1
2
Brevipalpus phoenicis je polyfágní roztoč žijící v oblasti tropů a subtropů, kde ničí citrusy, papáju, čaj, kávu atd. za miliony dolarů ročně. Jeho populace je složená výhradně ze samic množících se výhradně partenogeneticky (vzácně se vyskytnuvší samci nemají žádnou funkci), nejbližší příbuzné druhy se množí také partenogenezí nebo haplodiploidií. B. phoenicis má dva chromosomy a pomocí cytogenetických technik se podařilo prokázat, že tyto chromosomy nejsou homology, neboli že tento druh je haploidní. Je to tedy jediný známý případ haploidních samic u živočichů. Haploidie je s největší pravděpodobností způsobena vnitrobuněčnou bakterií, která manipuluje pohlavím hostitele směrem k samicím, přes které je přenášena do další generace. Když byli roztoči přeléčeni antibiotiky, začali se z neoplozených vajíček líhnout samečci, původním mechanismem determinace pohlaví je tedy haplodiplodie a za nepřítomnosti bakterie by určovala pohlaví B. phoenicis dodnes. Weeks et al. 2001 3
4
Polyploidizace je jev poměrně běžný u rostlin (velká část druhů rostlin vznikla polyploidizací), u živočichů vzácnější a přítomná jen v některých skupinách. K opakovaným polyploidizacím docházelo a dochází u ryb a obojživelníků, u ryb se také polyploidizace navozuje uměle z šlechtitelských důvodů. U člověka sice vznikají tri- a tetraploidní embrya, ale tento stav je letální. Polyploidizace funguje velmi často jako reprodukční bariéra mezi polyploidem a rodičovskou populací, takže díky ní vznikají nové druhy. 5
Polyploidie můžeme rozlišit podle toho, zda buňka obsahuje sudý (ortoploidie) nebo lichý (anortoploidie) počet sad chromosomů. Lichý počet chromosomálních sad způsobuje problémy s rozchodem chromosomů v meióze, což vede ke sterilitě (téměř nevznikají funkční gamety). U ortoploidů je tento problém menší (nicméně také často mají problémy s meiózou), ale pokud by došlo ke křížení s diploidním jedincem, vznikne sterilní anortoploidní potomek. Je tedy žádoucí, aby docházelo k páření mezi jedinci stejné ploidie. Pokud je polyploid schopen samooplození, což je případ řady rostlin, může bez problémů produkovat potomstvo vznikl nový druh. U živočichů, kteří nemají možnost samooplození, je polyploidizace životaschopná jen pokud se polyploid dokáže množit partenogeneticky. Příkladem takového druhu je triplodiní partenogenetická ještěrka Aspidoscelis neomexicana, která je hybridem A. inortana a A. tigris. 7
Podle toho, zda došlo k duplikaci genomu v rámci druhu nebo při mezidruhové hybridizaci, rozlišujeme dva typy ploidií: autopolyploidie v rámci druhu, vzniklý polyploid obsahuje jen jeden typ genomu, a allopolyploidie hybridizací vznikne jedinec s různými rodičovskými genomy. Allo- i autopolyploidie způsobují ihned po vzniku masivní epigenetické změny a s tím spojenou vyšší aktivitu mobilních elementů, oba typy ploidií poskytují materiál k neofunkcionalizaci, atd. Ale allopolyploidie je zdá se výhodnější než autopolyploidie, protože dva různé genomy poskytují více alel, více proteinových interakcí, dochází k heteróznímu efektu, hybridi mají širší ekologický záběr než rodičovské druhy, vykazují vyšší rezistenci k parazitům než jeden nebo oba rodičovské druhy.
