Laboratoř experimentální medicíny (LEM)

Laboratoř experimentální medicíny (LEM) Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D. Mgr. Marta Dziechciarková, Ph.D. MUDr. Petr Džubák MUDr. Josef Srovnal RNDr. Radek Trojanec, Ph.D. MUDr. David Vydra

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Muž? Žena?

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Význam i v onkologii: RFC gen (Reduced Folate Carrier Gene)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Metodou fluorescenční in situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in situ). Metoda FISH je založena na schopnosti jednořetězcové DNA sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle.

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY CEP 17 Her-2/neu Jádro s normálním počtem kopií genu a chromozomu Nepravá amplifikace Amplifikace

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE t(9;22)(q34;q11) Philadelphia (Ph) chromozom (Nowell, Hungerford,1962) BCR-ABL CML, ALL, AML, ST STI-571 (Glivec) t(15;17)(q22;q11-21) PML-RARA AML M3 (PML) ATRA

C omparative G enomic Hybridisation (Kallioniemi, 1992)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Mnohobarevná FISH

Microarrays analyza tisice genu soucasne

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Molekularni diagnostika v onkologii Detekce molekularnich markeru Geny, jejichz proteinove produkty se podileji na maligni transformaci bunky Geny s prognostickym vyznamem Geny s diagnostickym vyznamem Naroky na molekularne-biolgicke metody Citlivost Specifita Rychlost

Některé další geny, účastnící se maligní transformace buňky, jejichž význam pro cílenou léčbu je nejasný či není zcela potvrzen Protoonkogeny rodiny MYC (c-myc, n-myc, l-myc aj.) Geny účastnící se regulace buněčného cyklu a n apotózy (geny pro CDK, CDK-I, cykliny) Tumor-supresorové geny (TP53, RB1) Protoonkogeny rodiny RAS BCL-2 a příbuzné protoonkogeny TOP2A, RARA a jiné

LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY Her-2/neu (c-erbb-2) Receptor EGF Nejčastěji amplifikovaný onkogen u ca prsu (10-34%) Protein p185 HER-2 souvisí s maligní transformací a agresivitou choroby Pacientky s overexpresí proteinu a/nebo amplifikací genu indikovány k terapii monoklonální protilátkou trastuzumab (Herceptin) Různé metody vyšetření

Vyšetření Her-2/neu (c-erbb-2): IHC x FISH IHC:0 FISH: normální Her-2/neu CEP 17 IHC: 1+ až 2+ FISH: normální nepravá amp. amplifikace IHC: 3+ FISH: amplifikace IHC fotografie byly získány ve spolupráci s Ústavem patologie LF UP

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE

CEP 17 LSI Her-2/neu

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Her-/neu (c-erbb-2): amplifikované případy: senzitivita na antracykliny aplikace Herceptinu TOP2A: Topoizomeráza II α = cíl pro některé typy cytostatik: inhibitory topoizomeráz II tj. senzitivita na antracykliny RARA: Citlivost k léčbě retinoidy?

MTT test: (Mihál et al, Klin Onkol 2000;2:39-42)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE PROCENTO PŘEŽÍVAJÍCÍCH BUNĚK V ZÁVISLOSTI NA KONCENTRACI CYTOSTATIKA % 0 50 100 C max C min Koncentrace cytostatika (v přísl. jednotce) Podíl žívých buněk (v %)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Exprese MDR proteinů u karcinomu plic. MRP-1 p53 TopoIIα Pgp

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Mnohočetná léková rezistence (MDR) P- glykoprotein (Pgp, P170) Multidrug resistance related protein (MRP 1-7) Breast cancer resistance protein (BCRP, MXR, ABCP) Lung resistance related protein (LRP, MVP) Glutathion (GSH) a glutathion-s-transferáza π (GST-π) DNA topoizomerázy transport přes cytoplazmatickou membránu ABC transportní proteiny nukleocytoplazmatický transport detoxifikační systém buňky replikace DNA

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Látky transportované proteiny MDR Pgp Antracykliny, Vinca alkaloidy, deriváty Camptotecinu, epipodofylotoxiny, taxany, chromopeptidové antibiotika, HIV-1 proteázové inhibitory, flurofory kortikoidy (Dexametazon) MRP Organické anionty, glutathionové konjugáty, leukotrien LTC4, antagonisté leukotrienových receptorů LTsR, deriváty Pt, glukuronidy. BCRP Mitoxantron, topotecan, flavopyridol, prazosin a řada dalších hydrofobních a amfifilních látek. LRP Antracykliny, Vinka alkaloidy, VP-16, deriváty platiny.

