO 3 (3:5:2) Raf, Fru, Gal, Glc, Sach, Xyl thymol- H 2 SO 4 Denzitometrický záznam HPTLC dělení cukrů (A roztoky standardů, B extrakt z jogurtu) Podmínky: silikagel / acetonitril-fosfátový pufr ph 5,9 (85:15) + 0,05% 2-aminoethyldifenylborinát, dvojí vyvíjení, detekce: anilin-difenylamin-h 3 PO 4, aktivace 5 min 1 C, měření log 1/R, λ = 560 nm 3
Identifikace cukrů přípravou derivátů příprava arylosazonů resp. triazolových derivátů nejběžnější činidlo: fenylhydrazin CH=O CH H C 6 H 5 CH C 6 H 5 HH 2 CH C 6 H 5 HH 2 R R fenylhydrazon CH H C 6 H 5 H C C H C 6 H 5 Cu 2+, H + C C 6 H 5 R R osazon triazol osazony resp. triazolové deriváty cukrů lze identifikovat podle teploty tání cukry lišící se pouze konfigurací na C 2 tvoří stejný osazon (např. glukosu, fruktosu a manosu takto nelze rozlišit) příprava acylderivátů cukrů (reakce s acetahydridem nebo benzoylchloridem) rozlišení podle teploty tání derivátu CH 2 O (CH 3 CO) 2 O CH 3 COOa CH 2 OAc O OAc OAc OAc OAc β-d glukopyranosa Ac = COCH 3 pentaacetát 4
STAOVEÍ MOOSACHARIDŮ A OLIGOSACHARIDŮ Příprava vzorků potravin pro stanovení cukrů Kapalné vzorky zředění (např. sirupy, limonády... polarimetrie n. titrace) čiření a zředění (ostatní polarimetrie n. titrace) odstranění iontů ( HPLC) Tuhé a polotuhé vzorky (odstranění tuku extrakcí nepolárním rozpouštědlem - vzorky s vysokým obsahem tuku) extrakce cukrů vodou, 80% Et (možnost hydrolýzy) čiření zředění vodou (polarimetrie, titrace...), mobilní fází (HPLC) Čiření je odstranění zákalu a rozpuštěných nesacharidových opticky aktivních látek (bílkoviny, AK...), příp. také barviv z cukerného extraktu. Zpravidla se přídavkem činidla n. činidel k extraktu tvoří sraženina, filtrací je získán čirý roztok ěkterá činidla používaná k čiření Carrezovo činidlo: roztoky síranu zinečnatého a hexakyanoželeznatanu draselného 2 Zn 2+ + [Fe(C) 6 ] 4- Zn 2 [Fe(C) 6 ] neutrální octan olovnatý zásaditý octan olovnatý: (CH 3 COO) 2 Pb + PbO zásaditý dusičnan olovnatý: Pb(O 3 ) 2 + a kyselina fosfowolframová další: tanin, Al() 3, aktivní uhlí, spec. ionexy 5
POLARIMETRICKÉ METODY Hlavní využití analýza cukrovarnických surovin a produktů analýza čokolády a ostatních cukrovinek Specifické rotace některých cukrů: [α] D [α] D sacharosa + 66,53 laktosa + 55,3 invertní cukr -,59 maltosa +137,5 D-fruktosa - 93,78 D-galaktosa + 80,47 D-glukosa + 52,74 Běžná polarimetrická stanovení Stanovení sacharosy v nepřítomnosti jiných sacharidů: prosté měření optické rotace roztoku koncentrace sacharosy: c w = α / (l. 66,53) [g/ml] Stanovení sacharosy v přítomnosti redukujících cukrů: varem s roztokem Ba() 2 dochází k destrukci red.cukrů na opticky inaktivní produkty aplikace: stanovení sacharosy v čokoládě 6
Stanovení sacharosy vedle monosacharidu nebo laktosy nebo maltosy měří se optická otáčivost roztoku vzorku před a po inverzi sacharosy kyselinou chlorovodíkovou nebo citronovou (citronová kyselina nehydrolyzuje maltosu ani laktosu). Hydrolýza probíhá podle rovnice C 12 H 22 O 11 + H 2 O 2 C 6 H 12 O 6. Z 342 g sacharosy vzniká 360 g invertního cukru. Pro hodnotu otáčivosti před inverzí platí α 1 = l. ([α] D (S). c ws + [α] D (B). c wb ) index S se vztahuje k sacharose, index B k druhému cukru a index I k invertnímu cukru. Pro hodnotu otáčivosti po inverzi (hydrolýze) sacharosy platí α 2 = l. ([α] D (I). c wi + [α] D (M). c wm ), kde c w(i) = (360/342). c ws. Dosazením získáme soustavu dvou rovnic α 1 = l. ([α] D (S). c ws + [α] D (B). c wb ) α 2 = l. ([α] D (I). (360/342). c ws + [α] D (B). c wb ) o dvou neznámých c ws a c wm. 7
