Laboratorní příručka Oddělení patologické anatomie 1. Základní informace o laboratoři Identifikace laboratoře a důležité údaje 1. Název laboratoře: Oddělení patologické anatomie Vsetínské nemocnice a.s. 2. Sídlo: Nemocniční 955, 755 32 Vsetín 3. Vedoucí lékař: MUDr. Petr Mičulka 4. E-mail: miculka@nemocnice-vs.cz 5. Telefonní číslo: 571 818 270 6. Kontakty: lékař 571 818 27 vedoucí laborantka + laboratoř 571 818 273 pitevna 571 818 274 7. Provozní doba: Po-Pá 5.00 15.30 hodin 8. Příjem materiálu: Po-Pá 6.00-14.30 hodin 9. Svoz zemřelých: nepřetržitě 10. Zpracovávaný materiál: materiál z ambulancí a operačních sálů nemocnice,endoskopické, kožní vzorky soukromých lékařů, Area Medica, soukromé gynekologické ambulance, zubní ambulance 11. Členění oddělení: - laboratoř zahrnující histologickou, cytologickou a imunohistochemickou činnost - pitevní trakt Seznam poskytovaných služeb: provádění bioptických vyšetření provádění imunohistochemických vyšetření cytologická vyšetření (ne gynekologická) peroperační diagnostika provádění pitev Intervaly od dodání vzorku k vydání výsledku Peroperační biopsie od doby příjmu cca 10-15 minut zhotovení preparátu + odečtení, výsledek je sdělen telefonicky na operační sály. 1

Standardní histologické barvení hematoxylin eozin: 2 pracovní dny od dodání vzorku do laboratoře, v případě naléhavosti je možno ihned materiál dodat do laboratoře a druhý den ráno může být stanovená diagnóza! Imunohistochemie použití imunohistochemické metody přidává k základnímu barvení 1-2 dny. Neobvyklé nálezy či povaha materiálu prodlužují dobu vyšetření (např. nutnost dofixování, odvápnění, složitá diagnóza, druhé čtení atd.) + několik dalších dní. Pitevní nálezy výsledky nálezu s mikroskopickým ověřením diagnózy jsou stanoveny do 3 měsíců od provedení pitvy. 2. Bioptické vyšetření Biopsie v nejobecnějším smyslu znamená mikroskopické vyšetření tkání, získaných za života nemocného za účelem diagnostickým, prognostickým nebo kontrolním. Má-li úspěšně plnit své cíle, je třeba zachovávat stanovená pravidla. 2.1. Odběr bioptického materiálu Metody odběru: operační metody (amputace, resekce, exstirpace, excize, probatorní excize) endoskopické odběry, probatorní punkce, kyretáž 2.1.1. Zásady odběru Bioptický materiál se musí dodat do bioptické laboratoře v takovém stavu, v jakém byl odebrán z organismu. V případě probatorní excize může operatér značně ovlivnit celé další vyšetření volbou místa odběru, např. excize z okrajů ulcusu nebo okraje nádoru. Je nutné obzvláště u lymfatických uzlin dbát na to, aby nedošlo k jejímu zhmoždění či fragmentaci, před vložením do fixační tekutiny nesmí oschnout a velké lymfatické uzliny naříznout po konvexitě v největší délce. 2.1.2. Zásahy klinika do operačních materiálu Odpovědnost za volbu vzorku se přesunuje na patologa za předpokladu, že byl zaslán veškerý operační materiál, proto by bez jeho souhlasu neměl nikdo preparáty nařezávat, rozstřihávat atd., neboť tyto zásahy vedou k desorientaci či poškození tkáně. Připouští se označení diagnosticky významných úseků šicím materiálem. Označení musí být ve shodě s popisem na průvodním listě. 2.1.3. Jiná poškození materiálu Tkáň hrubě poškozuje vysoká teplota, zmrznutí, vysychání. Při vysychání tkáně dochází k autolýze a poškození nebo znehodnocení materiálu, proto je nutné materiál ihned vložit do fixačního roztoku, interval nemá přesáhnout několik minut. Materiál, který nebude fixován se obalí gázou navlhčenou ve fyziologickém roztoku. Takto lze materiál bez větších škod uchovat 2-3 hodiny. Nefixované tkáně nesmí přijít do styku 2

s vodou (ani destilovanou).voda poškozuje jemné struktury buněk a ztěžuje mikroskopické vyšetření. Pokud je preparát třeba vodou opláchnout, přebytek je nutno odstranit, totéž platí pro fyziologický roztok. 2.2. Fixace tkáně Materiál musí být ihned po odběru vložen do fixační tekutiny. Pro rutinní diagnostiku použijeme 10% ní roztok formaldehydu. Objem fixační tekutiny v nádobě má alespoň 10xpřevyšovat objem fixovaného vzorku a fixační tekutina má mít přístup ke vzorku ze všech stran. Po vložení materiálu je vhodné nádobkou zatřepat, aby materiál nepřilnul ke stěně nádoby (např. kyretáže, drobné částečky atd.), také je nutné,aby nádoba měla dostatečně široké hrdlo. Při dodržení těchto zásad není rychlost transportu ze strany laboratoře nijak limitována. 2.3. Transport materiálu do laboratoře Materiál je do laboratoře transportován ve fixační tekutině v pevně uzavřených plastových nádobách. Každá nádoba s materiálem musí být opatřena štítkem se jménem, příjmením, kódem pojišťovny a rodným číslem. Vhodné je ještě uvedení zasílajícího oddělení, specifikací materiálu a popř. z jaké je lokality. Tyto údaje musí souhlasit s údaji na průvodním listu (tzv. žádance). 2.3.1. Peroperační biopsie a její transport do laboratoře - statim vyšetření Peroperační biopsie (freeze section) se používá tehdy, je-li potřeba urychlit stanovení diagnózy (v průběhu operace). Tkáně určené k tomuto vyšetření nesmí být fixovány, transport musí probíhat neprodleně po odběru materiálu z těla pacienta na základě předchozí domluvy klinika s patologem a načasování odběru. Ke každému materiálu musí být dodán vyplněný průvodní list k zásilce bioptického materiálu. Výsledek je hlášen hodnotícím lékařem telefonicky lékaři na operační sál. 2.4. Požadavkové listy tzv. žádanky Klinik vyplní Průvodní list k zásilce bioptického materiálu, ve kterém musí být: jméno a příjmení pacienta rodné číslo kód pojišťovny odesílající oddělení, včetně IČZ základní diagnózu datum odběru materiálu dobu trvání choroby údaje o předchozích odběrech formy použité terapie, event. chemoterapie jméno a podpis lékaře, který odběr provedl 3

Výrazně musí být na průvodce vyznačeno statim vyšetření a dále materiály pacientů při podezření či prokázanými infekčními chorobami jako je pozitivita HBV, HCV, HIV, TBC atd. Je-li excizní nebo částí operačního materiálu z téhož orgánu více, musí mít každý materiál vlastní nádobku a průvodní list s přesným označením původu a musí být číselně rozlišen. Tvoří-li operační materiál tkáně z různých orgánů, platí totéž. Amputáty končetin musí být uloženy v igelitovém pytli označeném jménem pacienta a doneseny na oddělení patologie. Při převzetí materiálu laboratoř kontroluje, zda označení materiálu souhlasí s označením na průvodním listu. Všechny neshodné údaje se okamžitě hlásí příslušnému oddělení a neshoda je zaznamenána na průvodku. 2.5. Preanalytické procesy v laboratoři Průvodní listy shodné s materiálem se označí pořadovým číslem laboratorní číslo vyšetření. stejným číslem je označen bloček i preparát a takto je materiál evidován, zpracováván a následně archivován. Je vyplněna elektronická dokumentace vedená v Nemocničním informačním systému. Originály průvodek se uchovávají v elektronické i papírové podobě. Osobní údaje vyšetřovaných pacientů jsou uchovávány tak, aby nebyly přístupné jiným osobám než těm, kteří vyšetření provádějí. 2.5.1. Kritéria pro odmítnutí vadných (kolizních) primárních vzorků Přijaty ke zpracování mohou být jen vzorky řádně označené, nepoškozené a dodané se správně vyplněným požadavkovým listem - žádankou. Důvodem k odmítnutí vzorků je: nejasná identifikace jednotlivých vzorků nepřítomnost identifikačního štítku na nádobce nečitelné údaje použití nevhodného nebo žádného fixačního roztoku nepřiložená žádanka 2.5.2. Postup při chybné identifikaci Je-li chybně identifikován pacient nebo chybí-li zcela rodné číslo, jméno, pojišťovna, odbornost žadatele) je telefonicky ověřena správnost údajů a toto je zaznamenáno na žádanku. 4

