1) Vznik vyšších proteinových struktur 2) Nekovalentní vazby v polypeptidovém řetězci 3) Sbalování proteinů pomocí chaperonů 4) Vlastnosti a funkce vybraných chaperonů 5) Co je to proteostáza a jaká je její funkce 6) Terapeutické chaperony 7) Proteozóm 8) Další mechanismy úpravy proteinů 9) Tvorba disulfidických můstků 10) Posttranslační modifikace proteinů 2
Je pro vytvoření funkčních molekul rozhodující Zahrnuje následující procesy Vlastní vytvoření 3D konformace Připojení kofaktorů Modifikace kinázami nebo jinými proteinmodifikujícími enzymy 3
Především nekovalentní interakce iontová vazba vodíkový můstek van der Waalsova síla 4
je pro tvorbu 3D ta nejdůležitější polární postranní řetězec nepolární postranní řetězec hydrofobní vnitřek polypeptidu obsahuje nepolární AA vodíkové můstky se tvoří mezi polárními AA nesbalený polypeptid sbalený polypeptid ve vodě 5
nascentní polypeptidový řetězec Sbalování a vazba kofaktoru (nekovalentní interakce) Glykosylace, fosforylace, acetylace (kovalentní modifikace) P P Vazba k dalším proteinovým podjednotkám maturovaný funkční protein 6
Existují ale i kovalentní modifikace ve specifických aminokyselinách Nejčastěji glykosylace nebo fosforylace Celkem bylo popsáno více než 100 typů kovalentních modifikací polypeptidových řetězců 7
Pochopení samotné struktury proteinů a procesů její tvorby je důležité pro design léčiv, protože léčiva často působí na úrovni vazebného nebo alosterického místa enzymů. 8
Databáze sekvencí proteinů Databáze SWISS-PROT založená na Univerzitě v Ženevě v roce 1986 Spravuje Švýcarský institut pro bioinformatiku (SIB) www.expasy.org Obsahuje automaticky doplňované překlady sekvencí genů z EMBL (www.ebi.ac.uk) Databáze PDB (The Protein Databank) Archivuje a analyzuje proteinové struktury a komplexy informačních biomakromolekul http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do 9
www.ncbi.nlm.nih.gov 10
www.ncbi.nlm.nih.gov/protein 11
12
1) Heslo Homo sapiens chemokine receptor 5 2) V listopadu 2012 jich bylo 5, všechny získané z krystalografických dat prostřednictvím paprsků X, žádná NMR 13
14
autonomní proces nevyžadující žádné dodatečné faktory ani přísun energie Christian Anfinsen 1972 Nobelova cena experimenty in vitro terciární struktura po opuštění ribozómu in vivo nativní konformace do okamžiku degradace 15
16
17
Rychle (sekundy) tvorba kompaktní struktury zhruba výsledné = dynamické a flexibilní nestabilní stadium skoro nativní konformace (molten globule) je výchozím strukturou pro relativně pomalý proces (minuty), při kterém dochází k řadě postranních interakcí, jež nakonec, pokud celý proces proběhne správně, vytvoří funkční terciární strukturu. 18
Sbalování jednotlivých domén začíná od N konce U některých proteinů je proces sbalování dokončen současně s tím, jak se z ribozomu uvolní C konec polypeptidového řetězce 19
postranní řetězce aminokyselin nesbalený protein SBALOVÁNÍ vazebné místo enzymu sbalený protein Alberts et al 2008: Figure 3-37a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 20
sbalování in vitro je snadné in vivo agregace - koncentrace proteinu - teplota - postranní interakce agregace je proces patologický daný nespecifickými interakcemi polypeptidových řetězců 21
fyziologicky vlastní syntézou nefyziologicky nebo přítomnost chemikálií rozbalení, denaturace Reakce buňky tvorba zvýšeného množství ochranných proteinů (heat shock response, stress response) 22
Rozpoznáním hydrofobních aminokyselin na povrchu již sbaleného proteinu Existence hydrofobních aminokyselin na povrchu proteinu je varovným signálem, že s proteinem není něco v pořádku Nesprávně strukturovaný protein nejenže nemusí být v buňce funkční, ale jeho přítomnost může i škodit 23
nově syntetizovaný protein agregované struktury správně sbalený bez pomoci správně sbalený s pomocí chaperonů nesprávně sbalený rozložený proteazómem 24