Většina informací, které máme o tom, co se děje bezprostředně po polyploidizaci, pochází z rostlin, kde se jednak vyskytují přirození polyploidi a jednak lze u mnoha druhů uměle polyploidy generovat. Relativně recentní duplikace genomu u obratlovců se odehrály u různých žab, ryb čeledí Salmonidae a Cyprinidae, a některých ještěrek. Přesto jsou vlivy polyploidizace u obratlovců zatím málo studované. Polyploidičasto vykazují aneuploidii, která je způsobená poruchami v meióze. Časté přestavby jsou způsobeny homeologní rekombinací spojenou s nepřesným párováním. Homeologní rekombinace je také spojena se ztrátou homeoalel u části gamet. Čím větší byly rozdíly mezi homeology, tím dramatičtější jsou následné přestavby, zahrnující inverze, translokace, tvorbu dicentrických chromosomů. Bezprostředním efektem jsou i poruchy v epigenomu, což má vliv na expresi genů a na aktivitu mobilních elementů. Geny duplikované při polyploidizaci mají vyšší naději na přežití, než geny duplikované tzv. segmentální duplikací, protože polyploidizace zachovává všechny interagující geny, zatímco duplikace menšího segmentu kopíruje jen část dráhy, jeden gen nebo jeho část. Obecně geny vzniklé segmentální duplikací vznikají častěji, ale přežívají v průměru několik milionů let, zatímco geny vzniklé polyploidizací u drápatek přežily desítky milionů let.
Duplikované geny může potkat řada osudů. Nejpravděpodobnější je to, že jedna z kopií je vyřazena mutací a gen je změněn na pseudogen. To může být žádoucí, pokud samostatně duplikovaný gen (vs. polyplodizace) narušuje rovnováhu genových produktů, které spolu interagují, např. v metabolické dráze. Gen může být vyřazen buď mutací v kódující oblasti (záměna nukleotidů, delece, inzerce), nebo degenerací regulačních faktorů, epigenetickou inaktivací nebo fungováním MEs. Pokud jsou zachovány obě kopie, mohou existovat obě beze změny, pokud je výhodné mít dvě kopie takového genu (např. jako pojistka proti škodlivým mutacím nebo pokud je výhodné mít více genového produktu, např. geny pro histony nebo rrna). Jedna z kopií genu může díky mutaci získat novou funkci (neofunkcionalizace). Případně může jedna nebo obě kopie ztratit některou z funkcí, které měl původní gen (subfunkcionalizace), čili dojde ke specializaci, kdy každá z kopií zastává jednu z funkcí původního genu, případně se mohou obě kopie exprimovat na různých místech nebo v jiném čase. Evans 2008 10
Zvýšení odolnosti ke škůdcům a nepříznivému prostředí Navození polyploidie v některých případech vede ke zvýšení odolnosti k biotickým i abiotickým faktorům. Není to však pravidlem a někdy je efekt opačný. Výhodnější je produkce allopolyploidů z druhů, které využívají různé sekundární metabolity na obranu proti stresorům, protože sekundární metabolity jsou obvykle aditivní. Výsledný hybrid tak produkovat všechny enzymy a obrané látky, jako oba jeho rodiče. Zvětšení velikosti - Větší genom vede k větší velikosti buňky, což může být ve šlechtitelství kýženým znakem. Na některé hybridy to ale má špatný vliv, např. tetraploidi jablek jsou sice větší, ale vodnatí a špatného tvaru. Ke komerčním účelům se proto pěstují triploidi. Ploidie je žádaná i u dekorativních květin, které jsou mohutnější a déle vydrží. Zahradní jahoda je oktoploid. 12
