Příušnice. strategie laboratorní diagnostiky u vysoce proočkované populace

Transkript

1 Příušnice strategie laboratorní diagnostiky u vysoce proočkované populace Radomíra Limberková F.Sedláček, J.Poustková, O.Hégrová, M.G.Schreinerová, J.Trmal VIII. Hradecké vakcinologické dny

2 Laboratorní průkaz onemocnění příušnicemi vyhl.473/2008 o systému epidemiologické bdělosti pro vybrané infekce ve znění vyhlášky č.233/2011; příl. č.14 Systém epidemiologické bdělosti příušnic; čl.2 - Laboratorní diagnostika 1. Přímý průkaz nevakcinálního kmene viru příušnic izolací z klinického vzorku odebraného v akutní fázi onemocnění 2. Detekce nukleové kyseliny nevakcinálního kmene viru příušnic izolací z klinického vzorku odebraného v akutní fázi onemocnění 3. Detekce IgM protilátek proti viru příušnic u osob, které nebyly v posledních 6 týdnech očkovány 4. Průkaz sérokonverze nebo výrazného, několikanásobného vzestupu hladiny specifických parotitických IgG protilátek vyšetřením dvojice vzorků sér nebo slin osob, které nebyly v posledních 6 týdnech očkovány 5. Průkaz vzrůstu hladin již existujících parotitických IgG protilátek u reinfekcí 6. Detekce antigenu nevakcinálního kmene viru příušnic (DFA) pomocí specifických parotitických monoklonálních protilátek v klinickém vzorku, odebraném v akutní fázi onemocnění Ke správné interpretaci laboratorních výsledků je třeba brát v úvahu též klinické a epidemiologické údaje včetně statusu očkování.

3 Doporučení WHO WHO doporučuje provádění molekulárně epidemiologických studií zahrnujících genotypizaci recentních příušnicových kmenů jako součást programu surveillance. Detailní monitoring by mohl pomoci objasnit vzorce cirkulace viru, jeho evoluci a rovněž by mohl napomoci k vytvoření strategie kontroly nad vznikajícími epidemiemi. Pro detailní monitoring ovšem v ČR chybí legislativní opora, neboť na rozdíl od spalniček a zarděnek, pro příušnice není vyhláškou stanovena povinnost zasílání izolátů z klinických vzorků do NRL k dalšímu určování.

4 Současná praxe v laboratorní diagnostice příušnic 1. sérologie - běžně zasílanými klinickými vzorky jsou diagnosticky méně vhodná akutní séra, jejichž vyšetřením obvykle získáme problematicky interpretovatelná data a pro definitivní diagnostický závěr je nutné provést vyšetření párového vzorku séra, čímž je laboratorní závěr oddálen 2. vhodnější možnost přímého průkazu infekčního agens není zatím využívána, ačkoli se jedná o neinvazivní způsob odběru s výhodou rychlého diagnostického závěru (RT-PCR)

5 Vhodné vzorky pro přímý průkaz - Stěr z bukální sliznice, sliny nejpozději do 9.dne od začátku klinických příznaků (ideálně do 3.-4.dne) - Moč nejpozději do 9.dne od začátku klinických příznaků (ideálně do 4.dne) méně vhodná (náročnější ke zpracování, cytotoxická na tkáňové kultury) Příušnice: příručka pro odběr, skladování a transport klinického materiálu - Likvor parotitická meningitida

6 Skladování a transport vzorků Bukálně orální stěry, sliny, moč do 24 hodin od odběru při teplotě +4 C dlouhodobě při teplotě -70 C, při přepravě nesmí rozmrznout (suchý led) Sérum do týdne od odběru při teplotě +4 C dlouhodobě při teplotě -20 C

7 Nejvhodnější klinické vzorky Ideální sestava zaslaného klinického materiálu: - vzorek pro přímý průkaz + párové sérum Reálná sestava klinického materiálu - vhodná pro zjištění primárního či sekundárního selhání vakcinace u vzorků s prokázanou přítomností viru příušnic (PCR, TK) - vzorek pro přímý průkaz + akutní sérum