selekce proteinů na základě biologických vlastností na základě schopnosti se účinně sbalovat 25
nevhodné podmínky = proč buňky neobsahují samé agregované struktury? 1) agregované struktury jsou rychle odbourávány - proč tolik vynaložené energie? 2) strategie minimalizace vzniku agregovaných struktur 26
27
neposkytují sterickou informaci inhibují neproduktivní interakce nacházejí se ve všech kompartmentech sbalování proteinů konformační přestavby 28
vysoce afinitní chaperon U agregáty Iuc málo afinitní chaperon Ic N 29
chaperon navozuje konformační změnu ve struktuře proteinu např. kontrolované rozbalení proteinu nová příležitost pro nesbalené nebo špatně sbalené proteiny chaperon kontrolovaně uvolňuje protein přesmyknutí afinitního stavu chaperonu vysoce afinitní + substrát + ATP nízce afinitní - substrát 30
GroES, 7 domén, 75A 3 domény - ekvatoriální - apikální - střední GroEL 2x7 podjednotek průměr 45A 31
druhá strukturální změna zachycení proteinu ciskomplex transkomplex snížení afinity k substrátu strukturální změna 32
jak sbalit mis-folding proteiny? GroE je schopen je rozbalit váže se na hydrofobní povrchy neváže se na správně sbalené proteiny 33
Anfinsenova klec Doba cyklu v chaperonu je kratší než doba sbalení proteinu - část proteinů dosáhne nativní konformace - část proteinů podstoupí další cyklus v chaperonu 34
eukaryota, eubakterie, archea DnaK u E. coli Princip působení vazba na krátké hydrofobní segmenty proteinů, zabránění agregaci, zastavení sbalování spoluúčast ko-chaperonů a dalších proteinů 35
ATPázová doména N-konec vazebná doména C-konec Mg 2+ ADP heptapeptid 36
vazba substrátu na DnaJ asociace s DnaK hydrolýza ATP výměna ADP za ATP přenos substrátu 37
nebyl podán důkaz aktivního působení na konformaci proteinů nemá mikroprostředí pro sbalování pravděpodobně akceptor nesbalených a rozbalených proteinů předává je dalším systémům 38
eukaryotický chaperon v posledních fázích je jeho součástí Hsp70 spoluúčast více kofaktorů široké spektrum závislých proteinů src kináza regulace buněčného cyklu terapeutický cíl (inhibice ansymycinem, geldanamycinem) inhibuje Hsp90 a vazbou na Hsp90 se snižuje její množství v buňce 39
40
zachycení SHR steroid hormone receptor časný komplex přenos SHR na Hsp90 zralý komplex intermediární komplex kaskáda náhrad hormon 41
nalezeny téměř u všech studovaných organismů v jednom buněčném kompartmentu více rodin různé funkce, heterogenní skupina společný rys = konzervativní C-koncová doména tvořená A-krystalinem 42
Methanococcus jannaschii 12-24 podjednotek ve formě β-listů, které vytvářejí dutou kouli o vnějším průměru 120A a vnitřním průměru 65A 43
44
45
homeostáza proteinů popsána u eukaryot (eukaryotic protein homeostasis) Jedná se o soubor interakcí, které udržují optimální (zdravý) stav proteomu v organismu Proteostasu zajišťují malé regulační molekuly, které ovlivňují koncentraci, konformaci, kvartérní strukturu nebo lokalizaci proteinů v buňce W. E. Balch et al., Science 319, 916-919 (2008) 46
udržuje buňky ve zdravém stavu umožňuje vývoj organismu a jeho vyzrávání chrání proti onemocnění Poruchy proteostázy vedou k mnoha metabolickým, onkologickým, neurodegenerativním a kardiovaskulárním onemocněním W. E. Balch et al., Science 319, 916-919 (2008) 47
ribonukleasa A W. E. Balch et al., Science 319, 916-919 (2008) 48
W. E. Balch et al., Science 319, 916-919 (2008) 49
W. E. Balch et al., Science 319, 916-919 (2008) 50
W. E. Balch et al., Science 319, 916-919 (2008) 51
Malé molekuly, které se váží k nesprávně sbaleným proteinům a stabilizují je nebo zajišťují jejich správné sbalení Slouží například k léčbě lysozomálního onemocnění ze střádání familiární amyloidní polyneuropatie fenylketonurie a dalších onemocnění spojených se sbalováním proteinů 52
gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) mutace, která způsobuje špatné sbalení receptoru pro GnHR lze vyřešit působením farmakologického chaperonu jedná se o první úspěšnou aplikaci na myším modelu onemocnění J.A. Janovick et al. (2013): Restoration of testis function in hypogonadotropic hypogonadal mice harboring a misfolded GnRHR mutant by pharmacoperone drug therapy, PNAS, doi:10.1073/pnas.1315194110, 2013. 53
GnRH hraje klíčovou roli v řízení funkce reprodukčního systému Molekula GnRH má podobnou stavbu u všech zvířat Je to dekapeptid Působí primárně na předním laloku hypofýzy, kde stimuluje syntézu a sekreci gonadotropinů - FSH a LH Gonadotropin či gonadotropní hormon je jakýkoliv savčí hormon (obvykle glykoproteinové povahy), který stimuluje vývoj pohlavních orgánů (gonád). Obecně tyto hormony navozují v těle vývoj pohlavních buněk a stimulují produkci dalších pohlavních hormonů (steroidů). 54
Špatně sbalený GnRH receptor způsobuje ztrátu funkcí testes nebo ovarií. Samci myší s mutací mají malá testes, produkují málo zralých spermií a abnormální množství testosteronu. Jsou sterilní. Samice myší mají malá ovaria a neprodukují zralé folikuly, jsou sterilní. Farmakologický chaperon IN3 je antagonistou GnRH receptoru, umožňuje jeho správné sbalení receptor je pak transportován do plasmatické membrány a funguje normálně. 55
Mutantním myším (s hypogonádotropním hypogonádismem) byla látka IN3 aplikována katetrem do krkavice Aplikace po dobu 30 dnů, dávkování 6 hodin každé 3 dny Poté došlo k obnovení funkce a normální hmotnosti testes Napravil se tvar spermií a jejich dozrávání 56
Komplex ATP dependentních proteáz, který odbourává nesprávně sbalené proteiny, jež pronikly z ER do cytosolu aktivní místa centrální válec (degradace proteinu) regulační částice (zachycení proteinu) Proteázy na vnitřní straně válce štěpí na více místech, a proto degradují protein na malé peptidy 57
V závislosti na typu ubiquitinace získává modifikovaný protein specifickou funkci monoubiquitinace multiubiquitinace polyubiquitinace degradace regulace histonů endocytóza reparace DNA v proteozómu 58
složkou proteozómu jsou tzv. defoldázy rozbalují proteinový řetězec tak, aby mohl prostupovat skrz válcovitou strukturu proteozómu proces rozbalování proteinu vyžaduje energii ATP cílový protein s polyubiquitinovaným řetězcem centrální válec aktivní místa regulační částice 59
Proteolytické mechanismy odstraňují 1) Špatně sbalené proteiny nebo abnormální proteinové struktury 2) Normální proteiny, které již nejsou zapotřebí K proteolytickým mechanismům patří 1) Ubiquitinylace 2) Fosforylace 3) Acetylace 4) Disociace podjednotek 5) Štěpení a vytvoření nového degradovatelného konce 60
Řada dědičných onemocnění je vyvolána mutacemi, které mají za následek špatné sbalení proteinu, resp. vytvoření abnormální struktury srpkovitá anémie deficience α-1-antitrypsinu Poškozené kontrolní mechanismy umožňují vznik agregovaných struktur, které nejsou štěpeny proteázami Huntingtonova chorea, Alzheimerova nemoc Scrapie u ovcí Creutzfeld-Jakobova choroba BSE u dobytka 61
Součást procesu sbalování proteinů Cytoplasma Membrána Organela SYNTÉZA SBALOVÁNÍ J. Riemer et al., Science 324, 1284-1287 (2009) 62
Periplasma Bakterie Eukaryota ER Mechanismus oxidace v endoplasmatickém retikulu a mezi membránami mitochondrií je odlišný a nemá společný evoluční původ IMS J. Riemer et al., Science 324, 1284-1287 (2009) 63
J. Riemer et al., Science 324, 1284-1287 (2009) 64
65
Modifikace mění strukturu a biologickou aktivitu proteinů Některé procesy jsou kotranslační, jiné opravdu posttranslační Nejběžnější je glykosylace 66
Typ modifikace Glykosylace Karboxylace Hydroxylace Sulfatace Amidace Význam solubilitu, ovlivňuje biologický poločas nebo biologickou aktivitu Důležitá pro vazbu některých krevních proteinů k Ca 2+ Důležitá pro strukturální uspořádání Ovlivňuje biologickou aktivitu neuropeptidů a proteolytické úpravy polypeptidů Ovlivňuje biologickou aktivitu a stabilitu 67