Výroba sterilních kultivarů Při uvádění nových druhů do krajiny je žádoucí předejít tomu, aby se nekontrolovaně množily. Nejefektivnější metodou je navození polyploidie, která je často provázena problémy s párováním a rozchodem, takže jedinec netvoří funkční gamety. Triploidní jedinci, kteří netvoří semena, jsou žádaní v produkci ovoce. Některé druhy ale mají tzv. interploidní blok, čili jedinci různých ploidií se nekříží. To lze vyřešit kultivací triploidního endospermu in vitro, ze kterého za vhodných podmínek vznikne embryo a z něj rostlinka. Tento přístup byl úspěšně využit např. u jablek, citrusů, kiwi, mučenky, akácie, rýže a papáji. 13
Znovunastolení fertility u hybridů vdálených druhů Pokud jsou rodičovské druhy fylogeneticky vzdálené a tedy jejich genomy diverzifikované, jejich hybridi jsou často neplodní. Důvodem je problém s párováním homeologů a následně jejich špatný rozchod v meióze, což vede ke vzniku aberantních gamet. Zdvojením sad chromosomů se každý chromosom má s kým párovat a může se správně rozejít, takže vzniklé gamety mají správný počet chromosomů a jsou funkční. Tímto způsobem vznikla třeba Chitalpa tashkentensis (kříženec Chilopsis linearis a Catalpa bignonioides). 14
Případem znovunastolení fertility polyploidizací je produkt mezirodového křížení zelí a ředkvičky tzv. Raphanobrassica, Pokus prováděl ve 30. letech 20. století sovětský genetik G.D. Karpečenko a jeho cílem bylo získat rostlinu, která bude mít kořeny ředkvičky a listy zelí. Výsledek byl přesně opačný a vzniklá rostlin navíc netvořila téměř žádná semena. Z těch, která přece vznikla, vyrostly allotetraploidi, čili semena vznikla díky náhodné tetraploidizaci. 15
16
Aneuploidie jsou u člověka nejčastější příčinou raných potratů. Z tabulky shrnující výskyt trisomií autosomů u člověka vyplývá, že některé trisomie jsou natolik závažné, že nejsou vůbec zachytitelné ani u potracených plodů (1 a 19) a drtivá většina dalších vede k potratu. Jen trisomie 13, 18 a 21 jsou slučitelné se životem, i když trisomie 13 (Patauův syndrom) a 18 (Edwardsův syndrom) způsobují tak závažné poškození, že děti obvykle umírají krátce po porodu. Jediná trisomie, jejíž nositelé se mohou dožít dospělosti, je trisomie 21 (Downův syndrom). Sumner 2003 17
18
Robertsonovská translokace je významným jevem v evoluci karyotypu druhů. Jedná se o fúzi akrocentrických chromosomů, při které dojde k ztrátě krátkých ramének a dlouhá raménka obou akrocentriků jsou spojena v jeden chromosom s jednou centromerou. Jedinec, který je heterozygotní pro Robertsonovkou translokaci, produkuje tři druhy gamet: normální (nesou správný počet nesfúzovaných chromosomů), balancované (nese zfúzovaný chromosom) a nebalancované (část genetického materiálu jim chybí nebo přebývá). 19
20
Dvouřetězcové zlomy DNA u monocentrických chromosomů generují acentrické fragmenty (= fragmenty bez centromery), které se během metafáze nemohou zachytit na dělící vřeténko a jsou během několika generací ztraceny. Konce chromosomů bez telomer jsou lepivé a mají tendenci se spojovat, takže vnikají dicentrické chromosomy, které se v anafázi nemohou rozejít a vytvářejí tzv. anafázní můstky, což způsobí blok buněčného dělení. U holokinetických chromosomů, které mají kinetochor po celé délce/většině chromosomu, ke ztrátě fragmentů nedochází, protože se mohou navázat na dělící vřeténko. 21
22
Segmentální duplikace je zdvojení části chromosomu. Nejčastějším mechanismem je ektopická rekombinace, čili homologní rekombinace mezi úseky, které se nacházejí na různých místech chromosomu/ů (hlavně mobilními elementy). Vyskytují se ve všech genomech, i když u různých druhů jsou různě významné. Jejich prostřednictvím genom získává nový a nadbytečný genetický materiál, které může využít pro nové účely. Segmentální duplikace byly např. klíčové pro evoluci primátů. Geny v segmentálních duplikacích primátů se často účastní imunitní reakce, olfaktorického rozpoznávání, odbourávání xenobiotik a reprodukce. Naopak málo zastoupené jsou geny účastnící se běžného buněčného metabolismu a základních funkcí, patrně proto, že změna jejich exprese by byla předmětem silné purifikující selekce. Některé geny, které odlišují člověka od šimpanze vznikly duplikací. Příkladem je expanze genu pro amylázu (AMY1), který kóduje enzym z počátku metabolické dráhy škrobu a glykogenu. Tohoto genu má člověk 3x víc než šimpanz (a stejně tak i jeho produktu), což je pravděpodobně adaptace na množství potravy bohaté na škrob v zemědělských kulturách. Duplikace genu a rezistence Dobře prozkoumaným případem adaptace na insekticid duplikací genů je komár Culex pipiens, který byl na jihu Francie dlouhodobě vystavován tlaku insekticidů. Odpovědí byla duplikace genů pro dvě nespecifické esterázy Est-2 a Est-3, které odbourávají organofosfáty, a Ace1, lokus, který kóduje enzym acetylcholinesterázu, která je hlavním cílem organo-fosfátových insekticidů. 23
Inverze jsou další aberací, která je významná pro evoluci genomu. U heterozygotů pro inverzi mezi invertovanými úseky nedochází k párování homologů a nemůže dojít k rekombinaci, kombinace alel tak zůstávají zachované. To je důležitý mechanismus při speciaci, kdy zůstávají při obě varianty genů, které jsou např. zodpovědné za znaky odlišující vznikající druhy a za jejich rozpoznávání. Inverze jsou důležité i pro evoluci pohlavních chromosomů (viz přednáška č. 07). Obrázek z http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/ 24
Filadelfský chromosom je změna v karyotypu, která vzniká reciprokou translokací mezi chromosomy 9 a 22 ((t(9;22)(q34.1;q11.2)). Je typická pro chronickou myeloidní leukemii (95% pacientů), ale je přítomná i u akutní lymfoblastické leukemie (25-30% dospělých a 2-10% dětí) a příležitostně u akutní myeloidní leukemie. Translokací vzniká prodloužený chromosom 9 a zkrácený chromosom 22 (Filadelfský chromosom), který nese fúzní onkogen BCR-Abl, vzniklý spojením genu Abl1 z chromosomu 9 a část genu BCR ("breakpoint cluster region") z chromosomu 22. Gen Abl1 kóduje tyrosin kinázu, která řídí aktivitu dalších genů řídících buněčný cyklus. Onkogen BCR-Abl je transkribován kontinuálně, což vede k neregulovanému růstu buněk, čili k rakovině. Navíc inhibuje reparaci DNA, což vede k další nestabilitě genomu. K léčbě se používají inhibitory tyrosin kinázy. Označení Ph chromosomu (t(9;22)(q34.1;q11.2) znamená translokace podproužku 1 z proužku 4 z oblasti 3 z chromosomu 9 na podproužek 2 z proužku 1 z oblasti 1 chromosomu 22. (Obrázky a info z http://en.wikipedia.org/wiki/philadelphia_chromosome) Obrázky z: http://www.broadinstitute.org/blog/visualizing-genome-disarray 25
Obrázek z http://www.mun.ca/biology/scarr/robertsonian_fusion.html 26
Robertsonovská traslokace může být příčinou Downova syndromu, pokud k fúzi došlo mezi chromosomem 21 a dalším akrocentrikem. Sám nositel balancované translokace je v pořádku, ale část jeho gamet je nebalancovaných a nese oba chromosomy 21. Po oplození normální gametou vzniká jedinec s trisomií 21, čili s Downovým syndromem. Speciálním a vzácným případem je fúze obou chromosomů 21, kdy balancované gamety nemohou vniknout a všichni potomci balancovaného rodiče mají Downův syndrom. David-Padilla et al. 2009 http://apamedcentral.org/search.php?where=aview&id=10.0000%2famp.2009.43.1.12&code=0012amp&vmode=pubreader#!po=16.6667 27
Mutageny jsou látky, které zvyšují frekvenci mutací. Příklady chemických mutagenů analogy bazí nahrazují báze a způsobují chyby v párování mutace alkylační látky přidávají metylovou nebo etylovou skupinu k bazím chyba v párování interkalační látky vmezeření do DNA posun čtecího rámce látky deaminující báze přeměna cytosinu na uracil Fyzikální mutageny UV thyminové dimery = kovalentně spojené sousední thyminy, pokud nejsou opravené, způsobují problémy při replikaci DNA. Hlavní příčina melanomů. ionizující záření zlomy DNA Biologické mutageny mobilní elementy řada mechanismů, hlavně inserční mutageneze (vloží se do regulační/kódující sekvence genu), dále delece, duplikace,... viry inserční mutageneze
Wing spot test (test skvrn na křídlech) je elegantní, i když v současné době již málo využívaná metoda, jak testovat potenciální mutageny. Principem je křížení dvou čistých linií drozofil. První linie nese recesivní mutaci mwh (multiple hair wing), která způsobuje zmnožení trichomů na křídlech. Druhá linie nese recesivní mutaci flr (flare) způsobující deformované trichomy na křídlech. Oba geny jsou lokalizované na stejném chromosomu. Kříženci obou linií jsou heterozygotní pro obě recesivní mutace a mají tedy divoký fenotyp. Pokud dojde mezi homology k somatické rekombinaci, dostanou se na chromatidy stejného chromosomu mutantní alely obou genů. Po mitóze se v jedné dceřiných buňkách mohou sejít chromatidy nesoucí mutantní alely stejného genu, čili jedna buňka bude recesivní homozygot pro mwh, druhá pro flr. Potomci těchto buněk mají stejný genotyp, takže vedle sebe vzniknou dvě populace buněk, jedna s fenotypem mwh, druhá flr. Herozygoti jsou nakrmeni testovanou chemikálií a po nějaké době vyhodnoceni. Čím silnější je mutagen, tím více dvojitých skvrn se na křídle vyskytuje. Vyhodnocuje se minimálně 40 křídel ze samic, jedno křídlo má 30800 buněk. Metoda je tedy pracná, ale velmi citlivá.
30
Výměna sesterských chromatid (Sister chromatide exchange, SCE) SCE je výměna odpovídajících si částí dsdna mezi chromatidami jednoho chromosomu. K SCE dochází během S-fáze vlivem mutagenů, které interferují s replikací DNA (ionizující záření, chemikálie vážící se na DNA). Dochází k dvouřetězcovým zlomům DNA a k výměně částí sesterských chromatid. K SCE dochází přirozeně v malé míře, velké množství výměn ale ukazuje na vliv nějakého mutagenu na genom. Test na SCE se používá na testování potenciálních mutagenů a na otestování osob, které pracují v rizikových místech. K testu se používají buňky z periferní krve, které se kultivují po dobu 72 hodin (tak aby byly zastaveny v průběhu druhé mitózy) za přítomnosti bromo-deoxy-uridinu (BrdU), který je začleněn do nového řetězce DNA. Po druhé replikaci DNA obsahuje každý chromosom jednu chromatidu s jedním řetězcem s BrdU a jedním původním řetězcem DNA bez BrdU (ta se bude Giemsou barvit sytě) a jednou chromatidou s oběma řetězci DNA a BrdU (ta se bude barvit světle). Buněčné dělení je zastaveno kolchicinem, aby bylo co nejvíce buněk v metafázi, připraví se chromosomální preparát a obarví se Giemsou. Chromosomy, u kterých došlo k výměně sesterských chromatid, budou mít části chromatid světlé a jiné tmavé. Obrázek z http://atlasgeneticsoncology.org/kprones/blo10002.html Info z: http://www.crios.be/genotoxicitytests/sister_chromatid_exchange_test.htmhttp://www.bro adinstitute.org/blog/visualizing-genome-disarray http://en.wikipedia.org/wiki/sister_chromatid_exchange 31
32