Gel-based a Gel-free kvantifikace v proteomice Juraj Lenčo Ústav molekulární patologie Fakulta vojenského zdravotnictví U Hradec Králové
Funkce proteinů Proteomika Lokalizace proteinů Proteinové interakce Posttranslační modifikace ílem je získat komplexní a integrované znalosti o biologických dějích pomocí analýzy velké skupiny proteinů (než analýzou individuálních proteinů) Kvantitativní (komparativní) proteomika Kvalitativní a kvantitativní porovnání proteomů vzniklých za různých podmínek Proteom Časem a místem vyhrazený soubor proteinů kódovaný příslušným genomem Graves PR et al. Microbiol Mol Biol Rev. 2002 Mar;66(1):39-63.
Metody kvantitativní proteomiky Gel-based Gel-free 100 ( ) ( ) 629.3121 167 532.2837 645.3723 86.0960 0% 175.1199 216.1022 291.2163 390.2183 461.2516 533.2914 758.4517 759.4523 886.5014 1117.5543 1118.5776 1231.6841 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 Zhang X et al. J Biomol Tech. 2004 Sep;15(3):167-75; http://www.smalltimes.com/articles/article_display.cfm?artile_id=267580&p=109; http://www.rabies.net/cont_22.production.php?phpsessid=30ee4338c57532614e8c0b84b35cb0b6 http://www.beckmancoulter.com/products/images/analytical/protein/pf2d_visresult_lg.gif m/z
2D-PAGE 1975 Separační metoda pro dělení proteinů pi isoelektrická fokusace MW SDS slektroforéza SDS Klose J. Humangenetik. 1975;26(3):231-43.; 'Farrell PH. J Biol hem. 1975 May 25;250(10):4007-21.; Bjellqvist B et al. J Biochem Biophys Methods. 1982 Sep;6(4):317-39; http://www.sigmaaldrich.com/area_of_interest/life_science/proteomics_and_protein_expr_/protein_analysis/protein_electrophoresis/isoelectric_focusing.html
2D-PAGE 1975 Separační metoda pro dělení proteinů pi isoelektrická fokusace MW SDS slektroforéza 1982 Ukotvené ph gradienty SDS Klose J. Humangenetik. 1975;26(3):231-43.; 'Farrell PH. J Biol hem. 1975 May 25;250(10):4007-21.; Bjellqvist B et al. J Biochem Biophys Methods. 1982 Sep;6(4):317-39; http://www.sigmaaldrich.com/area_of_interest/life_science/proteomics_and_protein_expr_/protein_analysis/protein_electrophoresis/isoelectric_focusing.html
2D-PAGE Barvení proteinů v gelu itlivost Linearita odezvy Kompatibilita s MS ena
2D-PAGE
2D-PAGE 1997 Difference gel electrophoresis Kovalentní značení proteinů y 2, y 3 a y 5 Excitační spektra Emisní spektra http://www.liv.ac.uk/biosciences/research/core_facilities/proteomics/proteomics.html Unlu M. Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis. 1997 ct;18(11):2071-7. http://www.biorad.com/cmc_upload/literature/55828/bulletin_3009.pdf http://biomedical.ucsc.edu/lokey.html
Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today. 2005 May 15;10(10):719-25 www.expasy.ch http://www1.dionex.com/en-us/lp35613.html http://www.waters.com/watersdivision/ontentd.asp?watersit=pstd-5zbauy https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/us/adirect/ab?cmd=catavigate2&catid=600857 http://www1.dionex.com/en-us/ic/systems/capillary_nano_lc/fraction_collector/ins3412.html
Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů ástřik vzorku L, MudPIT Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today. 2005 May 15;10(10):719-25 www.expasy.ch http://www1.dionex.com/en-us/lp35613.html http://www.waters.com/watersdivision/ontentd.asp?watersit=pstd-5zbauy https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/us/adirect/ab?cmd=catavigate2&catid=600857 http://www1.dionex.com/en-us/ic/systems/capillary_nano_lc/fraction_collector/ins3412.html
Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů ástřik vzorku L, MudPIT ESI, MALDI MS/MS 100 ( ) ( ) 629.3121 532.2837 645.3723 86.0960 0% 175.1199 216.1022 Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today. 2005 May 15;10(10):719-25 www.expasy.ch http://www1.dionex.com/en-us/lp35613.html http://www.waters.com/watersdivision/ontentd.asp?watersit=pstd-5zbauy https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/us/adirect/ab?cmd=catavigate2&catid=600857 http://www1.dionex.com/en-us/ic/systems/capillary_nano_lc/fraction_collector/ins3412.html 291.2163 390.2183 461.2516 533.2914 758.4517 759.4523 886.5014 1117.5543 1118.5776 1231.6841 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
Shotgun proteomika vzorek Extrakce proteinů Proteolytické štěpení Směs proteinů Komplexní směs peptidů ástřik vzorku L, MudPIT AIAEASDYDR MLDGVTLAAVK ESI, MALDI MS/MS Analýza dat Identifikované proteiny groel [Francisella tularensis] Swanson SK. The continuing evolution of shotgun proteomics. Drug Discov Today. 2005 May 15;10(10):719-25 www.expasy.ch http://www1.dionex.com/en-us/lp35613.html http://www.waters.com/watersdivision/ontentd.asp?watersit=pstd-5zbauy https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/us/adirect/ab?cmd=catavigate2&catid=600857 http://www1.dionex.com/en-us/ic/systems/capillary_nano_lc/fraction_collector/ins3412.html
Kvantitativní metody shotgun proteomiky A) Bez značení (Label-free) utné softwarové vyrovnání t r http://www.thermo.com/ethermo/ma/pdfs/articles/articlesfile_26920.pdf
Kvantitativní metody shotgun proteomiky B) Značení proteinů/peptidů stabilními izotopy 12 / 13, 14 / 15, 16 / 18, 1 H/ 2 D Stejné h-f vlastnosti shodná separace ( 1 H/ 2 D!) Různé M r odlišení v MS
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 1) Metody pro isotopové in vivo značení Stav A Lehká AK Stav B Těžká AK Stav Střední AK? da Y et al. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc atl Acad Sci U S A. 1999 Jun 8;96(12):6591-6. ng SE et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILA, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol ell Proteomics. 2002 May;1(5):376-86. Blagoev B et al. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. at Biotechnol. 2004 Sep;22(9):1139-45.
