LABORATOŘE OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Z Technologie prekurzorů léčiv onkologických onemocnění Vedoucí práce: Ing. Jan Svoboda Umístění práce: AS58 1
1 ÚVOD Platinová cytostatika tvoří nejvýznamnější skupinu léčiv nádorových onemocnění (až 60 % všech administrovaných cytostatik), přičemž tato onemocnění v současné době představují druhou nejčastější příčinu úmrtí po nemocech kardiovaskulárního systému. Prvním klinicky používaným platinovým cytostatikem se na sklonku 70. let minulého století stal komplex nazvaný cisplatina [cis-diammindichlorplatnatan]. Od jejího objevu uplynulo více než 60 let a do současné doby byly připraveny další generace platinových cytostatik s vhodnějšími farmakokinetickými i farmakodynamickými vlastnostmi. Mezi tato novější léčiva patří např. oxaliplatina či karboplatina. Slibný vývoj nových platinových cytostatik představuje dnešní 4. generace, kde se prosazují komplexy s centrálním atomem platiny v oxidačním stavu IV oproti původním komplexům v oxidačním stavu II. Tyto nově připravené platinové komplexy se kromě odlišného mechanismu působení v organismu odlišují od svých předchůdců i vyšší cytostatickou aktivitou a možností perorálního podání. Syntéza platinových cytostatik spočívá v reakcích platinového prekurzoru s příslušnými ligandy v jejich reaktivní formě. Relativní jednoduchý chemismus těchto syntéz vyvažují náročné separační procesy vedoucí k získání finálního produktu ve farmaceutické čistotě. Výchozím platinovým prekurzorem je pro látky v oxidačním stavu II komplex tetrachlorplatnatan draselný, K 2 PtCl 4 ; pro přípravu komplexů 4. generace je třeba připravit z tohoto komplexu přídavkem salmiaku (NH 4 Cl) v bazickém prostředí platinový prekurzor [trichloramminplatnatan] draselný, K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] (viz Schéma 1). Schéma 1: Syntéza K[Pt(NH 3 )Cl 3 ]. Důležitým prvkem výroby léčivých látek je analytický monitoring reakce a stanovení čistoty produktu, popř. stanovení čistoty výchozích látek. Ve farmaceutickém průmyslu je z tohoto pohledu nejvíce využívaná analytická charakterizace pomocí kapalinové chromatografie s UV-Vis detekcí, kde je sledováno množství nečistot. Nečistoty obsažené v produktu musí být identifikovány a případně při vyšší koncentraci kvantifikovány (limit identifikace nečistot 0,10 %, limit kvantifikace nečistot 0,15 %). V případě genotoxických nečistot jsou tyto limity ještě přísnější. Analytickou metodou zvolenou v této práci je vysokoúčinná kapalinová chromatografie s UV/Vis detekcí, kterou řadíme jak mezi analytické, tak mezi separační techniky. Na rozdíl od sloupcové chromatografie se tato metoda vyznačuje tím, že mobilní fáze s analytem je přiváděna na kolonu za zvýšeného tlaku (HPLC až 400 barů, UHPLC až do 1200 barů) pomocí vysokotlakého čerpadla. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie stejně jako sloupcová chromatografie využívá k separaci fyzikálně-chemických vlastností stacionární fáze a z nich plynoucích nevazebných interakcí (van der Waalsovy síly, elektrostatické síly, vodíkové vazby a π-π interakce). Na chromatografickou kolonu je pomocí autosampleru spojeného s čerpadlem pomocí vícecestného ventilu přiveden alikvotní objem vzorku. Jednotlivé analyty jsou následně z kolony eluovány v závislosti na jejich struktuře a složení mobilní fáze. Následně jsou jednotlivé analyty analyzovány pomocí detektoru (v našem případě se jedná o detektor UV/Vis) a výsledný signál vytváří chromatogram, kde je vyobrazen průběh absorbance (mau = mili Absorbance Unit) v čase. 2