připojení cukerného zbytku k polypeptidovému řetězci vyskytuje se hlavně u extracelulárních proteinů a proteinů vyskytujících se na povrchu buněk Glykosylací vznikají glykoproteiny U některých proteinů deglykosylace nemá vliv na biologickou aktivitu Deglykosylované formy lze připravit účinkem inhibitorů glykosylace, např. antibiotikem tunicamycinem v růstovém médiu nebo enzymatickou degradací glycidické části preformovaného glykoproteinu glykosidázou. 68
Sbalování proteinů Transport/zacílení proteinů Rozpoznání/vazba ligandů Biologická aktivita Stabilita Reguluje biologický poločas proteinu Imunogenicita 69
Vysoce glykosidovaný Odstranění glycidické části má za následek ztrátu biologické aktivity, ačkoli se hormon stále váže na svůj receptor, někdy dokonce s vyšší afinitou Jaká je funkce gonádotropního hormonu? 70
N-glykosylace glykosid připojen k proteinu přes atom dusíku na asparaginu manosa, galaktosa, glukosa, fukosa, N- acetylgalaktosamin, xylosa a kyselina sialová 71
O-glykosylace glykosid připojen k proteinu přes kyslík hydroxylových skupin, zpravidla serinu a threoninu manosa, galaktosa, glukosa, fukosa, N- acetylgalaktosamin, xylosa a kyselina sialová 72
N-glykosylace je sekvenčně specifická Mikroheterogenita glykosidovaných proteinů = přesné složení a struktura glykosidů se můžou u jednoho typu glykoproteinu mírně lišit (např. lidský interferon λ (M = 20 000 a 25 000) 73
74
omezený počet proteinů, které se podílejí na hemostáze γ-karboxylace = enzymatická konverze zbytků kyseliny glutamové za vzniku γ-karboxyglutamátu hydroxylace kyseliny asparagové za vzniku β-hydroxyaspartátu obě modifikace umožňují vazbu iontů vápníku, což zabezpečuje efektivní funkci krevních faktorů VII, IX a X a taky aktivaci proteinu C a proteinu S antikoagulačního systému
enzymatická konverze zbytků kyseliny glutamové za vzniku γ-karboxyglutamátu kyselina karboxyglutamová
při β-hydroxylaci dochází k hydroxylaci kyseliny asparagové za vzniku β-hydroxyaspartátu k. hydroxyasparagová hydroxyasparagin
Malý počet biofarmak je sulfatován nebo amidován Sulfatace je připojení skupiny SO 4 2- k cílovému polypeptidu v místě tyrozinu Sulfatace má význam pro interakce protein-protein, ztráta sulfatace snižuje aktivitu polypeptidu Terapeuticky významným proteinem, který je sulfatován, je antikoagulant hirudin a krevní faktory VIII a IX Chemokinový receptor CXCR3 (účastní se signalizace pro T buňky a NK) vyžaduje sulfataci tyrozinu, aby se k němu navázal ligand Rekombinantní proteiny zpravidla nejsou sulfatovány, ale vykazují ještě terapeutický účinek
Popište strukturními vzorci sulfataci tyrozinu v molekule hirudinu O - O S O
Náhrada karboxylové skupiny na C-konci polypeptidu aminoskupinou (COOH CONH 2 ) K této modifikaci dochází u krátkých peptidů Amidace je málo prozkoumaná, ale je nezbytná pro funkci výsledného produktu
Popište strukturními vzorci amidaci C-koncového prolinu na molekule lidského kalcitoninu NH 2
1) Vznik vyšších proteinových struktur 2) Nekovalentní vazby v polypeptidovém řetězci 3) Sbalování proteinů pomocí chaperonů 4) Vlastnosti a funkce vybraných chaperonů 5) Co je to proteostáza a jaká je její funkce 6) Terapeutické chaperony 7) Proteozóm 8) Další mechanismy úpravy proteinů 9) Tvorba disulfidických můstků 10) Posttranslační modifikace proteinů 83
Může v bakteriální buňce E. coli vznikat kvartérní struktura proteinů? 84
Popište vznik inzulínu v rámci posttranslačních úprav pre-proinzulínu, kolik disulfidických můstků obsahuje inzulín? 85
Jakou látkou lze in vitro provést tzv. redukční štěpení, tj. vytvoření dvou samostatných skupin SH namísto jednoho disulfidického můstku? 86
1) Uveďte příklad glykosylovaného proteinu a jeho funkci v buňce 2) Uveďte příklad fosforylovaného proteinu a jeho funkci v buňce 3) Uveďte příklad ubiquitinovaného proteinu a jeho funkci v buňce 87