2.5.3. Zásady práce s biologickým materiálem Každý vzorek biologického materiálu je považován za potenciálně infekční. Při manipulaci se vzorky je třeba se řídit bezpečnostními aspekty: k přepravě používat uzavřené transportní nádoby ochrana dokumentace před kontaminací fixační tekutinou v případě rozlití je třeba se řídit zásadami dekontaminace a dezinfekce 2.6. Základní metody zpracování tkání zhotovení parafínového bloku a příprava preparátu příprava preparátu ze zmražených tkání zhotovení nebo zpracování cytologického nátěru, zhotovení parafínového bloku zpracování materiálu odebraného při pitvě zhotovením parafínového bloku a přípravou histologického preparátu Barvící metody 2.7. Používané histologické, speciální a imunohistochemické barvící metody(b) Speciální barvící metody 1) Základní histologické barvení: - Hematoxylin - eosin 2) Elastické vazivo: - barvení orceinem 3) Fibrin: - Mallory - Weigertovo barvení 4) Impregnace retikulárních vláken: - Gömori 5) Bazální membrány glomerulů: - Jones 6) Kolagenní vazivo: - Masonovy trichromy, - Van Gieson 7) Polysacharidy, hlen: - Kyselé mukopolysacharidy alciánovou modří - Polysacharidy metodou PAS + PAS s natrávením 5

8) Průkaz amyloidu: - Kongo červeň F3B 9) Anorganické látky: - Perslova reakce průkaz trojmocného železa - Kossa průkaz vápenatých solí - Murexydova reakce průkaz dnavých tofů 10) Pigmenty: - Průkaz bilirubínu Fouchet - Průkaz lipofuscinu- dle Schmorla - Průkaz melaninu - Fontána 11) Plísně: - Impregnace podle Groccota 12) Neurohistochemické metody: - Myelinové pochvy Weillova metoda - Průkaz fosfolipidů luxolovou modří - Impregnace argyrofilních buněk Grimelius 13) Průkaz australského antigenu: - HBsAg 14) Průkaz lipidů: - Sudan III 15) Tkáňové elementy: - May Grünwald Giemsa 16) Průkaz bakterií: - Gramm - CLO - BK (Ziehl-Neelsen) - Wartin Starry Imunohistochemické metody 1) Aktin (SMA) průkaz buněk hladké svaloviny v normální i nádorové tkáni 2) CD 20 - průkaz antigenu B lymfocytů, diferenciální dg lymfomů, akutních leukemií a chronických lymfocytárních leukemií 3) CD 31 průkaz endotelií 6

4) CD 34 - diferenciální diagnostika a klasifikace leukemií, případně vaskulárních tumorů 5) CD 45 (LCA) diferenciální dg a klasifikace hematologických malignit T-řady 6) c-erbb-2 (HER2/neu) hodnocení nadměrné exprese při Ca prsu pro další léčbu 7) Cytokeratin AE1/AE3 identifikace buněk epiteliálního původu v normální i nádorové tkáni 8) Cytokeratin HMW diagnostika karcinomu prostaty 9) Desmin diferenciální dg tumorů myogenního původu 10) E cadherin diferenciální diagnostika duktálního karcinomu prsu 11) EMA = epiteliální membránový antigen diferenciální dg anaplastických karcinomů od maligních lymfomů, detekce metastáz karcinomu prsu 12) Estrogenový receptor diferenciální dg hormon-senzitivních tumorů 13) EGFR= epidermální růstový faktor hodnocení nadměrné exprese pro další léčbu 14) HMB 45 průkaz melanosomů, diferenciální dg melanocytárních lézí a dále dg světlobuněčného sarkomu 15) Chromogranin diferenciální dg tumorů neuroendokrinního původu 16) Ki -67 proliferační jaderný antigen 17) PCNA proliferační jaderný antigen 18) Progesteronový receptor diferenciální diagnostika hormon-senzitivních tumorů 19) Prostatický specifický antigen diagnostika metastáz karcinomu prostaty 20) S 100 diferenciální diagnostika neuroektodermálních tumorů 21) Synaptofysin diferenciální diagnostika neuroektodermálních tumorů 22) Vimentin diferenciální diagnostika mezenchymálních nádorů 7