2 CÍL PRÁCE Cílem této laboratorní práce je seznámení se s technologií platinového prekurzoru K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] s důrazem na monitorování kinetického průběhu reakce pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV/Vis detekcí (HPLC-UV, stanovení čistoty finálního produktu). 3 PRACOVNÍ NÁPLŇ Syntéza platinového prekurzoru a monitorování kinetiky vzniku produktu Sestavení kalibrační křivky pomocí HPLC-UV/vis pro K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] Separace surového produktu pomocí sloupcové chromatografie s iontoměničovou stacionární fází a následná rekrystalizace Analýza finálního produktu 4 POSTUP PRÁCE Příprava chromatografu pro měření, příprava mobilní fáze Syntéza K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] Monitorování průběhu reakce pomocí HPLC-UV Sestavení kalibrační křivky pro K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] Separace produktu (reverzní filtrace, sloupcová chromatografie, odpaření a rekrystalizace) Analýza produktu a stanovení výtěžku 4.1 HPLC-UV Pro měření v této práci bude použit přístroj HPLC Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific, USA). Systém je opatřen degasserem, kvartérní pumpou, autosamplerem, termostatem kolon a DAD detektorem. Vyhodnocení analýzy je provedeno pomocí softwaru Chromeleon 6.8. Podmínky HPLC-UV analýzy jsou uvedeny v tabulce 1. Tab. 1: Podmínky HPLC-UV měření Kolona: PhenoSphere SAX 80 Å, 250 x 4,6 mm, 5 μ Eluce: Isokratická Mobilní fáze: A: Methanol; 10 % B: Kyselina octová, 0,1 M; 80 % C: Fosfátový pufr, 0,1 M; 10 % Průtok: 1 ml min -1 Objem nástřiku: 10 μl Teplota kolony: 25 C Vlnová délka: 230 nm Šířka sběru dat: 4 nm Frekvence sběru dat: 5 Hz 4.2 Příprava mobilních fází pro HPLC Kyselina octová 0,1 M 500 ml Fosfátový pufr 0,1 M 100 ml, ph 3 3
Pro přípravu 0,1 M fosfátového pufru bude použito 4,985 mmol Na 2 HPO 4 2H 2 O (MW = 177,99 g mol -1 ) a 5,73 mmol NaH 2 PO 4 H 2 O (MW = 137,99 g mol-1). Výsledné ph bude upraveno pomocí kyseliny fosforečné na hodnotu 3. Pro přípravu vodných mobilních fází bude použita demineralizovaná voda, která bude sterilizována přes nylonový filtr o velikosti pórů 0,22 μm. (Pozn.: methanol a voda budou již připraveny) 4.3 Syntéza K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] Chemikálie potřebné pro přípravu K[Pt(NH 3 )Cl 3 ]: K 2 PtCl 4, KCl, K 2 CO 3, NH 4 Cl Molární poměr reaktantů (v pořadí dle předchozího bodu): 1 : 2,5 : 0,7 : 8 Navážka platinového prekurzoru: 0,1 g Do 10 ml varné baňky odvážíme výchozí K 2 PtCl 4, ke kterému následně přidáme 860 μl demineralizované vody a necháme úplně rozpustit. Do tří samostatných mikrozkumavek navážíme vypočtené množství KCl, K 2 CO 3 a NH 4 Cl; tyto soli poté rozpustíme v demineralizované vodě (KCl 700 μl, K 2 CO 3 400 μl a NH 4 Cl 400 μl). Do temperované baňky (teplota 45 C) s platinovým prekurzorem jsou přidány roztoky KCl, K 2 CO 3 a NH 4 Cl a necháme reagovat po dobu 3 h za nepřítomnosti světla. 4.4 Monitorování průběhu reakce pomocí HPLC-UV Kinetický průběh syntézy produktu je monitorován pomocí HPLC-UV, kde je sledován úbytek výchozí látky a nárůst produktu. Reakční směs je odebírána v následujících časových intervalech: 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 a 180 minut. Odebírané množství reakční směsi: 50 μl. Příprava vzorku pro HPLC/UV analýzu: 50 μl reakční směsi je odpipetováno do 450 μl demineralizované vody ve viálce Z takto naměřených dat bude následně pomocí programu MS Excel (popř. jiného tabulkového editoru) sestaven kinetický profil reakce (osa x = čas, osa y = koncentrace). 4.5 Kalibrační křivka K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] Ze standardu K[Pt(NH 3 )Cl 3 ] (čistota 99 %) se do 5 ml mikrozkumavky odváží 25 mg, které se rozpustí v 5 ml demineralizované vody. Z připraveného zásobního roztoku budou následně připraveny další 4 nižší koncentrace (4 mg ml -1, 3 mg ml -1, 2 mg ml -1 a 1 mg ml -1 ), tak aby byly získáno 5 bodů do kalibrační křivky (nejvyšší koncentrace odpovídá koncentraci zásobního roztoku). Po vynesení bodů do grafu area(k[pt(nh 3 )Cl 3 ]) = f(c(mg.ml -1 )) je pomocí lineární regrese sestrojena kalibrační křivka komplexu. 