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 1) Metody pro isotopové in vivo značení SILA- Stable Isotope Labeling by AA in ell ulture [ 1 H 3 ]-Leu x [ 2 D 3 ]-Leu [ 12 6 ]-Lys x [ 13 6 ]-Lys [ 12 6, 14 4 ]-Arg x [ 13 6, 14 4 ]-Arg x [ 13 6, 15 4 ]-Arg da Y et al. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc atl Acad Sci U S A. 1999 Jun 8;96(12):6591-6. ng SE et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILA, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol ell Proteomics. 2002 May;1(5):376-86. Blagoev B et al. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. at Biotechnol. 2004 Sep;22(9):1139-45.
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami Lehká značka Těžká značka da Y et al. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc atl Acad Sci U S A. 1999 Jun 8;96(12):6591-6. ng SE et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILA, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol ell Proteomics. 2002 May;1(5):376-86. Blagoev B et al. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. at Biotechnol. 2004 Sep;22(9):1139-45.
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami Značení pomocí 16 / 18 během štěpení ve H 2 16 a H 2 18 H 2 R1 R2 R3 R4 H trypsin H 2 16 H 2 R1 16 R2 16 H + H 2 R3 R4 H H 2 R1 R2 R3 R4 H trypsin H 2 18 H 2 R1 18 R2 18 H + H 2 R3 R4 H Schnolzer M et al.protease-catalyzed incorporation of 18 into peptide fragments and its application for protein sequencing by electrospray and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Electrophoresis. 1996 May;17(5):945-53. Mirgorodskaya A et al. Quantitation of peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using (18)-labeled internal standards. Rapid ommun Mass Spectrom. 2000;14(14):1226-32. Heller M et al. Trypsin catalyzed 16-to-18 exchange for comparative proteomics: tandem mass spectrometry comparison using MALDI-TF, ESI-QTF, and ESI-ion trap mass spectrometers. J Am Soc Mass Spectrom. 2003 Jul;14(7):704-18.
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami IAT, ciat Isotope oded Affinity Tags Biotin 8X 1 H/ 2 D -SH reaktivní skupina IAT avidin Lehký IAT Těžký IAT Biotin Štěpné místo 9X 12 / 13 -SH reaktivní skupina ciat Gygi SP et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. at Biotechnol. 1999 ct;17(10):994-9. Yi E et al. Increased quantitative proteome coverage with (13)/(12)-based, acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagent and modified data acquisition scheme. Proteomics. 2005 Feb;5(2):380-7.
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami GIST Global Internal Standard Technology IPL Isotope oded Protein Labaling X 3 GIST H H 12 12 12 12 H 12 12 H D D 12 12 12 12 D 12 12 D H H 13 13 13 13 H 13 13 H IPL hakraborty A et al. Global internal standard technology for comparative proteomics. J hromatogr A. 2002 Mar 8;949(1-2):173-84. Schmidt A et al. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. Proteomics. 2005 Jan;5(1):4-15. http://www.bdal.com/data/literature/abrf06_icpl.pdf
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami itraq - Isobaric Tags for Rel. and Abs. Quantification Vyrovnávací skupina 31-28 H 3 H 2 - reaktivní skupina Reportérová skupina 114-117 4 isobarické značky: celkové M r vždy = 145 Ross PL et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol ell Proteomics. 2004 Dec;3(12):1154-69.
Kvantitativní metody shotgun proteomiky 2) Kovalentní značení isotopovými značkami itraq - Isobaric Tags for Rel. and Abs. Quantification 114 H 3 Peptid 1 116.12 115 H 3 116 H 3 Peptid 2 Peptid 3 MS MSMS 114.12 115.11 117.12 117 Peptid 4 H 3 Ross PL et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol ell Proteomics. 2004 Dec;3(12):1154-69.
Kvantitativní metody shotgun proteomiky SILA 16 / 18 IAT/cIAT GIST IPL itraq Úroveň značení Protein Peptid Protein Protein/ peptid Protein/ peptid Protein/ peptid Doba značení Metabolické značení Během štěpení proteinů Před štěpením proteinů Před/po štěpení proteinů Před/po štěpení proteinů Před/po štěpení proteinů Místo značení Arg, Lys -konec peptidů ys H 2 - H 2 - H 2 - Snížení komplexity e e Ano e e e Počet značek 3 2 2 2 3 4/8 Kvantifikace MS MS MS MS MS MSMS Putz S et al. Mass spectrometry-based peptide quantification: applications and limitations. Expert Rev Proteomics. 2005 Jun;2(3):381-92.