2.8. Vydávání výsledků zjištěné mikroskopické změny, včetně diagnostické rozpravy a závěru jsou s vyjmenováním použitých imuhohistochemických metod zaznamenány do NISu a vytištěny závěrečné zprávy jsou zaslány pouze zadavateli oddělení, která jsou napojena na NIS mají výsledky k dispozici v tomto systému výsledky v tištěné podobě jsou dodávány na oddělení a ambulance prostřednictvím donáškové nemocniční služby nebo České pošty kopie maligních nálezů se zasílají na onkologický registr výsledek konzultačního vyšetření se zaznamenává do NISu a vytištěny výsledky nejsou předávány přímo pacientům a v žádném případě nejsou telefonicky informovány vyšetřované osoby 3. Cytologická vyšetření (negynekologická) 3.1. Příjem materiálu Stejně jako u bioptického materiálu : Po Pá 6,00 14,30 hodin 3.2. Vyšetřované materiály Výchozím materiálem pro cytologické zpracování jsou : 1a) Tekutý materiál (punktát) je nutno zaslat ihned po odběru ve zkumavce, injekční stříkačce či nádobě k tomu určené se širokým hrdlem, a to veškeré odebrané množství! 1b) Tekutý materiál s kousky tkáně tekutý obsah je zpracováván jako punktát, kousky tkáně lze fixovat v 10% formalínu na oddělení nebo až v laboratoři patologie a zpracovává se jako cytoblok nebo biopsie. Výsledek je k dispozici nejdříve druhý den! 2) Sputum je zpracováváno jako nátěr na podložní sklo, větší množství materiálu lze zpracovat jako cytoblok 3) Stěry z jícnu, žaludku, nosu a podobně, se barví a hodnotí jako nátěr 4) Cytologické nátěry jsou do laboratoře dodávány na podložních sklíčkách jako zaschlé preparáty, každý preparát musí být označen jménem pacienta a alespoň rokem narození. Jednotlivé lokalizace, ebeny. pořadí odběrů musí být označeny na skle i průvodce. 3.3. Transport cytologického materiálu Materiál pro cytologii, který je transportován v podobě nátěrů nebo otisků musí být uložen v kyvetách nebo jiných přepravních boxech, aby nedošlo k jejich poškození. Tělní tekutiny musí být přepravovány v dobře těsnících nádobách v nefixovaném stavu pro další zpracování. 8

Před transportem musí být cytologický materiál uchováván v lednici při teplotě do 4 C. Mozkomíšní mok musí být do laboratoře dodán nejpozději do 30-ti minut po odběru a ihned zpracován. 3.4. Požadavkové listy (žádanky) Ke každému materiálu musí být dodán vyplněný Průvodní list k zásilce cytologického materiálu. 3.5. Laboratorní zpracování Průvodní list k cytologickému materiálu je rovněž označen pořadovým číslem, zaevidován do indexu, stejným číslem jsou označeny všechny preparáty, případně cytobloky a zaevidované vzorky jsou ihned zpracovávány. 3.6. Kritéria pro odmítnutí vadných (kolizních) vzorků, postupy při nesprávné identifikaci vzorku Stejná jako u bioptického materiálu. 3.7. Vydávání výsledku Stejná jako u bioptického materiálu. 4. Pitevní provoz Pitvy zemřelých se provádějí k určení základní diagnózy, komplikací, příčiny úmrtí a ověření základní diagnózy a léčebného postupu u osob zemřelých ve Vsetínské nemocnici a.s. Zákonná povinnost provést pitvu vyplývá z vyhlášky č.19/1988 Sb. Ostatní zdravotní pitvy jsou prováděny, rozhodne-li o jejím provedení prohlížející lékař zápisem do Listu o prohlídce mrtvého. 4.1. Postup při příjmu těla zemřelého a vedení dokumentace Pitevní sanitář přijímá těla zemřelých v Po - Pá od 6.00 14.30 hodin, mimo pracovní dobu zajišťují svoz zemřelých sanitáři klinických oddělení. Zemřelé je nutno uložit do chladícího zařízení ihned po dovozu na oddělení patologie a zapsat do Knihy příjmu zemřelých, kde se uvede jméno zemřelého, rok narození, oddělení a datum. 4.2. Předepsaná dokumentace Tělo zemřelého musí být označeno jménem, příjmením a rodným číslem, označení musí být provedeno čitelně, nesmyvatelným psacím prostředkem a upevněno tak, aby nedošlo k jeho uvolnění. 9