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE VÝSKYT MNOHOČETNÉ LÉKOVÉ REZISTENCE U NĚKTERÝCH CYTOSTATIK MDR častá MDR vzácná aktinomycin D bleomycin doxorubicin cisplatina daunorubicin cyklofosfamid vepesid cytosin arabinosid mitoxantron 5-fluorouracil taxol ifosfamid vinkristin metotrexát topotekan

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Používané inhibitory MDR Pgp Verapamil 6-10 μm, Nifedipin 35μM, CyA 0.8-2μM, PSC 833 0.1μM MRP CyA 0.8-2μM Probenecid 2mM, BCRP Fumitremorgin C 1μM

Metody používané k hodnocení exprese a funkce MDR. Exprese: Western blott, Imunoprecipitace Imunohistochemie Flow cytometrie Funkce: flow cytometrické stanovení akumulace, či efluxu fluorescenčních substrátů ( DNR, Rhodamin123) za použití specifických či nespecifických inhibitorů (CyA, PSC833). scintigrafie - in vivo hodnocení akumulace 99m Tc-MIBI v nádorové tkáni cytotoxické testy -MTT

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Exprese Pgp - přímá imunofluorescence (FACS)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Funkční aktivita Pgp Hodnocen eflux DNR(1μM) 1. Prekultivace v čistém médiu s a bez inhibitorů 1 hodinu. 2. Přidání DNR, kultivace 1 hod. 3. Odmytí a kultivace v čistém médiu s a bez inhibitorů 2hod. CyA(1μM), Probenecid(2mM).

Hodnocení BC pomocí průtokové cytometrie.

Vztah procenta S fáze k prognóze nádorů. Vyšší % S fáze znamená prognózu Horší Druh nádoru Kolorektální karcinom, karcinom močového měchýře, astrocytomy vyššího stupně, velkobuněčný non- Hodgkinský lymfom, karcinomy děložního čípku, germinální nádory varlat, non-hodgkinské lymfomy, myelodysplastický syndrom. Lepší nefroblastom

Hodnocení ploidity pomocí průtokové cytometrie. Hodnotíme změnu vůči normální diploidní populaci. Pro hodnocení používáme DNA index (DI). Haploidní DI = 0,5 Hypoploidní DI < 1 Diploidní (Euploidní) DI = 1 Hyperploidní DI > 1 Tetraploidní DI = 2 (1,85 2,1) Aneuploidní DI jiný než 0,5, 1 a2 Multiploidní - více populací s různým DI.

Vztah DNA-ploidie k prognóze nádorů. Aneuploidie znamená prognózu Horší Lepší Druh nádoru Karcinom močového měchýře, karcinom ledviny, karcinom žaludku, karcinom prsu, kolorektální karcinom, karcinom jícnu, maligní melanom, ovariální karcinomy, nazofaryngeální karcinom, karcinom žaludku, mnohočetný myelom, gliální nádory CNS, germinální nádory varlat i extragonadální, nemalobuněčný karcinom plic, adrenokoritíkální karcinom, endometriální karcinom, karcinom děložního čípku, karcinom prostaty, karcinom uretry, mycosis fungoides, sarkomy měkkých tkání u dospělých, papilární a medulární karcinom štítné žlázy, maligní ependymom, myelodysplastický syndrom, non-hodgkinské lymfomy, condrosarkom, thymom, leiomyosarkom dělohy Neuroblastom, meduloblastom, akutní lymfoblastická leukemie pre B typu dětského věku, karcinom dutiny ústní, hydatiformní mola.

Hmotnostní spektrometrie: Jak vypadá hmotnostní hmotnostní spektrometr? Analytický instrument, který přeměňuje složky vzorku na ionty v plynné fázi a měří jejich hmotnost. Vstup: vstup vzorků (tělní tekutiny, kondenzát, extrahovaná tkáň) do systému a to jako pevná fáze, kapalina nebo plyn Zdroj: přeměna složek vzorku na ionty - bombardování fotony, elektrony, ionty, atomy... Analyzátor: separace iontů dle m/z - el. pole, mag. pole, čas na dráze. Detektor: detekce separovaných iontů fotonásobič, supercitlivý magnet. Data processor: příjem a zpracování dat - obrovské množství dat. Vakuum: eliminace okolních atomů - výkonné vakuové pumpy.

U nás v laboratoři MALDI-TOF MS/MS

Co je to MALDI? Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - typ zdroje. Metoda umožňující odpaření a ionizaci (měkkou) netěkavých biologických vzorků z pevné fáze přímo do plynné. Vzorek je smíchán s tzv. matricí (~1000 molární přebytek) a ozářen pulsním laserem (UV nebo IR) - odpaření a ionizace. Vhodné pro peptidy, proteiny, DNA, polysacharidy i některé synth. polymery. 2002 - Nobelova cena.

Time-Of-Flight - typ analyzátoru. Co je to TOF? Ionty jsou ze zdroje urychleny vysokým napětím do letové trubice bez el. pole. Separace dle doby letu k detektoru - závislá na m/z. Ep = Ekin = U z = mv2... m/z ~ t2 Nutná kalibrace na známé hmotnosti.

K čemu to celé je? Hmotnostní spektrometr umí pouze měřit molekulové hmotnosti na nás je, jak toho využijem. Stanovení MW Identifikace proteinů - "protein mass fingerprint". Identifikace posttranslačních modifikací. Identifikace "single nucleotide polymorfism". Ověřování sekvence peptidů. Ověřování čistoty vzorků.

Určení MW MALDI

Luminex xmap technologie http://www.luminexcorp.com

Luminex xmap technologie http://www.luminexcorp.com

Luminex xmap technologie http://www.luminexcorp.com

LUMINEX vs. ELISA Multiplexní kvantifikace až 100 různých analytů v jednom vzorku. Flexibilní je možné jednoduše rozšířit stávající vyšetření o další analyty. Je požadován pouze malý objem vzorku. (25 μl) Je rychlejší. Jsou kratší inkubační časy, někdy není třeba použít promývání. Srovnatelná sensitivita. Může detekovat cytokiny až k ~1 pg/ml.

Screening: LUMINEX analyty Panel I Cytokiny: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-15, IL-17, IL- 18, TNFα, TNFR I, TNFR II, IFNγ, GM-CSF, G-CSF, Chemokiny: RANTES, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, Eotaxin, MIG Růstové a angiogení faktory: EGF, EGFR, VEGF, bfgf, HGF, VEGF, NGF Panel II Nádorové antigeny: CA 125, CA 15-3, CEA, AFP, CA 19-9 Apoptotické proteiny: sfas and sfasl Růstové faktory, onkogeny: EGFR, Her2/neu Proteázy: PSA free, kallikrein 8, MMP-2,3,7,9, TIMP-1, TIMP-2, Další markery: Cyfra 21-1, TPA, M-CSF, HMGB-1, S-100, LDH, CRP Panel III Cirkulující protilátky: Cytokiny: IL-6, IL-8; Růstové faktory, receptory: EGF, EGFR, VEGF, Her2/neu, PDGF, PDGFR; Nádorové antigeny: CA 125, 15-3, 19-9, 72-4, CEA,MUC-1, PSA; Diferenciační molekuly: AFP, bhcg; Apoptotické moleculy: survivin, Fas, FasL; transglutamináza; Onkogeny: c-myc, N-Ras, K-Ras, Akt1, p53; Molekuly zasahující do budněčného cyklu: cyklin B, cyklin D

Luminex xmap sérové koncentrace cytokinů u pacientů s časným stádiem karcinomu ovária a zdravých kontrol. IL-6, pg/ml 300 200 100 64.2±12.57 (0-280)*** 9.1±2.51 (0-64.1) IL-8, pg/ml 24.0±5.91 (2.0-180.6)* 80 70 10.6±1.67 (2.3-51.4) 60 50 40 30 20 10 IL-12p40, pg/ml 209.8±16.90 (52.3-500.0) 500 170.0±13.22 (20.0-400.0) 250 G-CSF, pg/ml 49.2±11.90 (0-290.8)* 300 17.9±7.86 (0-257.6) 200 100 0 Control OvCA 0 Control OvCA 0 Control OvCA 0 Control OvCA MCP-1, pg/ml 700 600 500 400 300 200 100 348.4±20.88 (135.5-695.7) 210.3±20.30 (17.1-502.3) *** VEGF, pg/ml 700 600 500 400 300 200 100 189.4±21.05 (45.0-620.1) 230.9±20.18 (23.4-560.0) EGF, pg/ml 450 400 350 300 250 200 150 100 50 223.7±11.46 (29.0-402.6) 110.6±15.4 (0-396.9) *** CA 125, IU/ml 114.4±22.67 (0-592.0)*** 600 500 400 300 200 9.7±2.31 (0-87.0) 100 0 Control OvCA 0 Control OvCA 0 Control OvCA 0 Control OvCA

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE LASEROVÁ MIKRODISEKCE (LCM) LCM je metoda která umožňuje isolaci buněk z komplexu tkáně. Přístroj VERITAS pro LCM od firmy ARCTURUS.

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE PRINCIP LASEROVÉ MIKRODISEKCE inverzní mikroskop se zabudovaným nízko výkonnostním infračerveným laserem a UV laserem nad dehydratovaný preparát je umístěno víčko s termoplastickou membránou vyřezávání buněk pomocí laseru vyřezané buňky jsou uchyceny na víčko

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Cytologický preparát adenokarcinomu plic TECHNIKA LASEROVÉ MIKRODISEKCE Parafinový/kryořez nádorové tkáně Cytospin, buněčná linie K562

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE LINEÁRN RNÍ AMPLIFIKACE DNA PK-trávení MseI štěpení Annealing a ligace adaptérů PCR - amplifikace

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Výsledek CGH po LCM idiogramy K 562 směsná populace K 562-1 buňka po LCM Cytogenetický nález: REV ISH ENH (3q29qter; 5p12-13.3; 5p15.2pter; 6p25.1pter; 12p11.1pter; 16p11.2-12; 18q21.3qter) REV ISH DIM (9q34.1qter; 12q21.1-21.3; 13q11.1qter; 16q12.1-13; 17p11.1-11.2; 18q11.2-12.1; 19p13.3pter) Cytogenetický nález: REV ISH ENH (1p36.2pter; 3q26.3qter; 4p11.1pter; 4q35qter; 6p11.1-12.1; 9q13-21; 12p11pter; 15q11.2-24.1; 16p11.2.-12; 17p12.1pter; 17q22qter; 18q22qter) REV ISH DIM (5q11.2-15; 5q34.0-35.1; 7q11.2-21.1; 9p12-21; 9q21.3qter; 10q22.1-22.3; 10q26.1qter; 12q21.1-21.3; 13q11.1qter; 16q12.1.-22; 19p13.3pter)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE VYUŽIT ITÍ LCM A LINEÁRN RNÍ AMPLIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN PRO ÚČELY GENETICKÝCH A CYTOGENETICKÝCH ANALÝZ Zvýšení detekčního limitu genetických, cytogenetických a expresních změn v nádorech a tkáních s minimálním zastoupením cílových buněk (< 50%) Genetická a cytogenetická diagnostika z minimálního množství biologického materiálu. Studium heterogenity nádorové populace na jednobuněčné úrovni Studium expresních profilů a genetických charakteristik v různých buněčných populacích (např. stromální versus nádorové buňky) Materiál po LCM je technicky použitelný pro studium pomocí prakticky všech PCR technik, mikroarray technologií, sekvenování DNA i pro proteomické studie založené na principu hmotnostní spektrometrie.

Metoda PCR denaturace a následný anealing primerů syntéza nové řetězce denaturace a následný anealing primerů syntéza nové řetězce denaturace a následný anealing primerů syntéza nové řetězce dvoušřoubovice DNA denaturace a následný anealing primerů syntéza nové řetězce

Rozdělení DNA a vizualizace na agarózovém gelu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sekvenace DNA A T C C A C G G C T G A T C C A C G G C T G

Množení DNA pomocí baktérií

Příklad praktického výstupu analýzy DNA - detekce bodových mutací v sekvenci

Příklad praktického výstupu analýzy DNA - delece části genu produkt částečně deletovaného genu produkt odpovídající nedeletovanému genu

Detekce minimáln lní reziduáln lní choroby Detekujeme přítomnost p izolovaných nádorových n buněk k v krvi, kostní dřeni a lymfatickém m systému možné prekurzory mikrometastáz Metoda spadá na základz kladě citlivosti do oblasti ultrastagingu; běžné zobrazovací metody sloužící v oblasti onkologie spadají do oblasti stagingu Detekce MRD (minimal( residual disease) - detekce znaků epiteliáln lních buněk k v kompartmentech mesenchymáln lního původu Imunohistochemie citlivost 1:10 000 Průtokov toková cytometrie citlivost 1: 100 000 PCR citlivost 1: 1 000 000 V naší laboratoři i zavedená metoda Real time RT-PCR PCR citlivost aža 1: 10 000 000 (reverse transcriptase-polymerase polymerase chain reaction)

Princip detekce mimimáln lní reziduáln lní choroby metodou RT-PCR studium genové exprese DNA hledaný mrna znak Epiteliální (nádorová) buňka mrna cdna DNA amplikon Izolace RNA mo možná jen ze živých buněk Reverzní transkripce s náhodnými (random) primery PCR reakce se specifickými primery Mezenchymální (nenádorová) buňka detekce amplikonu na gelu Real time RT-PCR, detekce fluorescenčně označeného amplikonu v reálném čase v průběhu PCR reakce, fluorescenční značení je buď nespecifické (DNA interkalátory) nebo specifické (sondy), díky standardům je detekce kvantitativní

Příklad real-time RT-PCR záznamu

Využit ití detekce minimáln lní reziduáln lní choroby v klinické onkologii Detekce MRD a rozhodnutí o adjuvantní léčbě Monitoring MRD v čase relaps vs. remise Včasný záchyt z recidivy Hodnocení léčebné odpovědi di Diferenciáln lní diagnostika Autologní transplantace při p i HD chemoterapii

Markery zavedené v naší laboratoři i pro detekci minimáln lní reziduáln lní choroby 1. Mamaglobin 1 MGB1 - patří do rodiny uteroglobinů - malých epiteliáln lních sekrečních proteinů; ; známe 6 lidských mamaglobinů - vysoce specifický pro prsní tkáň,, v prsní nádorové tkáni aža 10-ti násobná overexprese - není exprimován v buňkách mezenchymáln lního původu 2. Karcinoembryonáln lní antigen - CEA - glykoprotein patřící do velké rodiny CEA, blízk zké imunoglobulinům - gen je zvýšen eně exprimován u karcinomů trávic vicí trubice a fetáln lních tkání - nízká exprese i v leukocytech zdravých dárcd rců 3. Glyceraldehydfosfátdehydrogen tdehydrogenáza GAPDH - kontrolní gen - kontrola kvality zpracovaných vzorků (degradace RNA, úspěšnost transkripce) Další možné dosud nezavedené markery-egfr, cytokeratiny, EpCAM, mucin, tyrozináza za

Detekce minimální reziduální choroby u pacientů s kolorektálním karcinomem hledaný znak CEA V den operace - detekce karcinoembryonálního antigenu (CEA) v nádorové tkáni, popř. v metastáze, v systémové a portální krvi před i po operaci. Následné odběry kostní dřeně a systémové krve v čase 1 měsíc po operaci a u vytipovaných pacientů i v dalších časových intervalech Stanovená Cut-off hodnota na základz kladě vyšet etření 58 zdravých dárcd rců 250 kopií CEA / µg g RNA K záříz 2005 vyšet etřeno eno cca 250 pacientů Pro dosažen ení větší specifity a senzitivity je nutné zavádění další ších znaků- vytvořen ení multipanelu Příklady vyšetření MRD u pacientů s různým rozsahem onemocnění Počet kopií CEA v jednotlivých vzorcích na množství 1µg RNA LU Staging Pacient Tumor Meta PK před PK po SK před SK po SK II.od. KD KD II.od. pozit. v % TNM Dukes Stad. MRD 69 98 280 320 ND 332 25 478 618 155 583 420 0pT1N0MX A 0 MRD 70 5 655 150 ND 355 55 260 20 360 5 220 10 100 pt4n3mx D 4 MRD 72 9 220 ND 170 77 140 100 40 50 165 260 0pT3N0 B 2 MRD 74 64 459 440 ND 970 292 82 60 ND 150 ND 40 pt3n1m1 D 4 MRD 94 195 213 570 ND 205 0 430 125 5 265 15 10 pt3n1 C1 3 MRD 97 206 063 270 ND 380 ND 520 280 30 400 5 17 pt2n1 C1 2 MRD 106 108 918 050 ND 0 260 90 150 223 340 1 022 0pT2N0MX A 1 MRD 34 166 363 370 57 178 380 183 979 2 782 0 30 430 410 ND 100 pt3n1m1 D 4

MRD u karcinomu prsu sentinelová uzlina Sentinelová strážní uzlina drénující nádor přítomnost nádorového postižení sentinelové uzliny značí postižení axillárních uzlin ve více jak 95% Vyšetření sentinelové uzliny dvě skupiny pacientů rozdílná léčba Výhody real-time RT-PCR: 1. Vysoká senzitivita 2. Zpracování celého vzorku Markery mammaglobin MGB1 a karcinoembryonální antigen