Název: Školitel: METODY IDENTIFIKACE VIRU HIV Soňa KŘÍŽKOVÁ Datum: 5.12.2013 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu
Virus HIV Human immunodefficiency virus Napadá primárně T-lymfocyty, především CD4+ buňky genom: ssrna, lineární, 9749 nukleotidů, 2 kopie, 9 genů proteom: 18 proteinů Obalený virus retrovirus průměr 120 nm Proteiny kódované genomem HIV: Třída Gen Primární proteinový produkt Procesovaný proteinový produkt Virové strukturní proteiny gag Gag polyprotein MA, CA, SP1, NC, SP2, P6 pol Pol polyprotein RT, RNase H, IN, PR env gp160 gp120, gp41 Esenciální regulační faktory Doplňkové regulační proteiny tat rev nef vpr vif vpu Tat Rev Nef Vpr Vif Vpu
Průběh infekce virem HIV Asymptomatické stadium Akutní retrovirový syndrom chřipkové příznaky virus CD4+ (dočasně) Asymptomatické stádium protilátky virus Chronická lymfadenopatie virus protilátky CD4+ Časné symptomatické stadium sub-klinické poruchy imunity chřipkové příznaky malé oportunní infekce kožní příznaky protilátky (ke konci) Počet CD4+ lymfocytů/mm 3 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 Akutní infekce Asymptomatické stadium Chronická lymfadenopatie virus CD4+ Časné symptomatické stadium Sub-klinické poruchy imunity anti-hiv Kožní příznaky Pozdní sympt. stadium Systémové selhání imunity Pozdní symptomatické stadium, AIDS systémové selhání imunity velké oportunní infekce nádory spojené s HIV infekcí wasting syndrom smrt v důsledku vyčerpání organismu protilátky CD4+ virus 100 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 Doba od infekce (měs.)
Co tedy můžeme detekovat? přímé metody analyty virového původu: virová RNA 9 genů (9 možností?) virové proteiny 18 proteinů (18 možností?) obalové proteiny antigen p24, gp120 reversní transkriptasa nepřímé metody analyty hostitelského původu: anti HIV protilátky (ne)specifické příznaky Doba infekce raná asymptomatické období pozdní Druh testu rychlé domácí testy screening (falešná pozitivita) potvrzení Testovaný materiál: krev plasma sliny moč slzy
Klasické metody Klasické metody laboratorní diagnostiky Protilátky proti HIV Virová RNA povinné testování v těhotenství, u dárců krve HIV testy screening potvrzení Používané metody: ELISA - protilátky Imunostripy - protilátky Western-blot - core-proteiny (p17, p24, p55), polymerázy (p31, p51, p66), envelope-proteiny (gp41, gp120, gp160) RT-PCR Q-RT-PCR Plasma viral load 2 až 3 měsíce po rizikové události 0 2 měsíce diagnostické okno výsledek do několika dnů standardně Zjednodušený diagnostický algoritmus: Nereaktivní Výsledek - negativní Doporučeno opakování testu po 1 až 2 měsících Počet CD4+ lymfocytů/mm 3 HIV screening ELISA 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 Nereaktivní virus Akutní infekce anti-hiv CD4+ 0 Diagnostické 0 okno 6 12 Doba od infekce (měs.) Reaktivní Potvrzení ELISA Reaktivní Následné testy opakování testu molekulární metody (RT PCR, virová nálož) Výsledek - pozitivní
Nové metody Klasické metody Koncentrace v plasmě Nové metody detekce HIV Bez nutnosti práce s infekčním materiálem Použitelnost v tzv. point of care Detekce v akutní fázi virové proteiny virová RNA Rychlost Senzitivita Jednoduchost Časnost Počet CD4+ lymfocytů/mm 3 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Akutní infekce Srovnání detekovatelnosti virových komponent a protilátek virus CD4+ vrna p24 anti-hiv 0 6 Doba od infekce (měs.) IgM celkové IgG 3 1 2 3 4 5 6 12 16 Doba od infekce (týdny)
Web of Science Několik zajímavých článků: HIV detection V letech 2011-2013 Analytická chemie 34 relevantních publikací 1. Esseghaier, C., A. Ng, and M. Zourob, A novel and rapid assay for HIV-1 protease detection using magnetic bead mediation. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 41: p. 335-341. 2. Jangam, S.R., et al., A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 42: p. 69-75. 3. Lee, J.H., B.K. Oh, and J.W. Choi, Electrochemical sensor based on direct electron transfer of HIV-1 Virus at Au nanoparticle modified ITO electrode. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 49: p. 531-535. 4. Ruslinda, A.R., et al., Effects of diamond-fet-based RNA aptamer sensing for detection of real sample of HIV-1 Tat protein. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 40(1): p. 277-282. 5. Sassolas, A., L.J. Blum, and B.D. Leca-Bouvier, Optical detection systems using immobilized aptamers. Biosensors & Bioelectronics, 2011. 26(9): p. 3725-3736. 6. Wang, J.H., et al., An integrated chip capable of performing sample pretreatment and nucleic acid amplification for HIV-1 detection. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 41: p. 484-491. 7. Hu, J., et al., Sub-attomolar HIV-1 DNA detection using surface-enhanced Raman spectroscopy. Analyst, 2010. 135(5): p. 1084-1089. 8. Guo, Y.H., et al., A label-free biosensor for DNA detection based on ligand-responsive G-quadruplex formation. Talanta, 2013. 114: p. 138-142. 9. Martic, S., M. Labib, and H.B. Kraatz, On chip electrochemical detection of sarcoma protein kinase and HIV- 1 reverse transcriptase. Talanta, 2011. 85(5): p. 2430-2436. 10. Zheng, A.H., et al., A label-free signal amplification assay for DNA detection based on exonuclease III and nucleic acid dye SYBR Green I. Talanta, 2013. 114: p. 49-53.
Nové metody detekce HIV současné směry Detekce virových proteinů virových nukleových kyselin protilátek (Bio)sensory Nanočástice Sekundární struktury nukleových kyselin Aptamery Paramagnetické částice Elektrochemická detekce Mikrofluidika PCR metody pro použití v point of care
Slovní mrak (word cloud, tag cloud) - množina slov zadaného textu, ve které jsou slova uspořádána podle četnosti (frekvence) v textu. Četnost slova v rámci zadaného textu je vyjádřena velikostí či barvou slov (čím větší slovo, tím vyšší četnost). Množina je uspořádána do podoby fiktivního mraku. http://www.jasondavies.com/wordcloud/#
Shrnutí Detekce virových komponent Časná fáze infekce Diskrepance mezi klasickými metodami laboratorní diagnostiky a metodami pro časnou detekci HIV
Děkuji za pozornost! Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu