Estradiol ELISA test pro kvantitativní stanovení estradiolu v lidském séru nebo plazmě Obj. číslo: 55030 96 testů kompletní souprava Účel použití Estradiol (1, 3, 5(10)-estratrien-3, 17ß-diol; 17ß-estradiol; E2) je steroidní hormon (C 18 ) s molekulovou hmotností 272,4 Da, obsahující fenolický A-řetězec. Je to nejdůležitější přírodní estrogen zjišťovaný u žen a také u mužů 1, 2. Estradiol je vylučován folikuly ženských vaječníků po stimulaci folikul stimulujícím hormonem (FSH) a je vylučován do oběhu. Asi 98% cirkulujícího hormonu je vázáno, zbývající část, volný estradiol, je považován za aktivní steroid 3. Účastní se vylučování gonadotropinu a stimuluje růst pohlavních orgánů a vývoj druhotných pohlavních znaků. Při normálních menstruačních cyklech netěhotných žen je estradiol vylučován cyklicky s bifázovou charakteristikou. Nejvyšší koncentrace je zjišťována před ovulací 4. Těhotné ženy vykazují zvýšenou hladinu estradiolu, mnohem vyšší než v normálních menstruačních cyklech 5. U mužů je estradiol vylučován nadledvinkami a varlaty. Jeho role je hůře definovaná, ale zdá se být zapojen do regulace gonadotropinů. Měření estradiolu je určeno pro terapeutické monitorování v případě neplodnosti (např. hormonální léčba nebo oplodnění in vitro ). Pomáhá také při hodnocení funkce vaječníků, ale jen zřídka se používá pro diagnostiku nádorů Princip - Kompetitivní EIA - Test Estradiol ELISA je založen na kompetetivní interakci estradiolu a hormon-enzymového konjugátu o omezený počet immobilizovaných (králičích) protilátek proti estradiolu. Množství vázaného hormon-enzymového konjugátu je tedy nepřímo úměrné koncentraci estradiolu ve vzorku. Po inkubaci vzorku a hormon-enzymového konjugátu v jamce je nenavázaný konjugát odstraněn promytím. Po přidání substrátového roztoku se vyvine modré zbarvení, které se po zastavení reakce Přerušovacím roztokem mění na žluté. Intenzita barev je nepřímo úměrná množství estradiolu ve vzorku. Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena s využitím mikrodestičekového ELISA spektrofotometru (HUMAREADER). Koncentrace neznámých vzorků je interpolována z kalibrační křivky za využití kalibrátorů séra o známých koncentracích estradiolu. Obsah soupravy [MIC] 12 Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém držáku) 8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené antiestradiolovými protilátkami (králičí) [CAL] A - G Kalibrátory (bile víčko) 7x1.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru Estradiol koncentrace: 0 (A), 25 (B), 100 (C), 250 (D), 500 (E), 1000 (F) a 2000 (G) pg/ml [CON] 25 ml Enzymový konjugát (bílé víčko) připraveno k použití, červené ph 6.9 ± 0.2 Estradiol-HRP konjugát BSA 0.5 % TRIS/MOPS buffer 0.05 mol/l NaCl 0.1 mol/l [WS] 30 ml Promývací roztok (černé víčko) Koncentrát pro asi 1200 ml ph 7.3 ± 0.1 Trisem pufrovaná sůl 3 mmol/l TWEEN 20 0.2 % [SUB] 14 ml Substrátový roztok (žluté víčko) ph 3.5-4 Připravené k použití 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 0,26 g/l Peroxid vodíku 0,015% Acetátový pufr 0.05 mol/l DMSO < 5 % [STOP]14 ml Ukončovací roztok (červené víčko) Kyselina sírová 0.5 mol/l 1 Lepící páska Konzervanty: Celková koncentrace <0,7% Bezpečnostní poznámky
Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním. [CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe. Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické ošetření) v souladu s příslušnými předpisy. [STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem. Stabilita Při skladování při teplotě 2 8 C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích. Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 8 C a použity během 60 dnů (viz Poznámky). [MIC] - uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem - před otevřením musí mít pokojovou teplotu - nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. Destičky skladované tímto způsobe lze použít do 60 dnů (viz poznámka). Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty! Příprava reagencií Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C Pracovní promývací roztok [WASH] -zřeďte [WS] 1200 ml čerstvé deionizované vody do vhodné nádoby. Lahvičku roztokem několikrát propláchnete. - Stabilita: 2 týdny při 15-25 C Vzorky Sérum nebo EDTA plasma Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky a vzorky obsahující azid sodný. Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 3 dny nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací. Pracovní postup Dodržujte postup přesně! Poznámky k postupu P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace. P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé. P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem P4: [MIC] vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku. P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek. P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku. P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance. P8: [SUB] inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP]. P9: [MIC] jemně kývejte s destičkou 20-30 sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce. Promývací procedura Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci. W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí. W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml). W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama. Pipetovací schéma Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu Krok 1 Jamka [µl] A1...F2 G2... [CAL] A-G; dvakrát 25 -- Vzorky, Kontroly; dvakrát -- 25 [CON] 200 200 Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou. Inkubujte 60 min při 20...25 C Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3) [WASH] 400 400 Krok 2 [SUB]
200 200 Inkubujte 15 min při 20...25 C (viz P8) [STOP] 100 100 Opatrně promíchejte. Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo během 30 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové délky 630-690 nm (je-li to možné). Platnost testu Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria: 1) Maximální absorbance (kalibrátor 2A) O.D. max. 1,0 2) Analyzujeme na třech úrovních: Koncentrace estradiolu při 80 % O.D. max. = 23,6 62,3 pg/ml Koncentrace estradiolu při 50 % O.D. max. = 62,7 165,3 pg/ml Koncentrace estradiolu při 20 % O.D. max. = 211,2 556,8 pg/ml Výpočet Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace estradiolu v neznámých vzorcích. 1. Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci estradiolu v pg/ml (nepočítejte z dvojic průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance). 2. Vytvořte regresní přímku. 3. Koncentraci estradiolu v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v pg/ml). Pro ilustraci viz obrázek. Interpretace výsledků Stanovení estradiolu v séru je indikováno při řadě poruch menstruace, jako je předčasná nebo opožděná puberta u dívek 11 a primární a sekundární amenorrhea a menopauza 7. Snížené hladiny estradiolu mohou být zjištěny při nedostatečné funkci vaječníků (< 10 pg/ml) nebo corpus luteum, ale také u anovulačních cyklů. Měření sérového estradiolu jsou důležitá pro monitorování navozené ovulace, např hormonem uvolňujícím LH (LH-RH) (8). Při oplodnění in vitro (IVF) je koncentrace sérového estradiolu obvykle monitorována denně pro optimální načasování podání lidského choriového gonadotropinu (hcg) a odběr oocytu 9. Zvýšené hladiny estradiolu byly zjištěny u pacientů s feminizujícímy syndromy, gynekomastií 10 a nádorem varlat 11. Stanovení hodnoty estradiolu samotné není postačující pro odlišení a diagnózu patologických stavů. Musí být použito ve spojení s jinými klinickými projevy a diagnostickými (hormonálními) parametry. Očekávané hodnoty Normální ženy: Folikulární fáze Vrchol ovulace Luteální fáze Menopauza Normální muži: konverzní koeficient: 1 pg/ml = 3,67 pmol/l Hladina estradiolu 30-120 pg/ml 130-370 pg/ml 70-250 pg/ml 15 60 pg/ml 15-60 pg/ml Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím technikám obecně v této laboratoři užívaným.
EL-ESTRA INF 5503001 GB 06-2004-4 Parametry testu Test ELISA estradiol firmy Human má analytickou citlivost 3-6 pg/ml vzorku. Vzorky s koncentrací estradiolu nad 2000 pg/ml musí být zředěny (1 + 9) kalibrátorem A (0 pg/ml) a znovu analyzovány. Výsledek násobte 10. Typické údaje o parametrech procesu můžete nalézt ve Verification Report dostupném na www.human.de/data/gb/vr/el-estra.pdf nebo www.human-de.com/data/gb/vr/el-estra.pdf Poznámka Výrobky jsou i po otevření stabilní do data exspirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu bezpečnosti stanoven 60denní limit pro používání po prvním použití. Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní práce (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy splnit kritéria kontroly kvality! (* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do
chladničky (2 8 C). Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbh Max-Planck-Ring 21 - D-65205 Wiesbaden - Germany Telefon: +49 6122 9988 0 - Telefax: +49 6122 9988 100 - email: human@human.de Literatura 1. Gore Langton, R. E., and Amstrong, D. T., In: The physiology of reproduction (Knobil, E.. et al ed.( Raven Press, 331-385 (1988) 2. Hall, P. F., Testicular steroid synthesis: Organisation and regulation, In: see 1., pp 975-998 3. Siiteri, P. K. et al, Rec. Prog. Horm. Res. 38, 457-510 (1982) 4. McNastty, K. P. et al, J. Endocrinol. 71, 77-85 (1976) 5. Simpson, E. R. and McDonald, P. C., In: Textbook of endocrinology (Williams, R. H. ed.) Philadelphia: Saunders, 412-422, (1981) 6. Jenner, M. R. et al, J. Clin. Endocrinol. 34, 521 (1982) 7. Goldstein, D. et al, Fertil. Steril. 37, 348-354 (1982) 8. Taubert, H. D. and Dericks-Tan, J. S. E., In: Ovulation in the Human (Crosignandi, P. G. and Mishell, D. R. eds.) Academic Press, New York, 265-273, (1976) 9. Wrambsy, H. et al Human Reproduction 2, 325-328 (1987) 10. McDonald, P. C. et al, J. Clin. Endocrinol. Metabol. 49, 905 (1979) 11. Peckham, M. J. and McElwain, T. J., J. Clin. Endocrinol. Metab. 4, 665-692 (1975)