CHEMICKÉ METODY STAOVEÍ REDUKUJÍCÍCH CUKRŮ 1. Metody založené na stechiometrických reakcích Oxidace aldos jodem ve slabě alkalickém prostředí se aldosy oxidují nadbytkem jodu na soli příslušných aldonových kyselin: R-CH=O + I 2 + 3 - R-COO - + 2I - + 2H 2 O Po okyselení reakční směsi se přebytek jodu určí titrací thiosíranem sodným: I 2 + 2S 2 O 3 2-2I - + S 4 O 6 2- Oxidace aldos hexakyanoželezitanem v prostředí uhličitanu sodného se aldosy oxidují přebytkem hexakyanoželezitanu draselného: R-CH=O + 2[Fe (C) 6 ] 3- + 3 - R-COO - + 2[Fe (C) 6 ] 4- + 2H 2 O Ekvivalentní množství vzniklého hexakyanoželeznatanu se stanoví titrací odměrným roztokem dichromanu draselného: 6[Fe (C) 6 ] 4- + Cr 2 O 7 2- + 14H + 6[Fe (C) 6 ] 3- + 2Cr 3+ + 7H 2 O. 8
2. Metody založené na nestechiometrických reakcích Základní princip oxidaci redukujících cukrů měďnatými ionty v alkalickém prostředí za horka (obvykle za varu) činidla jsou např. Fehlingův roztok (CuSO 4 + vinan sodno draselný + a) nebo Luffův roztok (CuSO 4 + citronová kyselina+ a 2 CO 3 ) oxidačně redukční reakci lze pro aldosy zapsat takto: R-CH=O + 2Cu 2+ + 5 - R-COO - + Cu 2 O + 3H 2 O. Ve skutečnosti probíhá i řada jiných reakcí (isomerace, štěpení cukrů). Výše uvedená rovnice tedy stechiometricky nevystihuje probíhající chemické děje. Provádí-li se však reakce za přesně definovaných podmínek (objem roztoku vzorku, objem přidaného činidla, doba ohřevu reakční směsi k varu, doba varu), reakce doběhne do určitého stupně (je dosaženo určité konverze reaktantů na produkty), přičemž tento stupeň je závislý na množství cukru ve vzorku. Různé redukující cukry reagují různou rychlostí a také vedlejší reakce nejsou u různých cukrů zcela totožné. Množství konkrétního cukru se tedy určuje empiricky ze složení reakční směsi po ukončení reakce (ochlazení na laboratorní teplotu). Lze stanovit buď množství vyloučeného oxidu měďného (červenohnědá sraženina) nebo zbytkové množství měďnatých iontů. 9
Postupy založené na stanovení Cu 2 O Metoda podle Ofnera - oxid měďný vyloučený reakcí cukru s alkalickým roztokem měďnaté soli se po okyselení HCl oxiduje nadbytkem odměrného roztoku jodu na Cu 2+. Přebytek jodu se určí titrací thiosíranem: Cu 2 O + 2H + + I 2 2Cu 2+ +2I - + H 2 O I 2 + 2S 2 O 3 2-2I - + S 4 O 6 2-. Metoda podle Bertranda (Rotsche) - oxid měďný se rozpustí v roztoku síranu železitého a kyseliny sírové. Železitá sůl se přitom redukuje na železnatou. Ekvivalentní množství železnatých iontů se stanoví manganometrickou titrací: Cu 2 O + 2H + + 2Fe 3+ 2Cu 2+ + 2 Fe 2+ + H 2 O 5Fe 2+ + MnO 4 - + 8H + 5Fe 3+ + Mn 2+ + 4H 2 O. Komplexometrická metoda - oxid měďný se po odfiltrování rozpustí v kyselině dusičné a vzniklé měďnaté ionty se stanoví titrací komplexonem III (chelatonem 3) s použitím murexidu nebo PAR jako indikátoru: 3Cu 2 O + 2O 3 - + 14H + 6Cu 2+ + 2O + 7H 2 O Cu 2+ + H 2 Y 2- CuY 2- + 2H + Vážkové metody oxid měďný se odfiltruje a stanoví vážkově (váží se buď Cu 2 O nebo kovová měď po redukci oxidu v parách methanolu) 10