8 Sérologický průkaz primárního či sekundárního selhání vakcinace vyšetřením akutního vzorku séra u pacientů s pozitivním záchytem viru příušnic RRL RKI, Berlín primární selhání vakcinace (= primoinfekce) IgM pozitivní IgG negativní,hraniční, pozitivní sekundární selhání vakcinace (= reinfekce) IgM negativní IgG pozitivní, rychle se zvyšující

9 Specifika diagnostiky vakcinovaných FALEŠNĚ NEGATIVNÍ NÁLEZY U VAKCINOVANÝCH OSOB: v akutním séru často nejsou detekovatelné IgM protilátky (až u 30%) u párových sér často nedochází k očekávanému signifikantnímu vzestupu titru protilátek ani sérokonverzi v párových sérech vakcinovaní vylučují méně viru a po kratší dobu, protože IgG protilátky stoupají v akutní fázi často velmi rychle (nutnost časného odběru nejlépe do 3.dne) 80% nemocných v ČR patří mezi vakcinované osoby Nespolehlivá sérologie - jednoznačným průkazem probíhající infekce je izolace viru či průkaz virové RNA

10 Diagnostické metody NRL PŘÍMÝ PRŮKAZ VIRU: 1. Izolace na tkáňových kulturách Vero 2. RT-PCR Mumps Virus RT-PCR kit, Shanghai ZJ, BioTech SÉROLOGIE: 1. ELISA Enzygnost Anti-ParotitisVirus/IgM, Siemens Enzygnost Anti-ParotitisVirus/IgG, Siemens 2. Hemaglutinačně inhibiční test (HIT) 3. Virus neutralizační test (VNT)

11 Vzorky k přímému průkazu viru příušnic únor-květen stěrů z bukální sliznice zejména od ambulantních pacientů infekčních klinik z regionů se zvýšeným výskytem onemocnění (5 z nich nebylo validních nestandardní odběr a nevhodné dlouhodobé skladování - 40 dní při +8 C) - odebrané převážně v počátku klinické manifestace onemocnění (do 4.dne od začátku onemocnění) - časnost odběru (nejlépe do 3.dne) je pro záchyt viru nezbytná zejména u vakcinovaných

12 Růstové vlastnosti příušnicových kmenů izolovaných v roce 2012 Virus má velmi dobré růstové vlastnosti: - cytopatický efekt obvykle již od 3.dne 1.pasáže - i z PCR negativního vzorku se podařilo izolovat virus - izolace viru i ze vzorku, který byl 40 dní uchovaný v lednici a nestandardně odebrán matka této pacientky (1968) hospitalizace - mening., pankreatitis dvě vakcinované sestry neonemocněla, 2003 onemocněla pozitivní záchyty kmenů příušnic (izolace, PCR) 16/27 59,25% resp. 15/22 68,18% (pouze validní vzorky)

13 Přímý průkaz viru-vyšetřovací schéma Izolační pokus pozitivita 13x identifikace (RT-PCR, IHAd, HIT) 27 stěrů negativita, bakt.kontam, atyp.cpe 5x 6x 3 x HSV-1 RT-PCR pozitivita negativita 3x (2x BK, 1x CPE HSV-1)

14 Výsledky izolace na buňkách Vero Místo Počet vzorků TK + TK - BK HSV Genotypizace Karlovy Vary Pardubice Teplice Praha Praha Liberec celkem x PCR + 3 1xPCR + 12

15 Genom viru příušnic - jednovláknitá nesegmentovaná RNA negativní polarity nukleotidů - 7 genů pro následujících 7 proteinů genomové mapy: core proteiny: 1. nukleokapsidový (NP) 2. phosphoprotein (P) V a I 3. membránový matrix (M) 4. large (L) povrchové glykoproteiny: 5. fúzní (F) 6. hemaglutinin-neuraminidáza (HN) nejvariabilnější s neobjasněnou funkcí: 7. small hydrophobic (SH)

16 SH protein na základě sekvenční analýzy genu SH proteinu (nejvariabilnější části genomu viru příušnic) se kmeny viru příušnic dělí na jednotlivé genotypy v současnosti je známo třináct genotypů: A-M v rámci daného genotypu existují varianty genotypy C, D, E, G, H - západní polokoule B, F, I - Asie genotypy C, D, G, H, I, J jsou považovány za neuropatogenní genetický základ neurovirulence není zatím objasněn v určitém geografickém regionu může současně cirkulovat více genotypů, např Španělsko: genotyp H hromadný výskyt genotyp D sporadické případy