4.6 Separace produktu Separaci surového produktu provádíme ve dvou krocích: 1) pomocí reverzní filtrace, kdy dochází k odstranění částečně nerozpustného vedlejšího produktu cis-pt(nh 3 ) 2 Cl 2 a 2) pomocí sloupcové chromatografie na iontoměničové stacionární fázi, kde dochází k oddělené eluci K[Pt(NH 3 )Cl 3 od nežádoucích platnatých komplexů a solí (NH 4 Cl, KCl). 4.6.1 Sloupcová chromatografie Stacionární fáze: Dowex 2x8 v Cl - Mobilní fáze: 3% HCl (100 ml), 4 M HCl (300 ml) 4
Obr. 1: Kolona pro sloupcovou chromatografie Pro separaci surového produktu bude použita sloupcová chromatografie se stacionární fází Dowex 2x8 v Cl - cyklu. Jako mobilní fáze, bude použita 3% kyselina chlorovodíková (pro vymytí solí a zbytků cisplatiny) a 4 M kyselina chlorovodíková pro vymytí finálního surového produktu. Před samotnou separací je nejprve nutno naplnit kolonu stacionární fází. Do prázdné kolony se na dno pomocí špejle umístí vata, která se překryje sloupcem mořského písku výšky cca 1 cm. Následně se do kolony umístí stacionární fáze Dowex 2x8 do výšky cca 6 cm. Tato vrstva se opět překryje cca 0,5 cm vrstvou mořského písku. Takto připravená kolona je schopná separace (viz Obr. 1). Před samotnou separací se na kolonu přivede jako mobilní fáze cca 100 ml demineralizované vody. Po průchodu většiny vody kolonou opatrně vneseme reakční směs na kolonu. Poté postupně přivádíme na kolonu 3% HCl (100 ml) pro vymytí nečistot z kolony; tuto frakci jímáme do odpadní Erlenmeyerovy baňky (250 ml). Poté co takto eluujou z kolony nežádoucí látky použijeme jako mobilní fázi 4 M HCl (300 ml). Po průchodu cca 50-75 ml 4 M HCl kolonou začneme jímat frakci s produktem do druhé Erlenmeyerovy baňky (250 ml). Takto najímáme cca 250 ml. (Pozn.: Při separaci na koloně nesmí kolona vyschnout!!!) 4.6.2 Iontová výměna, odpaření a rekrystalizace Produkt eluovaný z kolony je chemicky H[Pt(NH 3 )Cl 3 ]; pro získání finálního produktu je tedy nutné jej převést na draselnou sůl. To je provedeno tak, že z najímaného produktu je odebrán cca 1 ml vzorku, který je zneutralizován a změřen na HPLC-UV. Pomocí již naměřené kalibrační křivky a přepočtu množství se vypočte obsah produktu v celé frakci a následně ekvimolární množství KCl. Vypočtené ekvimolární množství navážíme a rozpustíme v roztoku H[Pt(NH 3 )Cl 3 ]. Po rozpuštění veškerého chloridu draselného odpaříme vodu pomocí rotační vakuové odparky (teplota lázně 60 C, mezní tlak cca 30 mbar). Jelikož směs obsahuje kyselinu chlorovodíkovou, je nutné do předlohy umístit Ca(OH) 2 pro záchyt par chlorovodíku. Po odpaření maximálního množství rozpouštědla se k produktu přidá cca 10 ml propan-2-olu a směs se následně reverzně zfiltruje. Finální produkt se vysuší na vakuové odparce při 55 C, 30 mbar. Výsledný produkt je sytě oranžový prášek. Roztok finálního produktu následně zanalyzujeme pomocí HPLC-UV. 5 Výstup práce Výstupem laboratorního cvičení je protokol, který obsahuje stručný úvod, postup práce (experimentální část), získaná data, včetně kalibrační křivky K[Pt(NH 3 ) 3 Cl 3 ], změřeného kinetického profilu reakce, výtěžku a čistoty produktu a stručného závěru. 5
Poznámka: Studenti účastnící se laboratorního cvičení by měli do laboratoře přijít připraveni a měli by mít minimálně základní znalosti chemické kinetiky a termodynamiky v rámci přednášek Fyzikální chemie 1 a 2. Studenti by rovněž měli být seznámeni s analytickou metodou založenou na HPLC. Součástí laboratorního cvičení může být i vstupní test, který bude obsahovat 10 otázek vztahujících se k dané tématice. 6