Postupy založené na stanovení přebytku Cu 2+ Metoda podle Luffa-Schoorla - cukerný extrakt reaguje za horka s definovaným množstvím Cu 2+ ve formě tzv. Luffova roztoku (CuSO 4 + citronan sodný + a 2 CO 3 ) a vzniká oxid měďný. Směs se vaří přesně 10 minut. Po ochlazení a okyselení se nadbytek Cu 2+ stanoví jodometricky: Cu 2+ + 4I - 2CuI + I 2 I 2 + 2S 2 O 3 2-2I - + S 4 O 6 2-. Provádějí se dvě titrace thiosíranem. První bez vzorku (místo cukerného extraktu se odpipetuje stejný objem vody) a druhá se vzorkem. Z rozdílu spotřeb 0,1M a 2 S 2 O 3 se z tabulky určí množství příslušného cukru. 0,1M a 2 S 2 O 3 [ml] Glc, Fru, invert [mg] Maltosa (bezv.) [mg] Laktosa(bezv.) [mg] 1 2,4 3,9 3,6 2 4,8 7,8 7,3 3 7,2 11,7 11,0 4 9,7 15,6 14,7 5 12,2 19,6 18,4 6 14,7 23,5 22,1 7 17,2 27,5 25,8 8 19,8 31,5 29,5 9 22,4 35,5 33,2 10 25,0 39,5 37,0 11 27,6 43,5 40,8 12 30,3 47,5 44,6 13 33,0 51,6 48,4 14 35,7 55,7 52,2 15 38,5 59,8 56,0 16 41,3 63,9 59,9 17 44,2 68,0 63,8 18 47,1 72,2 67,7 19 50,0 75,5 71,7 53,0 80,9 75,7 21 56,0 85,4 79,8 22 59,1 90,0 83,9 23 62,2 94,6 88,0 11
Komplexometrická metoda - přebytek Cu 2+ po reakci s cukrem se stanoví titrací komplexonem III (chelatonem 3): Cu 2+ + H 2 Y 2- CuY 2- + 2H +. Zvláštní postup alkalický roztok měďnaté soli se za varu titruje cukerným roztokem (vzorkem) do vymizení modrého zabarvení (metoda podle Lanea-Eynona). KOMBIOVAÉ POSTUPY STAOVEÍ ĚKOLIKA CUKRŮ Stanovení fruktosy vedle glukosy Glukosa se předem oxiduje jodem v alkalickém prostředí, po okyselení se nadbytek jodu odstraní opatrným přídavkem a 2 SO 3. V roztoku se pak stanoví fruktosa např. podle Luffa- Schoorla Stanovení glukosy, fruktosy a sacharosy první alikvotní podíl: stanovení glukosy titrací jodem v alkalickém prostředí m 1 = m Glc druhý alikvot. podíl: stanovení glukosy a fruktosy na základě redukce měďnaté soli (např. metoda Ofnerova, Luffova-Schoorlova...) m 2 = m Glc + m Fru třetí alikvot. podíl: inverze sacharosy kys. chlorovodíkovou, stanovení sumy všech red. cukrů m 3 m Sach = 0,95 m Inv = 0,95 (m 3 -m 2 ) 12
Stanovení laktosy a sacharosy vedle sebe Laktosa se hydroxidem barnatým převede na opticky inaktivní produkty a zbylá sacharosa se stanoví polarimetricky, laktosa se stanoví titračně podle Luffa-Schoorla Stanovení glukosy, maltosy a dextrinů Suma glukosy a maltosy se stanoví jodometricky na základě redukce měďnaté soli v prostředí a. V jiném alikvotním podílu se stanoví samotná glukosa obdobně v prostředí octanu sodného (maltosa nereaguje). V dalším alikvotním podílu se dextriny hydrolyzují na glukosu a stanoví se suma všech redukujících cukrů. Obsah dextrinů se určí jako m dex = 0,9 (m celk m Glc m Mal ) 13
SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODY STAOVEÍ CUKRŮ 1. Metody enzymové viz biochemické metody 2. Metody založené na redukčních účincích cukrů eokuproinová metoda Měďné ionty (Cu + ) vzniklé reakcí Cu 2+ s cukrem reagují s neokuproinem (2,9-dimetyl-1,10-fenanthrolin) za vzniku oranžového komplexu rozpustného v Et (λ max = 457 nm) Metoda dle elsona a Somogyiho Měďné ionty (Cu + ) vzniklé reakcí Cu 2+ s cukrem dále redukují arsenomolybdenovou kyselinu na molybdenovou modř (λ max = 8 nm) Reakce s tetrazoliovými solemi trifenyltetrazolium chlorid nebo bromid se redukujícími cukry v alkalickém prostředí (ph >12,5) redukuje na červenofialový trifenylformazan: + X 2 H - HX H trifenyltetrazolium chlorid (bromid) trifenylformazan 14