17 Označení NRL Kmeny viru příušnic zaslané ke genotypizaci do RRL RKI Místo odběru Označení RRL Rok narození Vakcinační status MuVi-CZE12-56 Karlovy Vary dávky MuVi-CZE12-59 Karlovy Vary dávky MuVi-CZE12-72 Pardubice neznámo MuVi-CZE12-73 Pardubice dávky MuVi-CZE12-77 Pardubice dávky MuVi-CZE12-80 Pardubice dávky MuVi-CZE12-81 Pardubice dávky MuVi-CZE12-86 Pardubice nevakcinován MuVi-CZE12-89 Pardubice dávky MuVi-CZE Teplice dávky MuVi-CZE Praha dávky MuVi-CZE Praha dávky

18 Výsledky genotypizace z RRL RKI ze všech 12 zaslaných kmenů (2 KV, 7 PA, 2 Pha,1 TE) byla úspěšně extrahována MuV RNA a následně byla provedena sekvenace 316 nukleotidů genu SH proteinu všechny izolované kmeny viru příušnic v ČR - genotyp G genotypizované kmeny z daných regionů se liší: jedním nukleotidem: varianta Karlovy Vary ( shodné s Prahou 10) varianta Pardubice (shodné s Prahou 5) jedním nukleotidem od varianty Pardubice a dvěma nukleotidy od varianty Karlovy Vary: varianta Teplice

19 Sekvence nukleotidů reprezentující jednotlivé varianty genotypu G >MuVi-CZE Karlovy Vary AAGAATGAATCTCATGGGGTCGTAACGTCTCGTGACCCTGCCGTTGCACTATGC CGGCGATCCAACCCCCATTATACCTCACATTTCTATTGCTAATTCTTCTTTATCTG ATCATAACTTTGTATGTCTGGATTATATTAACTGTTACTTATAAGACTGCGGTGCG ACATGCAGCACTGTACCAGAGATCCTTCTCTCACTGGAGTTTCGATCACTCACTC TAAGAAGATCCCCAGTTAGGACAAGTCCCGATCCATCATGCAAGAACAATCTGC ATTTGAATAATGCCGTTCAATCATGAGACATAAAGAAAAAA >MuVi-CZE Pardubice AAGAATGAATCTCATGGGGTCGTAACGTCTCGTGACCCTGCCGTTGCACTATGC CGGCGATCCAACCCCCATTATACCTCACATTTCTATTGCTAATTCTTCTTTATCTG ATCATAACTTTGTATGTCTGGATTATATTAACTGTTACTTATAAGACTGCGGTGCG ACATGCAGCACTGTACCAGAGATCCTTCTTTCACTGGAGTTTCGATCACTCACTC TAAGAAGATCCCCAGTTAGGACAAGTCCCGATCCATCATGCAAGAACAATCTGC ATTTGAATAATGCCGTTCAATCATGAGACATAAAGAAAAAA >MuVi-CZE Teplice AAGAATGAATCTCATGGGGTCGTAACGTCTCGTGACCCTGCCGTTGCACTATGC CGGCGATCCAACCCCCATTATACCTCACATTTCTATTGCTAATTCTTCTTTATCTG ATCATAACTTTGTATGTCTGGATTATATTAACTGTTACTTATAAGACTGCGGTGCG ACATGCAGCACTGTACCAGGGATCCTTCTTTCACTGGAGTTTCGATCACTCACTC TAAGAAGATCCCCAGTTAGGACAAGTCCCGATCCATCATGCAAGAACAATCTGC ATTTGAATAATGCCGTTCAATCATGAGACATAAAGAAAAAA

20 Distribuce hlášených genotypů, (údaje k dubnu 2012) G H C J B C D J D G F G H I G D,C,H H J K

21 Výskyt genotypu G 2004/05 UK 2005/06 ČR 2006 USA 2007/08 Kanada (současně i genotyp D) 2008/09 Makedonie (6% komplikací: 39% orchitid, 4,7% meningitid) 2009 Nizozemí (16% komplikací: 20% orchitid, 4% meningitid) 2010 Bavorsko (většina komplikací-orchitidy) 2010/11 Skotsko 2012 ČR (10,9 % komplikací-očkovaní v 8%, neočkovaní 27%; orchitida 6% očkovaných a 21% neočkovaných; meningitis 1,2% očkovaných a 4% neočkovaných)