Tělo zemřelého má být přivezeno vždy s dokumentací, která obsahuje: 4x List o prohlídce mrtvého (SEVT) - musí být řádně vyplněný těmito údaji: Jméno a příjmení Datum narození Rodné číslo Příčina úmrtí a základní onemocnění, pro které se pacient léčil Zdravotní pojišťovna Místo úmrtí (oddělení) Datum a hodina úmrtí Zaměstnání Stav Bydliště Příbuzní 1x Průvodní list k pitvě Opět je zde uvedeno jméno a příjmení, rodné číslo, zdravotní pojišťovna, zaměstnání, bydliště, číslo chorobopisu, oddělení, kde pacient zemřel, datum a hodina úmrtí. Průvodní list k pitvě vypisuje prohlížející lékař a popisuje v něm klinickou diagnózu, průběh nástupu smrti se stručnou anamnézou nebo další důležité informace, které zjistil při prohlídce zemřelého. Pokud došlo k úmrtí v noci je nutné dokumentaci k zemřelým dodat nejpozději do 8,30hodin následujícího dne. 4.3. Vedení dokumentace a odběr nekroptického materiálu zemřelý je zapsán do Pitevní knihy a Nemocničního informačního systému, kde je pitvě přiděleno pořadové číslo poté je založen Pitevní protokol označený na přední straně pořadovým číslem pitvy, jménem, příjmením zemřelého, datem narození, datem úmrtí a jménem pitvajícího lékaře není-li ze zdravotnického hlediska indikace k provedení pitvy, je List o prohlídce mrtvého založen s administrativními záznamy ve složce NEPITVANÍ 10

- u mrtvě rozených plodů a dětí se rozlišuje : plod o váze do 500g = abort, plod vložit do formalínu a přiložit Průvodní list k bioptickému vyšetření plod o váze 500g 1000g = abort, plod nefixovat formalínem, přiložit Průvodní list k bioptickému vyšetření, provádí se však pitva plod o váze nad 1000g = plod nefixovat formalínem, provádí se pitva, přiložit List o prohlídce mrtvého a Průvodní list k pitvě - po pitvě je pitvajícím lékaře zhotoven prozatímní Pitevní protokol,ve kterém je uvedena předběžná diagnóza a příčina smrti je stanovena na základě změn zjištěných při pitvě - protokol je uchováván v papírové a elektronické podobě (NIS) - při pitvě jsou odebírány vzorky podle uvážení pitvajícího lékaře, které jsou následně zpracovány a jsou zhotoveny histologické preparáty, které jsou odevzdány lékaři ke stanovení diagnózy - ke každé provedené pitvě je vedena evidence o počtu připravených tkáňových bloků, preparátů a použitém barvení - konečná diagnóza je stanovena na základě mikroskopického vyšetření nekroptických vzorků a uvedena v definitivním Pitevním protokolu - originály Pitevních protokolů jsou uchovávány v papírové podobě na oddělení patologie a uloženy v Nemocničním informačním systému 4.4. Vydávání výsledků Oddělení připojená k NISu mají definitivní protokol k dispozici v tomto systému, papírová kopie je zasílána na oddělení, na kterém došlo k úmrtí a dále se kopie zasílá obvodnímu lékaři, u kterého byl zemřelý v evidenci, pokud je tento v Listu o prohlídce mrtvého uveden. Osobní údaje vyšetřovaných jsou uchovávány tak, aby nebyly dostupné jiným osobám než pracovníkům, kteří vyšetření provádějí. Oddělení patologie nevydává úmrtní list, vše potřebné obstará pohřební služba. 11