Reakce s pikrovou nebo dinitrosalicylovou kyselinou Pikrová kyselina se při reakci s cukry v alkalickém prostředí redukuje na červenou pikraminovou kyselinu: O 2 O 2 O 2 H 2 O 2 O 2 Redukcí 3,5-dinitrosalicylové kyseliny vzniká v alkalickém prostředí (0,3M K) červenohnědá 3-amino-5nitrosalicylová kyselina (λ max = 5 nm) CO CO O 2 O 2 O 2 H 2 reakci je vhodné provádět v inertní atmosféře, vzdušný kyslík ovlivňuje výsledky. 3. Metody založené vzniku a reakcích furanových derivátů Dehydratací cukrů v prostředí minerálních kyselin vznikají deriváty furfuralu R O CH O pentosy furfural (R = H) methylpentosy 5-methylfurfural (R = CH 3 ) hexosy 5-hydroxymethylfurfural (R = CH 2 ) uronové kyseliny 5-formylfuroová kyselina (R = CO) (2-deoxycukry takto nereagují) 15
Furfural a odvozené sloučeniny kondenzují s fenoly aromatickými aminy nebo polycyklickými sloučeninami za vzniku barevných produktů ejčastěji používaná činidla CH 3 O orcinol anthron 1-naftol Přehled reakcí: Činidlo Doba reakce, teplota Cukry Zbarvení orcinol/ HCl nebo H 2 SO 4 30-45 min, 100 C pentosy > hexosy zelené hnědé anthron/ H 2 SO 4 10-15 min, 90-100 C všechny modrozelené 1-naftol/H 2 SO 4 3 min, 100 C všechny purpurové Vlastnosti metod skupiny 3: málo selektivní ( kombinace s PC, TLC, HPLC) málo robustní (vliv doby a rychlosti ohřevu) vysoce citlivé (možno stanovit µg množství cukrů) Automatizace spektrofotometrických meření Flow Injection Analysis (FIA) 16
BIOCHEMICKÉ METODY AALÝZY CUKRŮ využívají většinou enzymově katalyzovaných oxidačně redukčních reakcí cukrů, při nichž dochází k přeměně kofaktoru nebo kosubstrátu. Vznik nebo úbytek těchto složek je sledován spektrofotometricky případně elektrochemicky. ejčastěji jde o dehydrogenace fosforečných esterů cukrů pyridinovými dehydrogenasami za současné konverze AD + (nebo ADP + ) na ADH+H + (neb ADPH+H + ). Redukovaná forma kofaktoru se stanoví měřením absorbance při 340 nm. Absorpční spektra oxidované a redukované formy nikotinamidadenindinukleotidu (c = 5 mmol/l) Stanovení glukosy hexokinasa glukosa + ATP glukosa-6-fosfát + ADP glukosa-6-fosfátdehydrogenasa glukosa-6-fosfát + ADP + 6-fosfoglukonát + ADPH+H + Jiný princip: glukosa se oxiduje kyslíkem na glukonát: glukosaoxidasa glukosa + H 2 O + O 2 glukonát + H 2 O 2 vzniklý peroxid následně oxiduje (katalýza peroxidasou) leukoformu barviva na barvivo, jehož absorpce se měří. 17
Stanovení fruktosy hexokinasa fruktosa + ATP fruktosa-6-fosfát + ADP glukosafosfát-isomerasa fruktosa-6-fosfát glukosa-6-fosfát další reakce probíhají jako při stanovení glukosy Stanovení sacharosy Sacharosa se za katalysy invertasou (β-fruktosidasou) hydrolyzuje na glukosu a fruktosu. Dále viz glukosa, fruktosa. Stanovení laktosy Laktosa (O-β-D-galaktopyranosyl-(1 4)-α-D-glukopyranosa) se za katalýzy β-galaktosidasou hydrolyzuje na glukosu a galaktosu. Galaktosa se enzymově dehydrogenuje: D-galaktosa:AD-oxidoreduktasa Gal + AD + galaktonová kys.+adh+h + Stanovení rafinosy Rafinosa (α-d-galaktopyranosyl-(1 6)-α-D-glukopyranosyl- (1-2)- β-d-fruktofuranosid) může být hyrolyzována buď na galaktosu a sacharosu (enzym α-galaktosidasa) nebo na fruktosu a melibiosu (enzym invertasa=β-fruktosidasa). Detekce je založena na dehydrogenaci vzniklé galaktosy. V druhém případě je nutné nejprve hydrolyzovat melibiosu na galaktosu a glukosu (enzym α-galaktosidasa). 18
Zhodnocení enzymových metod Výhody Problémy, nevýhody specifičnost nalezení opt. podmínek pro více enzymů jednoduchá příprava vzorku nečistoty v enzymových preparátech rychlost vysoká cena čistých enzymů 19