22 Genotypy a účinnost vakcinace - ve vakcíně je obsažen příušnicový kmen Jeryl Lynn (genotyp A), který je fylogeneticky odlišný od cirkulujících genotypů - největší antigenní rozdílnost je mezi genotypy A x B - D A x G - I - výsledkem je nekompletní zkřížená neutralizace Přesto zatím nejsou jednoznačné důkazy o tom, že by genotypová neshoda současných kmenů vedla k selhávání vakcinace či že by byla epidemiologicky významná. Účinnost vakcinace ve vztahu ke genotypu, ale i možnost přispění vyvanutí imunity ke zvýšenému výskytu onemocnění, jsou široce řešenou stále otevřenou otázkou.

23 Genotypy a účinnost vakcinace Mumps virus neutralizing antibodies do not protect against reinfection with a heterologous mumps virus genotype; Johan Nojd a kol.; Vaccine 19 (2001) vakcinací JL (1996) nedošlo k vytvoření průkazných VN Ab proti genotypu A - v séru jen VN Ab proti genotypu D (onemocnění v dětství souběh cirkulace A a D genotypu ve Švédsku ) - VN Ab proti genotypu D neochránily před chronickým onemocněním genotypem A (V-X /1999) - až v II /2000 prokazatelné VN Ab proti A X Antibody Induced by Immunization with the Jeryl Lynn Mumps Vaccine Strain Effectively Neutralizes a Heterologous Wild-Type Mumps Virus Associated with a Large Outbreak; S.A. Rubin a kol.; J Infect Dis. (2008); 198 (4): geometrický průměr titrů VN Ab proti genotypu G byl asi o polovinu nižší než proti genotypu A; - titry VN Ab proti oběma genotypům s časovým odstupem od vakcinace klesaly (10 let po 2.dávce na úroveň titrů před její aplikací); - protilátky indukované vakcinací efektivně neutralizovaly virus genotypu G u všech 88 osob Long-Term Persistence of Mumps Antibody after Receipt of 2 Measles-Mumps-Rubella (MMR) Vaccinations and Antibody Response after a Third MMR Vaccination among a University Population A. A. Date a kol.; J Infect Dis.(2008); 197: EIA IgG+ 94% (ze 440 osob); 28 osob IgG- ; 19 IgG- dostalo 3. dávku vakcíny - 1 osoba nadále EIA IgG- (průkaz reakce paměťových B buněk nešlo o primární selhání vakcinace) - VN Ab proti genotypu A u 91 EIA pozitivních osob, titr 1:4 vakcinovaní < 1-5 lety 95% vakcinovaní > 15 lety 58% X

24 Současné cíle NRL - zkvalitnění laboratorní diagnostiky onemocnění opřené především o přímý průkaz agens (izolace viru, PCR) jako jednoznačného průkazu probíhající infekce - vyšetřování dalšími sérologickými metodami (HIT, VNT), neboť doposud rutinně uplatňované sérologické vyšetření metodou ELISA (IgG/IgM) neposkytne vždy jednoznačný diagnostický závěr - získání komplexních informací o cirkulujících kmenech na území ČR a sérologické odpovědi nemocných, neboť vzhledem k rozdílnosti neutralizačních epitopů u různých genotypů nelze vyloučit, že imunita zajišťovaná virem určitého genotypu nebude stejně účinná proti kmenům jiných genotypů

25 Závěr Nemocnými jsou převážně vakcinovaní mladí dospělí jedinci s delším časovým odstupem od aplikace vakcíny (kolem 15 let), poměrně častý je i výskyt komplikací, zejména pak orchitidy a meningitidy. Specifika laboratorní diagnostiky vakcinovaných osob vede k nutnosti změny vyšetřovací strategie zaměřené více na přímý průkaz infekčního agens. Monitorování genotypové distribuce příušnicových kmenů a genotypově specifické imunity populace je ve vakcinální éře, vzhledem ke kontinuální evoluci viru a tlaku na výběr vakcíny, nezbytné.

26 Poděkování všem spolupracujícím infekčním klinikám a příslušným hygienickým stanicím